材料和试剂
1.黑果蝇股票 - nanos -Gal4 [w 1118 ; P{w[+ mC ]=GAL4::VP16-nos.UTR}CG6325 MVD1 ， https : //flybase.org/reports/FBti0012410布卢明顿股票中心， # 4937, https://bdsc.indiana.edu/ (Larkin et al ., 2021)] 和UASp - m ito -PA-GFP ( m ito -PA-GFP) 在实验室中生成 (Chowdhary et al ., 2017 ）。 e mito -PA-GFP 果蝇含有一个转基因，该转基因具有来自与 PA-GFP 融合的人细胞色素氧化酶 VIII 的线粒体靶向序列。
2.胚胎收集笼（59-100，Flystuff.com）
3.培养皿（60 毫米，塔森斯，印度）
4.蔗糖（非分子生物学级，本地采购）
5.琼脂（非分子生物学级，本地购买）
6.次氯酸钠（漂白剂）（Sigma，目录号：1056142500）
7.细胞过滤器（Corning，目录号：CLS431751）
8.酵母（非分子生物学级，本地采购）
9.麦芽（非分子生物学级，本地采购）
10.玉米粉（非分子生物学级，本地采购）
11.丙酸（非分子生物学级，本地采购）
12.正磷酸（非分子生物学级，当地采购）
13.乙醇（非分子生物学级，本地购买）
14.NaCl （非分子生物学级，本地购买）
15.氯化钾（非分子生物学级，本地采购）
16.Na 2 HPO 4 （非分子生物学级，本地采购）
17.KH 2 PO 4 （非分子生物学级，本地购买）
18.2 个带腔盖玻片底部培养皿（Lab-Tek，带腔盖玻片，1 号，Thermo 155380）
19.00号画笔（印度卡姆林）
20.玉米粉琼脂小瓶中的果蝇培养基（见食谱）
21.蔗糖琼脂板（见食谱）
22.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（参见食谱）
注意：在果蝇卵子发生过程中，线粒体从护士细胞运输到卵母细胞。为了驱动UASp -Mito-PA-GFP 在果蝇卵巢中的表达，使用 nanos-Gal4，因此，标记的线粒体被遗传到胚胎中。 nanos-Gal4 可以被另一种组织特异性驱动器替代，用于在其他组织中表达标记的线粒体。

设备

1.25°C 培养箱，用于果蝇种群和杂交（松下）
2.立体显微镜（奥林巴斯 SZX10）
3.共聚焦显微镜（卡尔蔡司 LSM 780）
4.内置 LSM 780 显微镜的 Carl Zeiss 载物台培养箱

软件

1.ImageJ/Fiji - 生物格式插件 https://imagej.nih.gov/，https://imagej.net/software/fiji/ （辛德林_ _ 等人，2012；吕登等人，2017）
2.微软 Excel https://www.microsoft.com/en-in/microsoft-365/excel
3.GraphPad 棱镜https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

程序

A.苍蝇培养和胚胎制备
1.交叉nanos -Gal4 和mito -PA-GF P 苍蝇，并在含有酵母颗粒的标准玉米粉-琼脂果蝇培养基上将它们保持在 25°C （图 1A、1B-1 ）。
2.收集 F1 代nanos -Gal4 和mito -PA-GFP ( nanos Gal4/ mito -PA-GFP)含有雌性和雄性苍蝇，并将它们添加到含有 3% 蔗糖琼脂板并辅以酵母糊的胚胎收集笼中（图1 B -1）。丢弃前 30 分钟收集的鸡蛋，因为它们的年龄通常不同，并添加新鲜盘子。
3.在将新鲜收集板添加到笼子后，从nanos - Gal4/ mito -PA-GFP收集胚胎 1.5 小时。该集合将包含在合胞胚层阶段最大年龄为 1.5 小时的胚胎。 2.5 小时后收集胚胎进行成像细胞化。向胚胎收集板中加水。使用细刷轻轻地将胚胎从琼脂中取出，然后倒入细胞过滤器中。在细胞过滤器中用水清洗它们，直到所有酵母糊都被洗掉（图 1 B -2、3）。
4.将含有胚胎的细胞过滤器浸入含有 100% 漂白剂的稍大的盘子中 1 分钟，以去除胚胎绒毛膜。您可以用立体显微镜观察绒毛膜的损失（图 1 B -4）。
5.用水仔细清洗胚胎，以去除任何残留的漂白剂（图 1 B -5）。
6.使用立体光显微镜和刷子，将 dechorionated 胚胎放在 2 室盖玻璃盘上（图 1 B -6）。
7.小心地将 2 mL 的 PBS 添加到 2 室盖玻璃底室（图 1 B -6）。
8.油添加到 63 × /1.4NA 物镜中。我们使用蔡司 LSM780 共聚焦显微镜。将含有胚胎的盖玻片底室置于 25°C 的孵化器阶段，以进行光活化 (PA) 实验（图 1B-7）。
9.如进一步所述，Mito-PA-GFP 分别使用 405 nm 和 488 nm 激光进行光激活和成像（图 1C）。

笔记：
1.mito -PA-GFP 荧光在没有光活化的情况下微弱可见。弱荧光可用于破译转基因是否存在于所需组织中并正确靶向线粒体。
2.也可以使用抗 GFP 抗体进行免疫染色，以测试转基因在线粒体中的表达和分布。
3.选择最适合感兴趣组织的物镜放大倍率。
4.培养箱的温度取决于正在处理的组织。果蝇胚胎和组织的温度通常为 25 °C ，哺乳动物细胞的温度通常为 37 °C 。

图 1.在盖玻片底室上获取果蝇胚胎以进行光激活实验。
(A)果蝇交叉方案的表示。 (乙) 示意图显示了用于光活化的胚胎准备。雌性和雄性mito -PA-GFP 苍蝇在胚胎收集笼中孵育，其中包含补充有酵母糊的琼脂板 (1)。通过将水喷到酵母琼脂板上 (2, 3)，将放置在板上的胚胎收集在过滤器中。通过将过滤器浸入 100% 漂白剂中 1 分钟 (4) 来去除胚胎。在漂白剂中去除绒毛膜（最外层，在 2 中显示为黑线）。使用蒸馏水 (5) 彻底清洗 Dechorionated 胚胎。它们在 2 个腔室盖玻片盘 (6) 中对齐，并将 2 mL 的 PBS 添加到盘子 (6) 中。将培养皿置于倒置共聚焦显微镜 (7) 上的孵化室中，并使用油（金滴）浸没透镜 (7) 进行成像。 (三) 。使用 405 nm 激光 ( C 1)执行所需 ROI（红色）中的 PA ，并使用 488 nm 激光进行激发和包含 520 nm 的带通滤波器用于发射 ( C 2) 获取图像。 (D) Carl Zeiss Zen图像采集截图 software associated with Ze iss LSM confocal microscopes, showing an appropriate selection of settings for photoactivation (zoomed-in inset).

B.图像采集
1.果蝇合胞胚层胚胎中的质膜部分覆盖了顶端侧的细胞核（图 2A）。线粒体不对称分布，合胞胚层胚胎基底区域的强度增加（图 2A 和 2B）。线粒体存在于整个细胞核的光学切片中的细胞核周围（图 2B，5 μm ）。细胞化中的果蝇胚胎在早期阶段含有在基底侧富集的线粒体（图 3A 和 3B）。线粒体在早期细胞化的顶端部分强度较低，但在晚期阶段以较高强度存在（图 3B）。在后期，荧光的这种增加表明线粒体在细胞化过程中从基底区域移动到顶端部分。
2.×物镜在明亮的光线下观察胚胎，以辨别胚胎的阶段。胚胎的前端包含珠孔。寻找在后部可见极细胞的胚胎。合胞胚层阶段的胚胎在存在细胞核的顶端区域包含凸起。
3.功率的 488 nm 激发和 520 nm 带通滤光片发射时，线粒体和背景细胞质荧光是可见的。放大图像以获得512 × 512 像素的 2 ×放大倍率（ 2 ×光学变焦）（图 1A、7）并设置软件以获取每个像素平均为 2（2 平均）的图像。背景荧光可进一步用于定位将执行 PA 的合胞体区域（图 2C 和 2D）。
4.在软件中选择时间序列、光漂白和区域选项卡，从而可以设置延时成像和光漂白的参数（图 1D）。
5.使用合适的线条绘图工具选择感兴趣的区域(ROI) ，以标记需要光激活的区域。在图 2C中，ROI 用一条分段线绘制，并在顶端一侧的一个核质结构域中包含包含线粒体的区域。在图 3C 中， ROI 是使用单元格底部的矩形线工具绘制的。 ROI 大小覆盖了大约三个细胞的基底区域。
6.为 PA 标记区域后，选择 100% 功率的 405 nm 激光和 30 次 PA 迭代。
7.将软件设置为获取 3 个前 PA 图像和后 PA 图像，使用 488 nm 激发激光以 2% 功率在合胞分裂周期中以 1 分钟间隔 2 分钟，在细胞化实验中 40 分钟（图 2C 和 2D ，图 3C 和 3D，视频 1 和视频 2）。
8.开始实验并将电影文件保存到计算机。保存一张包含为 PA 绘制的 ROI 详细信息的图像，以进行进一步计算。

视频 1.果蝇合胞胚胎中的光活化实验，以确定相邻核质域之间线粒体易位的程度。
线粒体在红色区域被光激活，相邻的绿色区域被量化以获得荧光增益。影片以 16 色查找表显示，其中蓝色荧光最低，红色荧光最高。比例尺为 10 μ m 。

视频 2.果蝇胚胎细胞化的光活化实验，以评估线粒体从基底方向到顶端方向的易位。
线粒体在基底区域（红色区域）被光激活，并且随着时间的推移在顶端区域（绿色区域）监测荧光。影片以 16 色查找表显示，其中蓝色荧光最低，红色荧光最高。比例尺为 10 μ m 。

笔记：
1.用含有mito -PA-GFP 的胚胎进行光活化也可以在 dechorionated 胚胎中进行，这些胚胎是固定的胚胎，安装在带有盖玻片的载玻片上的抗褪色中。对这些固定胚胎的 PA 实验可以对任何感兴趣的组织中的光激活协议进行初步分析。固定胚胎中不应有荧光信号的移动。
2.如果正在研究快速发展过程，则 PA ROI 可能会在 PA 步骤期间移动，从而激活大于绘制的 ROI。
3.在这些实验的 60 分钟持续时间内，可以看到 PA-GFP 荧光强度的最小光漂白。对于进行超过 60 分钟的实验，光漂白的程度可能会增加。

果蝇胚胎中相邻合胞核质结构域分布的光活化实验。
（一种）左侧的 DIC图像显示了处于合胞胚层胚胎阶段的果蝇胚胎。极细胞在胚胎的后部可见。示意图显示了合胞胚层胚胎中的线粒体组织（绿点）。细胞核（浅蓝色）存在于外表面附近的皮质上，部分覆盖有顶端质膜（棕色）。 A，前，V 腹，D，背，P，后。右侧是合胞体果蝇胚胎中两个相邻核质结构域的矢状视图。中间的示意图显示了合胞胚层胚胎中胚胎外围的细胞核组织。线粒体在合胞体分裂周期（绿色）的基部富集（Chowdhary等，2017）。比例尺为50 μ m 。 (乙) 用mito -GFP标记的线粒体在用组蛋白-RFP 标记的细胞核底部富集。每个图像的深度从胚胎表面显示。比例尺为 5 μ m 。（C）示意图显示了光活化实验的策略。 405 nm 激光突出显示一个核质域（红色 ROI）中的线粒体，并在相邻域（绿色 ROI）中监测荧光变化。 (四) 含有mito -PA-GFP 的胚胎中红色区域的线粒体通过 405 nm 激光的光活化突出显示。通过用 488 nm 激光激发并在 520 nm 发射 2 分钟进行成像。显示了 PA 前、PA 后和 PA 后 105 秒的光学部分。 ImageJ 中的 16 色彩虹查找表（蓝色最低，红色最高）用于显示数据的快照。比例尺为 10 μ m 。

C.图像处理
1.使用 ImageJ 软件打开获取的原始图像。使用 Bio-Formats 插件 ( https://imagej.net/formats/bio-formats )将图像和相应的 roi 导入 ImageJ 。
2.将 Bio-Formats 插件显示的 PA ROI 添加到 ImageJ 中的 ROI 管理器中。在相邻的非 PA 区域中手动添加 ROI，以比较图 2 中实验中的 PA ROI，以监测相邻核质域之间的荧光转移。在图 3 的实验中在 PA ROI 上方的区域中绘制一个 ROI，以监测细胞化过程中荧光从细胞基底区域到顶端区域的转移。在整个成像领域绘制一个 ROI。将所有手动绘制的 ROI 添加到 ROI 管理器。
3.根据进行 PA 的细胞周期阶段，合胞体结构域可能由于胚胎发育而移动。在这种情况下，需要手动重新绘制 ROI 以估计所需区域的荧光。在横向方向或阶段漂移的细胞运动的情况下，在获得平均、最小和最大测量值之前调整 ROI。
4.对于图 2C 和 2D 中的实验，通过使用 ROI 管理器的“多测量”功能，获得所有 ROI 的平均和最小 (min) 荧光强度。或者，使用 ImageJ 中的“时间序列分析器”插件 ( https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ) 获取这些值。获取图 3 中细胞化实验的平均、最小值和背景荧光强度。从图 3C 和 3D 中的胚胎外区域获取背景荧光强度。

笔记：
1.如果 PA 区域由于组织内的移动或阶段漂移而远离原始位置，则需要手动绘制 ROI 以在后续时间范围内进行量化。
2.在实验的采集阶段可能会发生mito -PA-GFP 荧光的光漂白。为了估计光漂白的程度，光激活整个成像场并在整个实验期间对其进行成像，以估计 PA-mito-GFP 荧光随时间的变化。

图 3. 确定果蝇胚胎细胞化过程中线粒体从基底区域到顶端区域的运动的光活化实验。
(A)左侧的 DIC 图像显示了细胞化阶段的果蝇胚胎。注意图像中存在透明的皮质区域。中间的示意图显示了细胞化结束时胚胎外围的细胞组织。在细胞化结束时，皮质上存在的细胞核（示意图中的浅蓝色）完全被质膜覆盖（棕色）。 A，前，V 腹，D，背，P，后。右侧是细胞化中两个相邻核质结构域的矢状视图。线粒体在早期（绿色）的基部和晚期的顶端区域富集（Chowdhary等，2020）。比例尺为50 μ m 。 (乙) 在细胞化的早期阶段，用mito -GFP标记的线粒体在用组蛋白-RFP 标记的细胞核底部富集。在细胞化过程中， mito -GFP的顶端强度增加。它被视为晚期顶端部分的 GFP 荧光增加。每个图像的深度从胚胎表面显示。比例尺为5 μ m 。（C）示意图显示了光活化实验的策略。基底区域（红色 ROI）中的线粒体在 405 nm 激光的光活化上突出显示，并在顶端区域（绿色 ROI）监测荧光变化。如果发生移动，顶端区域的荧光会增加。 (D) 含有mito -PA-GFP 的胚胎中红色区域的线粒体通过 405 nm 激光的光活化突出显示，通过 488 nm 激光激发和 520 nm 发射 30 分钟进行成像。显示了激活前、激活后和激活后 30 分钟的光学部分。橙色 ROI 用于计算背景荧光。 ImageJ 中的 16 色彩虹查找表（蓝色最低，红色最高）用于显示数据的快照。比例尺为 10 μ m 。

数据分析

1.将从 ImageJ 获得的荧光强度值导出到 Microsoft Excel（图 4A、5A）。
2.使用以下公式将荧光值标准化以在 0–1 范围内表达数据：F t -F b /F 0 -F b ，其中 F t是给定时间点的给定 PA ROI 的平均荧光强度，F b或从 F t中减去背景荧光（图 2D 中的实验使用整个成像场的最小强度值作为 F b ，图 3D 中的实验使用背景强度值作为 F b ），和F 0是 PA 后第一个时间点 ROI 的平均荧光强度。如果在实验中获得了三个预 PA 部分，则取这三个部分的强度平均值来计算预 PA 时间点（图 4、5）。
3.图4 和图 5中的非 PA ROI 执行相同的标准化。
4.在 Excel 或 GraphPad Prism 中绘制多个实验（至少三到五个实验在同一阶段）的归一化数据，以获得相似的 ROI 作为平均值 ± SEM（图 4B、5B）。

图 4. 合胞分裂的相邻核质结构域中的线粒体荧光图。
（一种） Excel 表显示了图 2C、D 所示实验中光激活 ROI 和相邻 ROI 中荧光强度的计算和荧光计算。使用 ImageJ 获得来自光激活 ROI F t的平均荧光，以及来自属于相邻核质结构域的非活化区域。胚胎中的最小荧光是从整个视野（分钟）中获得的。 photoactivation 后的第一个时间点标记为 F 0 （黄色突出显示的行）。使用以下公式进行 0-1 尺度的归一化：F t -F b /F 0 -F b 。 (乙) (A) 中的估计值是在多个胚胎中获得的，并且为 PA-ROI（红色）和相邻的 ROI（绿色）绘制了平均值 ± SEM。 n = 3 个胚胎。

图 5. 细胞化过程中线粒体在apico -basal轴上的分布图果蝇胚胎。
（一种）在图 3C、D 所示的实验中，计算荧光强度和计算基底区域和顶端 ROI 中的光激活 ROI 中的荧光。使用 ImageJ 获得来自 PA-ROI F t的平均荧光，以及来自光激活 ROI 上方的顶端区域。背景是从图 3 中所示的胚胎外部的 ROI 获得的。背景强度从荧光强度中减去以进行校正 (F = F t -F b )。 photoactivation 后的第一个时间点标记为 F 0 （黄色突出显示的行）。使用以下公式在 0-1 范围内进行标准化：F t -F b /F 0 -F b 。 (乙) (A) 中的估计值是在多个胚胎中获得的，并且为基底区域的 PA-ROI（红色）和顶端 ROI（绿色）绘制了平均值 ± SEM。 n = 3 个胚胎。

食谱

1.PBS (10 × ) (1,000 毫升)
NaCl：1.37 M（配方重量（ FW）177.99）
KCl : 27 毫米 (FW 136.09 )
Na 2 HPO 4 : 100 毫米 (FW 58.44)
KH 2 PO 4 : 18 毫米 (FW 74.55)
要制作 10 × PBS 库存，将 17.8 g NaCl、2.4 g KCl 、80 g Na 2 HPO 4和 2 g KH 2 PO 4添加到烧杯中，并完成高达 900 mL 的体积。 10 ×溶液的 pH 值应为 6.8，因此如果需要，可以添加 HCl 或 NaOH 来调节 pH 值。调整 pH 后将体积补至 1,000 mL。
注意：可制备10 × PBS 并在 4°C 下储存。 1 × PBS 是通过稀释 10 × PBS 储备溶液新鲜制备的。
2.飞媒体（1 升）
琼脂：10克
酵母：15克
麦芽：30克
玉米粉：75克
糖：80克
水：900 毫升
丙酸：5毫升
正磷酸：1毫升
乙醇：5毫升
5% 对羟基苯甲酸甲酯（乙醇溶液）：0.25 g 在 5 mL 乙醇溶液中
3.用于胚胎采集的蔗糖琼脂
蔗糖：3%
琼脂：2.5%
将成分加入蒸馏水中，在微波炉中煮沸，直到琼脂溶解。将培养基倒入培养皿中。在室温下固化和冷却后，盖上盖子并储存在 4°C 下。

致谢

我们感谢 IISER，浦那果蝇设施帮助维护苍蝇种群。我们有 IISER，浦那显微镜设备，可用于显微镜方法的帮助。本研究使用从布卢明顿果蝇库存中心 (NIH P40OD018537) 获得的库存。我们感谢印度浦那的 IISER、印度生物技术部和印度科学技术部为本项目提供资金。 SC 感谢印度大学资助委员会的研究生奖学金。该协议是作为已发表文章的一部分开发的： Chowdhary, S.、Madan, S.、Tomer, D.、Mavrakis, M. 和Rikhy , R. (2020)。线粒体形态和活性调节果蝇细胞化中的沟进入和收缩环动力学。 Mol Biol Cell 31(21): 2331-2347 ( doi : 10.1091/ mbc.E 20-03-0177) 。
利益争夺

作者声明没有竞争利益

参考

1.Chowdhary, S.、Madan, S.、Tomer, D.、Mavrakis, M. 和Rikhy , R. (2020)。线粒体形态和活性调节果蝇细胞化中的沟进入和收缩环动力学。分子生物学细胞31（21）：2331-2347。
2.Chowdhary, S.、Tomer, D.、 Dubal , D.、Sambre, D. 和Rikhy , R. (2017)。果蝇胚盘胚胎线粒体组织和功能分析。科学代表7（1）：5502。
3.考克斯，RT 和Spradling ，AC（2003 年）。 Balbiani 体和融合体在果蝇卵子发生过程中介导线粒体遗传。发展130(8)：1579-1590。
4.Denisenko, TV, Gorbunova , AS 和Zhivotovsky , B. (2019)。线粒体参与迁移、侵袭和转移。前细胞开发生物学7：355。
5.Foe, VE 和 Alberts, BM (1983)。在果蝇胚胎发生中原肠胚形成之前的五个有丝分裂周期中的核和细胞质行为的研究。细胞科学杂志 61：31-70。
6.Frescas, D.、Mavrakis, M.、Lorenz, H.、 Delotto , R. 和 Lippincott-Schwartz, J. (2006)。果蝇合胞胚层胚胎中的分泌膜系统以功能分区单元的形式存在于单个细胞核周围。细胞生物学杂志 173（2）：219-230。
7.Larkin, A., Marygold , SJ, Antonazzo , G., Attrill, H., Dos Santos, G., Garapati , PV, Goodman, JL, Gramates , LS, Millburn, G., Strelets, VB等。（2021 年）。 FlyBase：果蝇的更新黑腹果蝇知识库。核酸研究49(D1)：D899-D907。
8.Lieber, T., Jeedigunta , SP, Palozzi , JM, Lehmann, R. 和 Hurd, TR (2019)。线粒体片段化驱动生殖系中有害 mtDNA 的选择性去除。自然570（7761）：380-384。
9.帕特森，GH（2011）。光学荧光笔荧光蛋白的亮点。 J Microsc 243（1）：1-7。
10.Patterson, GH 和 Lippincott-Schwartz, J. (2002)。一种用于选择性光标记蛋白质和细胞的光激活 GFP。科学297（5588）：1873-1877。
11.Rueden , CT, Schindelin , J., Hiner , MC, DeZonia , BE, Walter, AE, Arena, ET 和Eliceiri , KW (2017)。 ImageJ2：用于下一代科学图像数据的 ImageJ。 BMC 生物信息学18（1）：529。
12.Schindelin , J., Arganda -Carreras, I., Frise, E., Kaynig , V., Longair , M., Pietzsch , T., Preibisch , S., Rueden , C., Saalfeld, S., Schmid, B .，等人。（2012）。斐济：一个用于生物图像分析的开源平台。 Nat 方法9（7）：676-682。