材料和试剂
1. 1.5 mL 安全锁管（Sigma-Aldrich，目录号：0030 120.086）
2. 培养皿（TH. Geyer， Labsolute ，目录号：7696405）
3. 14 mL培养管（Fisher Scientific，Greiner Bio-One，目录号：07-000-212）
4. PCR管（ Sarstedt Inc.，0.2 mL PCR tube multiply μstrip 8中性PCR perf，目录号：72.985.002）
5. 接种环（ Deltalab SL，10 μL ，目录号：302704）
6. 比色皿（ BrandTech Scientific Inc.，目录号：7590 15）
7. Whatman 纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA10300045）
8. 复制块（Sigma-Aldrich，目录号：Z363391-1EA）
9. 50 mL 注射器（VWR，目录号：89215-240）
10. 0.2 μm一次性过滤单元（TH. Greyer， Labsolute ，目录号：7699822）
11. 酵母（CEN.PK2-1C，EUROSCARF）（见表 1）
12. 乙酸锂（Sigma-Aldrich，目录号：517992）
13. PEG 3350（Sigma-Aldrich，目录号：1546547）
14. ssDNA（Sigma-Aldrich，来自鲑鱼睾丸的单链脱氧核糖核酸，目录号：D9156）
15. 醋酸钠，3 M，pH 5.2（Merck Millipore，目录号：567422）
16. 100％乙醇（VWR，目录号：20821.310）
17. 70％乙醇（VWR，目录号：83801.360）
18. NucleoSpin凝胶和 PCR 清洁试剂盒（ Macherey -Nagel，目录号：740609.50）
19. 不含亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的酵母合成辍学培养基补充剂（Sigma-Aldrich，目录号：Y1771）
20. 不含组氨酸的酵母合成辍学培养基补充剂（Sigma-Aldrich，目录号：Y1751）
21. 不含亮氨酸的酵母合成辍学培养基补充剂（Sigma-Aldrich，目录号：Y1376）
22. YPD Broth（ ThermoFisher Scientific，目录号：A1374501）
23. D-（+）-半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G0625）
24. D-（+）-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
25. 不含氨基酸的酵母氮碱基（Sigma-Aldrich，目录号：Y0626）
26. 不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱（Sigma-Aldrich，目录号：Y1251）
27. L-谷氨酸一钠盐一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：49621）
28. 琼脂（Merck Millipore，目录号：05040）
29. 诺尔丝菌素（Jena Bioscience，目录号：AB-102XL）
30. GeneRuler 1 kb DNA 梯（Thermo Scientific，目录号：SM0311）
31. 琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A4718）
32. RedSafe （ iNtRON Biotechnology，目录号：21141）
33. DNA凝胶上样染料6 × （Thermo Scientific，目录号：R0611）
34. OneTaq 2 × Master Mix 与标准缓冲液（New England BioLabs ，目录号：M0482S ）
35. 寡核苷酸 (IDT)（见表 3）
36. 质粒（见表 2）
37. 快速文摘不是我（ ThermoFisher Scientific，目录号：FD0593）
38. FastDigest缓冲液（ ThermoFisher Scientific，目录号：B64）
39. TAE缓冲液（Tris-Acetate-EDTA）50 × （ ThermoFisher Scientific，目录号：B49）
40. 200 mg/mL 诺尔丝菌素溶液（见配方）
41. 合成完全辍学媒体（见食谱）
42. 20% (w/v) 葡萄糖和半乳糖溶液（见配方）

表 1. 酵母菌株。
拉紧基因型质粒父母压力参考
CEN.PK2-1C MATa ura3-52 his3Δ1 leu2-3_112 trp1-289 MAL2-8c SUC2 不适用不适用欧洲围巾
Sc35 MATa ura3-52 his3Δ1 leu2-3_112 trp1-289 MAL2-8c SUC2 pEDJ391 CEN.PK2-1C 詹森等人，2021
Sc36 MATa ura3-52 his3∆1 leu2-3_112 trp1-289 MAL2-8c SUC2 rnh1∆ rnh201∆ 不适用 CEN.PK2-1C 詹森等人，2021
sc43 MATa ura3-52 leu2-3_112 trp1-289 MAL2-8c SUC2 rnh1∆ rnh201∆ his3∆ pEDJ391 sc40 詹森等人，2021
sc138 MATa ura3-52 leu2-3_112 trp1-289 MAL2-8c SUC2 rnh1∆ rnh201∆ his3∆ HIS3_23∆29-XII-5 不适用 sc43 詹森等人，2021
Sc146 MATa ura3-52 leu2-3_112 trp1-289 MAL2-8c SUC2 rnh1∆ rnh201∆ his3∆ HIS3_23∆29-XII-5 pEDJ333; pMLB10； pEDJ508 sc138 詹森等人，2021
Sc147 MATa ura3-52 leu2-3_112 trp1-289 MAL2-8c SUC2 rnh1∆ rnh201∆ his3∆ HIS3_23∆29-XII-5 pEDJ333; pMLB10； pEDJ400 Sc138 詹森等人，2021

表 2. 质粒。
质粒内容遗传标记抗生素标志物复制的起源添加基因ID
pEDJ8 SNR52 p:sgRNA _RNH1Δ:SUP4t_SNR52:sgRNA_RNH201Δ:SUP4t URA3 氨苄青霉素 2μ 177271
pEDJ332 SNR52 p:sgRNA_HIS3 - KO :SUP4t 诺尔丝菌素耐药氨苄青霉素 2μ 不适用
pEDJ333 GAL1 p:Cas9:CYC1 t LEU2 氨苄青霉素中心/ARS 177272
pEDJ391 TEF1 p:Cas9:CYC1 t LEU2 氨苄青霉素中心/ARS 不适用
pEDJ400 USER克隆站点 URA3 氨苄青霉素 2μ 177269
pEDJ437 USER克隆站点 HIS3 氨苄青霉素 2μ 177270
pEDJ506 ADH1 t:HIS 3_23Δ29-XII-5:<-PGK1p 不适用（无标记）氨苄青霉素 2μ 177274
pEDJ508 ADH1 t:T 7p:cgRNA_HIS3_stop:tZ URA3 氨苄青霉素 2μ 177275
pMLB10 GAL1 p:T 7RNAP(F11L;T613A):CYC1t TRP1 氨苄青霉素 2μ 177273
pCfB3050 SNR52 p:sgRNA _XII-5:SUP4t 诺尔丝菌素耐药氨苄青霉素 2μ 73292

表 3. 寡核苷酸。
寡核苷酸顺序
F_RNH1_KO CCTACTGTATTGTACTTGAAACAGG
R_RNH1_KO GCCACTCCGAAGGTTTGAAAAGTCG
F_RNH201_KO GTACCCCCCACGGTAGAAGCATC
R_RNH201_KO CAATTATCTAGGGTTCTCAGC
F_HIS3_KO ACTCTTGGCCTCCTCTAGTACAC
R_HIS3_KO CATGTATATATCGTATGCTGCAG
F_Seq CAAGTTCTTAGATGCTTTC
R_Seq CTACATAAGAACACCTTTGGTG
RNH1_90-mer AAAGTGTCACTCCTTGCTTATCGAAGGAACTATCGATTCCTAATTTGCTGTTTTTTGCTTGGCTTCTTACTGGACCTGTTGTACCTGTAA
RNH201_90-mer AAAAACCTTGAAAACAACTACTGCACACCAAATTGATACGATTAATCACCTCCAGTTTGCACATACTATATATCTTCATGTAATACTACA
HIS3_90-mer AAGAATATACTAAAAAATGAGCAGGCAAGATAAACGAAGGCAAAGTGACACCGATTATTTAAAGCTGCAGCATACGATATATATACATGT

设备

1. -80°C冰箱（Thermo Scientific，Forma 88000系列，目录号：88-500A）
2. 30°C 振荡培养箱（Thermo Scientific， MaxQ 8000，型号：SHKE8000）
3. 固定式培养箱（Thermo Scientific， Heratherm ，目录号：51028112）
4. 安全柜（Thermo Scientific，Safe 2020，目录号：51026637）
5. 高压灭菌器 ( CertoClav , CertoClav 多控制，目录号： 8502312A ）
6. 离心机（Thermo Scientific， Multifuge X1 Centrifuge，目录号：75004211）
7. 台式离心机（VWR，Micro Star 17，目录号：521-1646）
8. 冷冻离心机（VWR，Micro Star 17R，目录号：521-1647）
9. 分光光度计（IMPLEN，型号： NanoPhotometer P300）
10. Thermomixer（VWR，型号 Thermomixer 舒适度）
11. Vortexer （科学工业，型号：Vortex-Genie 2）
12. 水净化系统（VWR，PURELAB flex 2，目录号：89204-092）
13. Molecular Imager Gel Doc（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708195）
14. DNA电泳室（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704487EDU）
15. 固定高度梳（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704465EDU）
16. Sub-Cell GT UV-透明迷你凝胶托盘（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704435EDU）
17. 迷你凝胶施法者（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704422EDU）
18. PowerPac基本电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：1645050）
19. 热循环仪（Bio-Rad Laboratories，S1000，目录号：1852148）

程序

cgRNA - DNA 修复的质粒构建、菌株工程和功能增益分析。该方法的目的是将cgRNA递送质粒 (pEDJ508)上人工工程 STOP 密码子中的随机功能增益突变赋予pEDJ506 整合质粒 (PGK1pro - HIS3_23Δ29 - XII-5- ADH1t ) 中功能失调的异位his3盒) .菌株必须是 RNase H 敲除突变体，系统才能发挥作用。成功的 CRAIDE 突变体在系统诱导后在选择性辍学板上进行功能筛选（图 1）。

A. CRAIDE 靶序列和质粒设计
pEDJ506 质粒包含一个染色体 XII 的整合盒，其中 PGK1pro - HIS3_23Δ29 - XII-5- ADH1t 反向。在这里，天然HIS3序列被 29 bp 缺失和插入 23 个碱基（包括 gRNA 种子序列和 protospacer 相邻基序 (PAM)）破坏。 HIS3_23Δ29 -XII-5序列如下所示，Δ29 用橙色表示，PAM 用蓝色表示，gRNA 种子序列用粗体表示，起始密码子 (ATG) 用绿色表示：

CTACATAAGAACACCTTTGGTGGAGGGAACATCGTTGGTACCATTGGGCGAGGTGGCTTCTCTTATGGCAACCGCAAGAGCCTTGAACGCACTCTCACTACGGTGATGATCATTCTTGCCTCGCAGACAATCAACGTGGAGGGTAATTCTGCTAGCCTCTGCAAAGCTTTCAAGAAAATGCGGGATCATCTCGCAAGAGAGATCTCCTACTTTCTCCCTTTGCAAACCAAGTTCGACAACTGCGTACGGCCTGTTCGAAAGATCTACCACCGCTCTGGAAAGTGCCTCATCCAAAGGCGCAAATCCTGATCCAAACCTTTTTACTCCACGCACGGCCCCTAGGGCCTCTTTAAAAGCTTGACCGAGAGCAATCCCGCAGTCTTCAGTGGTGTGATGGTCGTCTATGTGTAAGTCACCAATGCACTC-Δ29-CCG TCGAGGAATTTTTACTAACA CCAGAGCATGTATCATATGGTCCAGAAACCCTATACCTGTGTGGACGTTAATCACTTGCGATTGTGTGGCCTGTTCTGCTACTGCTTCTGCCTCTTTTTCTGGGAAGATCGAGTGCTCTATCGCTAGGGGACCACCCTTTAAAGAGATCGCAATCTGAATCTTGGTTTCATTTGTAATACGCTTTACTAGGGCTTTCTGCTCTGT CAT

pEDJ508 质粒经过工程改造以表达his3 ，带有一个工程化的 STOP 密码子（在 pEDJ506 缺失的 Δ29 内）和一个移码人工内含子 (AI)。该his3序列与 gRNA 融合以制造嵌合 gRNA ( cgRNA )，用于靶向基因组中 pEDJ506 的HIS3_23Δ29-XII-5序列。容易出错的 T7 RNA 聚合酶转录从其中拼接出 AI的cgRNA ，以提供his3的完整开放阅读框，仍然保持 STOP 密码子，包括 pEDJ506 中缺失的 Δ29，但不包括其中的 23 bp 插入质粒（这种去除也终止了HIS3_23Δ29-XII-5中的 Cas9 靶向）。 STOP 密码子经过引入易错 T7 RNA 聚合酶的随机诱变，以产生可从cgRNA -DNA双链断裂修复引入HIS3_23Δ29-XII-5的许可突变。 pEDJ508 中的完整表达盒如下所示，所有组件均描绘：绝缘子（ADH1 终止子-灰色）、T7 启动子（粉红色）、停止密码子（红色）、AI（黄色）、gRNA 种子序列（粗体）、gRNA 结构序列（紫色）和 T7 终止子（青色）。此设计中省略了起始密码子 (ATG)。
注意：可以选择目标基因/序列的任何部分进行诱变，但同源臂应尽可能长，并且在与cgRNA种子序列匹配的 Cas9 结合位点的任一侧至少 200 bp。同源序列必须包含破坏 Cas9 靶向的突变，以保护质粒，然后保护工程目标基因/序列。使用 pEDJ508，将 29 bp 重新引入目标序列，其中人工设计了一个终止密码子。这种设计确保只有进化的 cgRNA可用于模板同源定向修复目标基因并恢复其功能 (HIS3)。

CGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTATTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCGTTAATTAAGAGCTCGAATGC agggaacaaaagctggagct TAATACGACTCACTATAGGGAGA CTACATAAGAACACCTTTGGTGGAGGGAACATCGTTGGTACCATTGGGCGAGGTGGCTTCTCTTATGGCAACCGCAAGAGCCTTGAACGCACTCTCACTACGGTGATGATCATTCTTGCCTCGCAGACAATCAACGTGGAGGGTAATTCTGCTAGCCTCTGCAAAGCTTTCAAGAAAATGCGGGATCATCTCGCAAGAGAGATCTCCTACTTTCTCCCTTTGCAAACCAAGTTCGACAACTGCGTACGGCCTGTTCGAAAGATCTACCACCGCTCTGGAAAGTGCCTCATCCAAAGGCGCAAATCCTGATCCAAACCTTTTTACTCCACGCACGGCCCCTAGGGCCTCTTTAAAAGCTTGACCGAGAGCAATCCCGCAGTCTTCAGTGGTGTGATGGTCGTCTATGTGTAAGTCACCAATGCACTCAACGATTAGCGACCAGCCGGAATG CTA GG GTATGTTAATATGGACTAAAGGAGGCTTTTCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTTTTACTAACAAATGGTATTATTTATAACAG CCAGAGCATGTATCATATGGTCCAGAAACCCTATACCTGTGTGGACGTTAATCACTTGCGATTGTGTGGCCTGTTCTGCTACTGCTTCTGCCTCTTTTTCTGGGAAGATCGAGTGCTCTATCGCTAGGGGACCACCCTTTAAAGAGATCGCAATCTGAATCTTGGTTTCA TTTGTAATACGCTTTACTAGGGCTTTCTGCTCTGT TGTTAGTAAAAATTCCTCGA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGTGC CCTAGCATAACCCCGCGGGGCCTCTTCGGGGGTCTCGCGGGGTTTTTTGCTGAAAGAAGCTTCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGCTGCGGCCGCACTCGAGCTCGACCTCGACCTCCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAG

图 1. CRAIDE 流程图，参考正文，说明 B. 基线菌株设计，C. CRAIDE 质粒的转化，以及 D. 系统诱导和功能获得。
面板 B 显示了单独的步骤 1-5，产生的菌株显示在面板 B 和 C 的括号中。面板 C 中描述了每个质粒的质粒表达盒，其中 T7RNAP* 指的是 T7RNAP(F11 L;T 613A) 变体.质粒 pEDJ333 和 pMLB10 可被半乳糖诱导，pEDJ508 由 T7RNAP(F11 L;T 613A) 转录，用于将随机突变引入所得 cgRNA_HIS3_stop 转录物。 cgRNA_HIS3_stop 不转化为功能性蛋白质，并且内置终止密码子的诱变对于功能性修复位于 Sc138 基因组中的 Cas9 靶向HIS3_23Δ29-XII-5表达盒是必要的。面板 D 突出显示了液体培养物中的相关条件（用小瓶表示），用于在表达 cgRNA_HIS3_stop (Sc146) 或空对照质粒 (Sc147) 的菌株中诱导48 小时后诱导 CRAIDE 和基于板的HIS3功能获得突变体评分.

B. 基线应变设计
1. 用于应变工程的 Cas9 转化
目录菌株 CEN.PK2-1C的单个菌落在 14 mL 培养管中的 0.5 mL YPD 中以 250 rpm 和 30°C 生长过夜，并在新鲜 YPD 中稀释 10 倍第二天早上。在相同条件下孵育 4 小时后，将 100 μL培养物转移到 1.5 mL Eppendorf 管中并以 13,000 ×沉淀 g室温下离心 30 s。通过移液去除上清液。向细胞沉淀中加入 1 μg组成型表达 Cas9 并以LEU2为标志物的着丝粒质粒 (pEDJ391)、10 μL ssDNA（煮沸 5 分钟）、36 μL醋酸锂(1 M)、 74 μL MilliQ水减去添加的质粒体积，和 240 μL PEG 3350 (50%)。通过上下吹打重悬转化混合物中的颗粒，然后涡旋几秒钟，直到出现均匀的悬浮液。将转化混合物在 42°C 下孵育 40 分钟，然后以 13,000 ×离心 g 30 秒，然后通过移液器去除上清液。将颗粒重新悬浮在 100 μL的MilliQ水中，并在不含 L-亮氨酸 (SC-L) 的合成完全辍学培养基上用玻璃珠将其电镀。在安全柜中干燥带盖的板，然后在固定的 30°C 培养箱中培养 2 天，以获得菌株 Sc35。
2. RNase H 缺失
在 14 mL 培养管中的 0.5 mL SC-L 中接种单个菌株 Sc35 菌落，并在 250 rpm 和 30°C 下孵育过夜。第二天早上，将 4.5 mL 的新鲜 SC-L 添加到过夜培养中，并在转化前再孵育 4 小时。像以前一样进行转化，但这次用两个双链 90 聚体寡核苷酸中的每一个 1 nmol 靶向RNH1和RNH201用于敲除（45 个碱基同源性紧邻开放阅读框的上游和下游）和 1 μg gRNA 质粒 pEDJ8（2 × gRNA 质粒靶向RNH1和RNH201 ，带有URA3选择标记）。将转化后的颗粒铺在 SC-LU 上并在 30°C 下孵育 3 天，以获得菌株 Sc36。在得到的菌落中，在基因缺失后用 500-1,000 个碱基间隔的寡核苷酸的菌落 PCR ( cPCR ) 验证了RNH1和RNH201的敲除。通过用牙签挑选 12 个不同的菌落并将每个菌落重新悬浮在两个 PCR 管中进行 cPCR，一个用于测试rnh1 ，一个用于rnh201 ，每次敲除时使用8 μL MilliQ水和 1 μL每种引物。在热循环仪中将悬浮液在 98°C 下加热 15 分钟，然后在每管中加入 10 μL OneTaq 2 × MM至最终体积为 20 μL 。将反应返回热循环仪并运行以下程序：
98°C 30 秒
40 × （98°C 30 秒；50°C 20 秒；68°C 1 分钟/kb）
永远10°C
在 1% 琼脂糖凝胶上加载最终反应。通过加热将 4 g 琼脂糖溶解在 400 mL 的 1 × TAE 缓冲液中制成凝胶，然后浇铸在20 μL的 Sub-Cell GT UV-Transparent Mini-Gel 托盘中迷你凝胶脚轮中的RedSafe和固定高度梳子。在 DNA 电泳室中，用 10 μL的GeneRuler 1 kb DNA 梯在 90 V 下运行加载的凝胶30 分钟。电源由PowerPac基本电源提供，凝胶成像由 Molecular Imager Gel Doc 完成。
注意：使用这种方法的双敲除并不常见，顺序敲除 RNH1 和 RNH201 可用作替代策略。另请注意，与野生型相比，rnh1 rnh201 双敲除菌株需要大约 50% 的孵育时间。
3. HIS3缺失
为了完全去除天然HIS3 的开放阅读框，为了避免下游分析期间的遗传交叉，与以前一样，准备了来自菌株Sc36的单个菌落用于在 SC-L 中的转化。用 1 nmol 的双链 90 聚体寡核苷酸转化 1 μg的 gRNA 质粒 pEDJ332（含有诺尔丝菌素抗性标记），设计如前所述，用于敲除HIS3 。在 42°C 热休克后，将沉淀重悬于 500 μL YPD 中，并在 800 rpm 和 30°C 下孵育 2 小时。以 13,000 ×离心培养物 g 30 秒，弃去上清液，将沉淀重悬于 100 μL无菌MilliQ水中，然后将其置于含有诺尔丝菌素的 SC-L 上。在 30°C 下 3 天后，通过cPCR筛选产生的菌落，以验证HIS3开放阅读框的去除，从而产生菌株 Sc43。
4. 应变固化（质粒去除）
在进行下一个工程步骤之前，Sc43 菌株必须针对除 pEDJ391 以外的所有其他质粒进行处理，其中包含 Cas9。在 1 mL SC-L 中接种单个菌株 Sc43 菌落，并在 250 rpm 和 30°C 下孵育过夜。在 990 μL的无菌MiiliQ水中稀释 10 μL的过夜培养物，然后再将10 μL稀释到 990 μL的无菌MiiliQ水中。再次重复此稀释策略，从 SC-L 上的所有稀释液中接种 100 μL ，并在 30°C 下孵育 3 天。从每个板上，执行三个复制板到选择性板： SC+nourseot hricin 、SC-U 和 SC-H。复制电镀是使用 Whatman 纸在复制块上实现的。在所有板在 30°C 下再次孵育过夜后，从原始板中挑选三个复制板上未生长的单个菌落。
5. 功能失调的his3设计集成 ( HIS3_23Δ29-XII-5 )
将固化的 Sc43 接种在 0.5 mL 的 SC-L 中，并在 250 rpm 和 30°C 下过夜生长。像以前一样准备转化菌株。同时，线性化包含HIS3_23Δ29-XII-5 的 pEDJ506 ，通过使用Not I进行限制性消化，将 3 μg pEDJ506、2 μL FastDigest缓冲液、2 μL Not I ( 20 U) 和MiiliQ水混合至总体积为 20 μL 。在使用NucleoSpin Gel 和 PCR Clean-up 试剂盒进行柱纯化之前，将消化物在固定培养箱中于 37°C 孵育4 小时。将 130 μL的 NTI 缓冲液添加到摘要中，并将其转移到自旋柱。在 13,000 ×离心后丢弃流出液 g 30 秒。在离心柱中加入 700 μL NT3 缓冲液并重复离心。丢弃流出液并以 13,000 ×离心离心柱 g 1 分钟以干燥膜。向离心柱中加入 60 μL无菌MiiliQ水，将其转移到无菌 1.5 mL Eppendorf 管中，并以 13,000 ×离心 g 30 秒。使用与以前相同的协议，将整个洗脱液与 1 μg的 gRNA 质粒 pCfB3050 进行共转化，其中包含诺尔丝菌素抗性标记。将转化后的颗粒重悬于 500 μL YPD 中，并在 800 rpm 和 30°C 下孵育 2 小时。以 13,000 ×离心培养物 g 30 s，弃上清，将沉淀重悬于 100 μL无菌MiiliQ水中，然后将其铺板在含有诺尔丝菌素的 SC-L 上。在 30°C 孵育 3 天后筛选产生的转化体，以便通过cPCR进行整合，从而产生菌株 Sc138。基本上像以前一样治疗 Sc138，但在 YPD 而不是 SC-L 中预生长，以在继续引入 CRAIDE 质粒之前完全消除所有质粒。

C. 将 CRAIDE 质粒转化为工程酵母
1. 在 0.5 mL 的 YPD 中接种 Sc138 治愈菌株，并像以前一样准备转化。随后，用易错 T7 RNA 聚合酶转化 1.5 μg质粒 pEDJ 333 (GAL1p-Cas9-CYC1t, LEU2 ) 和 1.5 μg质粒 pMLB10 (GAL1p-T7RNAP(F11 L;T 613A)-CYC1t, TRP1 ) ，像之前一样。在 30°C在 SC-LW 上 3 天后，将单个转化体接种到 0.5 mL 的 SC-LW 中，并像以前一样准备转化。转化 1.5 μg pEDJ508（cgRNA_HIS3_stop， URA3 ）或 pEDJ400（对照， URA3 ），如前所述在 SC-LWU 上孵育，分别获得菌株 Sc146 和 Sc147。
注意：Cas9 和容易出错的 T7 RNA 聚合酶都处于 GAL1 启动子的半乳糖诱导控制之下。

D. 系统诱导和筛选功能获得性突变体 ( HIS3 + )
1. 工作流程准备
准备至少 13 个 14 mL 培养管，以包含 5 mL 的 SC-LWU 和 2% 葡萄糖。
2. 菌株接种
使用接种环为每个培养管接种来自转化板的单个菌落。为菌株 Sc146 接种至少 10 个菌落，为对照菌株 Sc147 接种至少三个菌落。在 250 rpm 和 30°C（系统关闭）下孵育过夜（20 小时）。
3. 系统感应
通过离心（2,000 rpm 5 分钟）沉淀过夜培养物，弃去上清液，并在 5 mL 无菌MiiliQ水中洗涤一次。用 2% 半乳糖（系统开启）在 2 mL 的 SC-LWU 中重新悬浮颗粒，并通过分光光度法在每个比色皿的 1 mL 培养物上测量 OD 600 。在 2 mL 总体积中调整到 OD 600 = 2.0，在新培养管中使用 2% 半乳糖的 SC-LWU。在 250 rpm 和 30°C 下孵育培养管 48 小时。
4. 筛选功能获得性突变体（板）
测量最终的 OD 600 ，并在五个不含组氨酸 (SC-H) 的含有 2% 葡萄糖（系统关闭）的合成辍学板上从每个培养物中测量5 × 300 μL 。此外，在 990 μL的MiiliQ水中稀释 10 μL的培养物，并像以前一样，在非选择性板 (SC-LWU) 上用 3 × 100 μL的稀释系列进行10 ×稀释系列。在 30°C 的固定培养箱中孵育所有板 5 天，并对产生的菌落进行评分。
注意：产生的菌落在目标位点获得了 HIS3 + ，并且成功的功能性cgRNA -DNA修复事件的数量相等。
5. 筛选功能获得性突变体和测序（液体培养）
可选：将 5 mL 含 2% 葡萄糖的 SC-H 添加到带有培养残余物（每管约 190 μL ）的培养管中，并在 250 rpm 和 30°C 下再孵育 72 小时。通过在 400 μL的 400 mM 醋酸锂中离心和再悬浮颗粒，从 1.5 mL Eppendorf 管中的每个培养管中转移和收获 500 μL 。在 70°C 下孵育 15 分钟，通过离心沉淀残余物，并将 300 μL上清液转移到新的 1.5 mL Eppendorf 管中。加入 30 μL 3 M 醋酸钠和 900 μL 100% 乙醇，在 -80°C 下孵育 1 h。在预冷的离心机 (4°C) 中全速离心 20 分钟，弃去上清液，用 70% 乙醇洗涤一次。在室温下全速离心 5 分钟，弃去上清液。将颗粒在 60°C下干燥 5-10 分钟，然后轻轻吹打重悬于 100 μL MiiliQ水中。使用 100-400 ng 作为模板 f或 PCR 与OneTaq 、2 × MM 和寡核苷酸： F_Seq (CAAGTTCTTAGATGCTTTC) 和R_Seq (CTACATAAGAACACCTTTGGTG)。让延伸发生 2 分钟，以放大目标基因座 ( HIS3 + )。可以对扩增产物进行 Sanger 测序以验证感兴趣区域的诱变。

数据分析

1. 在 30°C 下孵育 5 天后，计数来自（突变）选择性 SC-H 板和非选择性 SC-LWU 板的上述步骤 D4 的菌落。
2. 将突变体的数量除以从非选择性板确定的每体积的活细胞数，以获得突变频率。
3. 使用公式：LN(OD 600 )结束/LN(OD 600 )开始- 1 ，确定从开始和最终 OD 600测量开始和最终 OD 600 测量系统诱导期间经历的世代数。
4. 通过首先将突变频率除以代数，然后除以可能允许允许突变的序列空间（三个碱基 = 人工 STOP 密码子）来确定每个碱基的突变率。

食谱

1. 200 mg/mL 诺尔丝菌素溶液
将 5 g nourseothricin 溶解在 25 mL 的MiiliQ水（200 mg/mL）中，并用 0.2 μm一次性过滤器单元和 50 mL 注射器对溶液进行无菌过滤。
2. 20% (w/v) 葡萄糖和半乳糖溶液
将 20 克葡萄糖或半乳糖溶解在 80 毫升MiiliQ水中，然后达到 100 毫升总体积。将最终溶液在 121°C 高压灭菌 15 分钟。
3. 合成完全辍学媒体
具有适当脱除率的酵母合成脱除培养基补充剂的重量如下：
不含亮氨酸：1.62 g/L
不含组氨酸：1.92 g/L
不含尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸：1.46 g/L
a. 将合成滤液溶解在 880 mL 的MiiliQ水中，加入i ) 6.7 g/L 不含氨基酸的酵母氮碱或（标准培养基），ii) 1.7 g/L 不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱，和iii) 1.1 g/L L-谷氨酸一钠盐一水合物（用于含有诺尔丝菌素的培养基）。
b. MiiliQ水将 pH 值调至 5.6，然后将体积调至 900 mL 。加入 20 g 琼脂（用于平板），然后在 121°C 高压灭菌器中灭菌 15 分钟。
c. 热处理后，让培养基冷却至 ~60°C，加入 100 mL 的 20% (w/v) 葡萄糖或 20% (w/v) 半乳糖，搅拌 20 秒混合。在搅拌之前，还要从上面的 ii) 点添加 0.5 mL 的 200 mg/mL 诺尔丝菌素溶液用于选择性板。
d. 将盘子倒入安全柜中，让盘子凝固约 30 分钟。

致谢

这项工作得到了诺和诺德基金会 (NNF20CC0035580) 和 Villum 基金会 (赠款 #28309) 的财政支持。该协议已改编自Jensen等人。（2021 年）。

利益争夺

作者声明不存在潜在的利益冲突。

参考

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