材料和试剂
1.5 mL微管（Greiner Bio-One，目录号：616201）
HS-AFM用玻璃基板载物台（定制的直径2mm、高2mm的玻璃棒，Japan Cell）
悬臂（奥林巴斯，BLAC10DS-A2）
#3000砂纸（Riken Corundum，Precision Polishing Film Sheet #3000，目录号：3-9013-06）
100 mL烧杯
Kimwipes （Nippon Paper Crecia ，目录号：62015）
用于玻璃台上液体置换的滤纸（ADVANTEC，目录号：01531090）（切成三角形，如图2所示）
25 cm 2组织培养瓶（AS ONE，目录号：2-8589-01）
微量移液器吸头（Greiner Bio-One，目录号：740290 和 739285）
丙酮（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号： 012-00343)
氢氧化钾 (KOH) ( Nacalai Tesque ，目录号：28616-45）
乙醇（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation ，目录号：057-00456）
Fluorosurf （ FluoroTechnology ，目录号：FG-3020C-20）
无色指甲油（资生堂、 MAQuillAGE （面漆））
去离子水
3-氨基丙基二乙氧基甲基硅烷（APTES）（Shin-Etsu Chemical，目录号：KBE-903）
戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
心脏输液肉汤（BD，目录号：238400）
酵母提取物（BD，目录号：212750）
10 N NaOH (纳卡拉 Tesque ，目录号： 31511-05 ）
马血清（Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：16050122）
两性霉素 B（Sigma-Aldrich，目录号：A2942）
氨苄西林钠（纳卡莱 Tesque ，目录号：02739-32）
磷酸氢二钠（ Nacalai Tesque ，目录号：31801-05）
磷酸二氢钠二水合物（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：192-02815）
氯化钠 ( Nacalai Tesque ，目录号：31320-05）
葡萄糖（纳卡莱 Tesque ，目录号：16806-25
含葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水 (PBS/G)（参见食谱）
Aluotto培养基（见食谱）

生物材料
M.mobile 163K 菌株（ATCC，目录号：43663）中分离出的突变菌株（ gli521 [P476R]）（Uenoyama 和 Miyata，2005）

设备

微量移液器（Gilson，目录号：F123600 、 F123601 和 F12360 2）
离心机（Sigma Laborzentrifugen ，型号：Sigma 1-14）
25°C培养箱（Tokyo Rikakikai ，型号：LTI-400E）
加热器 (TAITEC CORPORATION, CTU-Neo)
磁力搅拌器（一体机，型号：CT-1AT）
HS-AFM（具有相同性能的仪器购自生物分子计量研究所，型号：SS-NEX）
高压灭菌器（TOMY SEIKO，型号：LSX-700）

程序

细胞制备
将 1 mL 冷冻M. mobile原液接种到25 cm 2组织培养瓶中的10 mL Aluotto培养基中，并在 25°C 下静态培养几天，以达到 0.06-0.08 的 600 nm 光密度。
× g和室温 (RT) 下离心 4 分钟收集 2 mL 培养的细胞，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 400 µL 的 PBS/G 中，并以 12,000 × g和 RT 再次离心 4分钟（注 1）。
重复此过程两次。
将 100 μL 的 PBS/G 中的细胞重新悬浮到原始培养物的 20 倍密度。

玻璃舞台处理
将基材表面轻轻压在#3000砂纸上，来回擦洗200次以刮擦表面（粗糙表面提供更稳定的观察。此步骤是可选的）。请注意，此过程不应应用于另一侧。
将玻璃台放入装满丙酮的 1.5 mL 微管中，摇动以去除玻璃碎片。（可选：如上所述）
要制备饱和 KOH-乙醇溶液，将 10 g KOH 添加到 50 mL 乙醇中，使用磁力搅拌器搅拌 5 分钟，然后将饱和 KOH-乙醇溶液的上清液转移到新烧杯中。
将几个玻璃阶段放入准备好的饱和 KOH-乙醇溶液中。
离开 15 分钟以亲水化玻璃表面。
弃去溶液，加入一些去离子水，轻轻摇晃烧杯。
重复此过程十次以去除化学物质。
将玻璃台移动到Kimwipes上并除去水。
– 45°C 下保持 20 分钟以干燥。

细胞固定在玻璃表面。
Fluorosurf对玻璃台的侧面进行疏水化处理。
注意：如果不进行处理，放置在基材表面的液体会溢出到侧面。
用指甲油将玻璃台固定在 HS-AFM 扫描仪的 Z 压电上（图 1）。
就在使用前，用 999 μL 的水稀释 1 μL 的APTES 。
对于玻璃舞台表面的硅烷化，在稀释后立即将 5 μL 的 APTES 溶液加载到处理过的玻璃基板上并放置 10 分钟。
用 20 μL 的水滴冲洗基板表面。重复此操作四次（图 2）。
用 0.1% 戊二醛溶液代替玻璃基板上的水，放置 5 分钟。
用 20 μL 的水滴冲洗基板表面。重复此操作四次。
用 PBS/G 替换基板上的戊二醛溶液。
将基板上的 PBS/G 替换为细胞悬液，并在 25 – 28°C 下放置 10 分钟。
用 20 μL 的 PBS/G 逐滴冲洗基板表面。重复此操作四次。

图 1 。 HS-AFM 扫描仪，带玻璃载物台和样品滴。
压电元件用于在 XYZ 方向上驱动每个轴。 Z 压电、玻璃载物台和样品溶液以粉红色虚线圆圈显示，如右下角所示。使用指甲油将玻璃载物台固定在 Z 压电体上。

图 2 。在玻璃台上进行液体更换的程序。

HS-AFM 观察。
将配备玻璃载物台和样品溶液的 HS-AFM 扫描仪倒置到 HS-AFM 机械单元并开始成像（图 3）。
将悬臂的自由振荡幅度 ( A 0 ) 和设定点幅度 ( A sp ) 分别设置为 ~2.5 nm 和 ~0.8 × A 0 。在这些条件下，平均攻丝力 < F > 可以使用以下等式近似为 ~40 pN ：

〈F〉=k_c/(2Q_c ) √(〖A_0〗^2-〖A_sp〗^2 )
其中k c和Q c分别是悬臂的弹簧常数和品质因数。液体中k c和Q c的标称值分别为 ~0.08 N/m 和 1.5。之前描述了详细条件（Uchihashi等人， 2012）。
对于搜索单元格（图 4a），在 3,000 × 3,000 nm 2区域内以 150 × 150 像素扫描样品，每帧成像速率为 1,000 ms 。
（ https://journals.asm.org/doi/10.1128/mBio.00040-21#movS1 ）。
要观察如图 4b 所示的粒子结构，请在 200 × 200 nm 2的区域内以每帧 330 或 200 ms的成像速率扫描细胞表面，像素为 100 × 100。
（ https://journals.asm.org/doi/10.1128/mBio.00040-21#movS3 ）。
其他细节与使用 HS-AFM 对溶液中样品的一般观察相同（ Uchihashi 等人，2012）。

图 3 。高速原子力显微镜。
(a) 图片显示了 HS-AFM 的机械部件和一些电气设备。 AFM 单元（扫描仪和悬臂）安装在倒置光学显微镜上，该显微镜放置在防振台上。 (b) 实验装置示意图。悬臂梁和M. 移动单元不按比例。可以通过监视器观察悬臂和玻璃基板周围的光学视图。

图4 。 HS-AFM 拍摄的代表性图像。
(a) 全细胞图像 (b) 粒子结构图像[面板 (a) 盒装区域的放大图像]。这个数字是在之前的一篇论文中修改的（Kobayashi等人， 2021 年）。

数据分析

所有程序都发表在我们之前的论文中（小林等人， 2021，https://journals.asm.org/doi/10.1128/mBio.00040-21）。简要地，视频通过三个步骤 ( i ) 到 (iii) 进行处理，并分析粒子运动。 ( i ) 带通滤波器提高了图像对比度。 (ii) 图像漂移由 ImageJ 的插件“对齐堆栈中的切片”(Tseng et al ., 2012) 进行校正。 (iii) 通过平均三个连续切片来减少图像噪声。然后，对每个粒子图像进行裁剪、二值化并追踪质心。所有分析均使用 ImageJ 1.52A 版进行。

笔记

悬浮细胞沉淀
建议使用移液器进行 100 多次上下移动以完全分离细胞。
马血清的热处理
对于M. mobile生长和滑行，马血清应通过在 56°C 下热处理 30 分钟来灭活。

故障排除
甚至无法获得平坦的基板图像。
细胞或其他悬浮颗粒可能会粘在悬臂上。为了摆脱它们，使悬臂远离基板表面，将悬臂的振幅设置为自由振荡 1 分钟，然后再次尝试成像。如果多次尝试后仍未改善，请取下扫描仪并使用移液室中的水流清洗悬臂。
在场上没有发现细胞。
小分子，包括氨基，可能与玻璃台结合并阻止细胞结合。再次仔细准备细胞悬浮液和玻璃台。对于细胞制备，增加移液次数以去除小分子。请注意，洗涤次数过多也可能会减少细胞数量。通过 600 nm 的光密度和光学显微镜检查细胞状况，因为旧培养物往往包含细胞以外的颗粒。
在观察过程中，细胞很容易从基板上脱落。
的玻璃载物台可能会有所帮助[请参阅玻璃载物台处理选项（程序 B） ] 。
细胞图像看起来很奇怪。
细胞可能已经变干。更换细胞悬液和玻璃载物台。将湿纸巾放在边缘，以加湿腔室周围的区域。
在细胞上没有发现颗粒结构。
这可能是由于悬臂尖端损坏造成的。更换悬臂。

食谱

Aluotto培养基
1% 心脏输液肉汤
0.56% 酵母提取物
0.035% 10 N NaOH
注：将上述三种试剂混合溶解，高压灭菌，冷却至37℃以下，在超净台中加入以下三种试剂。
10%马血清（注2）
0.025% 两性霉素 B
0.005% 氨苄青霉素钠
含葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水 (PBS/G)
75 mM 磷酸钠 (pH 7.3)
68 毫米氯化钠
20mM 葡萄糖
使用过滤或高压灭菌消毒

致谢

这项工作得到了科学研究补助金 (B) 和 (A) (MEXT KAKENHI、补助金号 JP24390107、JP17H01544) 和 JST CREST (补助金号 JPMJCR19S5) 对 MM 的支持。
该协议改编自之前发表的一篇论文（Kobayashi等人，2021 年）。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

安藤，T.（2018 年）。高速原子力显微镜及其未来前景。生物物理学修订版 10(2)：285-292。
Kobayashi, K.、Kodera, N.、Kasai, T.、Tahara, YO、Toyonaga, T.、Mizutani, M.、Fujiwara, I.、Ando, T. 和 Miyata, M. (2021)。移动支原体的运动高速原子力显微镜检测的滑动机械。 _ _ _ _ _ _ _ mBio 12（3）：e0004021。
Kodera, N. 和 Ando, T. (2020)。高速断层肌力显微镜研究肌球蛋白运动性。 _ _ _ _ _ Adv Exp Med Biol 1239：127-152。
Kodera, N., Noshiro, D., Dora, SK, Mori, T., Habchi, J., Blocquel, D., Gruet, A., Dosnon, M., Salladini, E., Bignon, C., et人_ （2021 年）。用高速原子力显微镜对本质上无序的蛋白质进行结构和动力学分析。 Nat Nanotechnol 16（2）：181-189。
Kodera, N.、Yamamoto, D.、Ishikawa, R. 和 Ando, T. (2010)。高速原子力显微镜对行走肌球蛋白 V 的视频成像。自然468（7320）：72-76。
Miyata, M. 和 Hamaguchi, T. (2016)。支原体滑行机制的展望移动。 Curr Opin Microbiol 29：15-21。
Nishikawa, MS、Nakane, D.、Toyonaga, T.、Kawamoto, A.、Kato, T.、Namba, K. 和 Miyata, M. (2019)。完善的支原体移动机制基于机械结构、 ATP酶活性和唾液酸结合的滑行。 _ _ _ mBio 10(6)：e02846-19。
Tseng, Q.、Duchemin-Pelletier, E.、Deshiere, A.、Balland, M.、Guillou, H.、Filhol, O. 和 Thery, M. (2012)。细胞外基质的空间组织调节细胞-细胞连接定位。 Proc Natl Acad Sci USA 109（5）：1506-1511。
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Uenoyama, A. 和 Miyata, M. (2005)。支原体移动的滑翔鬼。 Proc Natl Acad Sci USA 102（36）：12754-12758。
Yamashita, H.、Taoka, A.、Uchihashi, T.、Asano, T.、Ando, T. 和 Fukumori, Y. (2012)。高速原子力显微镜对活细菌细胞表面的单分子成像。分子生物学杂志 422（2）：300-309。
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