材料和试剂
1.1.5 mL微管（Biopioneer，目录号：CNT-1.5F）
2.15 mL Falcon 管（Corning，目录号：430791）
3.50 mL Falcon 管（Corning，目录号：352070）
4.MS柱（Miltenyi Biotech，目录号：130-042-201，柱容量：多达2×10 8个总细胞中的多达10 7 个磁性标记细胞）
5.LS柱（Miltenyi Biotech，目录号：130-042-041，柱容量：多达10 8个磁性标记的细胞，来自多达2×10 9个总细胞）
6.0.2- μm孔径过滤器，瓶盖（Fisher Scientific，目录号：595-4520）
7.1 mL 注射器，带25G × 25 mm 针头(Terumo)
8.100 mm 培养皿（Corning，目录号：354600）
9.30μm预分离过滤器（Miltenyi Biotech，目录号：130-041-407，）
10.细胞过滤器（BD Falcon，40 μm，目录号：352340）
11.75% (vol/vol) 乙醇
警告！易燃。远离火焰和火源。存放在干燥和通风良好的地方。
12.QuadroMACS 起始试剂盒（Miltenyi Biotech，目录号：130-091-051）
13.Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM；Thermo Fisher，目录号：11965）
14.青霉素/链霉素（Thermo Fisher，目录号：15140122）
15.胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher，目录号：16170-078）
16.牛血清白蛋白溶液（BSA）（MP Biomedicals，目录号：810531）
17.钠氯化物（ NaCl ）（Fisher Scientific，目录号：7647-14-5）
18.氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：7447-40-7）
19.磷酸钠（ Na 2 HPO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：7778-77-0）
20.碳酸氢钾（ KHCO 3 ）（Fisher Scientific，目录号：298-14-6）
21.10 ×红细胞（RBC）裂解液（ Miltenyi Biotech，目录号：130-094-183）
22.死细胞去除试剂盒（ Miltenyi Biotech，目录号： 130-090-101），包括死细胞去除微珠和20 ×死细胞结合（DCB）缓冲储备溶液
23.乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma，目录号：E6758-100G）
24.多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
25.甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
26.Triton-X100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-500ML）
27.甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich，目录号：198161）
28.OSCAR 抗体（R&D Systems，目录号：MAB1633，同种型：单克隆大鼠 IgG 2A ）
29.生物素偶联的CTR抗体（LifeSpan BioSciences，目录号：LS-C523811，同种型：生物素偶联的多克隆兔 IgG）
30.抗大鼠 IgG 微珠（Miltenyi Biotech，目录号：130-048-502）
31.Anti -Biotin Multisort Kit （Miltenyi Biotech，目录号：130-091-256），包括Anti-Biotin Multisort MicroBeads、MultiSort Release Reagent 和 MultiSort Stop Reagent
32.单克隆大鼠 IgG 2A同种型对照（R&D Systems，目录号：MAB006 ）
33.生物素缀合的多克隆兔 IgG同种型对照（LifeSpan BioSciences，目录号：LS - C351735）
34.Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗（Thermo Scientific，目录号： A11006）
35.PE山羊抗兔IgG（H + L）交叉吸附的二抗（Thermo Scientific，目录号： P-2771MP）
36.DPBS（见食谱）
37.MACS 缓冲区（见配方）
38.完整的 DMEM 培养基（见配方）
39.1 × RBC 裂解液（见配方）
40.1 × DCB 缓冲器（见配方）
41.1 % 甲苯胺蓝溶液（见配方）

设备

1.解剖工具（手术剪、微钳）
2.4°C 摆桶离心机（例如，Allegra X-15 R，Beckman Coulter）
3.血细胞计数器/计数室（例如，Hausser Scientific Partnership，目录号：3200）
4.FACS（例如，BD FACS、A ria III Cell-Sorting System、BD Biosciences ）

程序

A.制备骨髓细胞 ●时间40 分钟
1.在全身麻醉或其他批准的方法下通过颈椎脱位对 3 个月大的小鼠实施安乐死。警告！所有动物程序必须按照您当地的动物伦理和实验安全委员会进行。
2.用 70% 乙醇对小鼠进行消毒，解剖后肢，并通过从骨骼上刮下骨干去除软组织。将骨头存放在冰上冷的完整 D MEM 中。
3.使用消毒设备在引擎盖中收获 BMC。在骨髓腔末端下方切割胫骨和股骨的末端。取下骨生长板，将一根 27G 针头插入含有完整培养基的 1 mL 注射器上，插入海绵状骨中。用完整的培养基反复将骨髓塞从轴中冲洗出来，并将塞子收集到放置在冰盘中的 40 μm 篮式过滤器中。关键步骤当骨髓腔不再发红时，即可停止潮红。
4.使用新注射器的末端将骨髓塞分散通过篮式过滤器，以去除脂肪、聚集的碎屑和其他不需要的物质。
5.通过细胞过滤器进入 15 mL 锥形管中，以获得单个细胞暂停。 300 ×离心机 G 4°C 10 min 沉淀细胞，弃上清。
6.10 mL 的 1 × R BC 裂解溶液添加到 BMC 中。轻轻涡旋 5秒，在室温下孵育 10 分钟。关键步骤避开高速漩涡（推荐转速≤600 RPM）。
7.300 ×离心机_ G 4°C 5 分钟，弃上清。通过上下移液将细胞颗粒重新悬浮在 1 mL 的冷 MACS 缓冲液中。
8.使用血细胞计数器（或自动计数仪器，如果有）对细胞进行计数。关键步骤在以下步骤中，计算细胞数对于确定抗体和 MACS 微珠的数量以及 MACS 柱的大小非常重要。通常， 5 × 10 7 –7 × 10 7总BMC 可以从 RBC 裂解后的一只小鼠的后肢获得。
9.在上述细胞悬液中再加入 4 mL 冷 MACS 缓冲液，以300 × g离心 4℃ 5 min，弃上清。每10 7 个细胞在 100 μL的死细胞去除微珠中重悬细胞沉淀。充分混合并在室温下孵育 15 分钟。
10.将 1 mL 的 1 × DCB 缓冲液中的细胞悬浮液涂抹在 MACS 分离器磁场中的预洗 LS 柱上。收集通过柱子的阴性细胞。用 3 mL 的 DCB 缓冲液冲洗色谱柱三次，并将所有流出物收集为活细胞部分（通常在去除死细胞后可以收集最后一步的 70-80% 的细胞）。 C以300 × g离心活细胞悬液 4℃ 5 min，弃上清。
11.重新悬浮d细胞沉淀。使用血细胞计数器（或自动计数仪器，如果有）对细胞进行计数，然后进行一抗标记。

B.CTR +和 CTR -细胞的磁性分离 ● 时间2 小时 20 分钟
1.上述细胞悬液在 300 × g和 4°C 下离心 5 min，弃上清。然后，用重悬细胞沉淀 2 μg 生物素偶联CTR抗体和 OSCAR 抗体在 200 μL MACS 缓冲液中每 10 7 细胞。 4°C 避光孵育30 分钟。
2.用 5 mL 的冷 MACS 缓冲液清洗细胞悬液，并以 300 × g离心和 4°C 5 分钟。重复洗涤步骤两次。关键步骤为了减少未结合的一抗，重要的是在抗体标记后至少洗涤细胞两次。
3.用重悬细胞 80 μL中含有20 μL抗生物素 MultiSort 微珠每 10 7 个细胞的冷 MACS 缓冲液。 4°C 避光孵育 15 分钟。
4.mL的冷 MACS 缓冲液清洗细胞悬液，并在 300 下离心 ×克和 4°C 10 分钟。重复洗涤步骤两次，并将细胞重新悬浮在 500 μL的冷 MACS 缓冲液中。
5.进行磁选。将带有柱翼的 LS柱插入MACS 分隔符中。通过用冷 MACS 缓冲液冲洗 LS 柱来准备 LS 柱：在柱顶部应用 2 m L的脱气 MACS 缓冲液，并让 MACS 缓冲液通过。丢弃流出物并更换收集管。警告！色谱柱是“流动停止”的，不会干涸。 LS 列的最大样本量为 1 × 10 2 × 8个标记的单元格 10 9总细胞。
6.将细胞悬浮液涂在准备好的LS柱上。收集通过的流出物。每次当柱水库为空时，通过添加3 m L的脱气d MACS 缓冲液清洗LS柱三次。收集含有 CTR –细胞的总流出物。
7.从分离器中取出 LS 柱并将其放在新的收集管上。将5 m L的 MACS 缓冲液移到 LS 列上。通过牢固地应用色谱柱随附的柱塞，立即用磁性标记的细胞冲洗掉部分。警告！此步骤中刷新的单元格是CTR +单元格。要提高磁分离CTR +细胞的纯度，请使用新色谱柱重复步骤 5 – 7中所述的磁分离过程。
8.–细胞部分和步骤 7 中的 CTR +细胞部分在 300 下离心 × g和 4°C 10 分钟。弃去上清液，继续下一步洗脱磁珠。

C.+ CTR +和 OSCAR + CTR –细胞的磁分离● 时间2 小时
1.μ L重悬每个细胞部分的上述细胞沉淀 MultiSort释放试剂 100 每10 7 μL 冷 MACS 缓冲液细胞。充分混合并在 4°C 下孵育 10 分钟。每10 7用 1 mL的冷 MACS 缓冲液清洗细胞细胞和离心机在 300 × G 和 4°C 10 分钟。丢弃上清液，每10 7将细胞重新悬浮在 50 μL 的冷 MACS 缓冲液中细胞。每10 7加入 30 μL MultiSort Stop Reagent 细胞进入细胞悬液并充分混合。 300 离心上述细胞悬液 × G 和4°C 5分钟。关键步骤在此步骤中，从细胞中去除抗生物素 MultiSort 微珠，从而对 OSCAR +细胞进行第二轮磁分离。
2.在 1 m L的冷 MACS 缓冲液中重新悬浮每个细胞部分的上述细胞颗粒。使用血细胞计数器（或自动计数仪器，如果有）对细胞进行计数。 300 ×离心上述细胞悬液 g和 4°C 5 分钟，弃去上清液。然后，用20 μL抗大鼠 IgG 微珠在 80 每 10 7 个细胞加入μL冷 MACS 缓冲液，并在 4°C 的黑暗中孵育 15 分钟。
3.mL的冷 MACS 缓冲液清洗细胞悬液，并在 300 下离心 × G 和 4°C 10 分钟。重复洗涤步骤两次，将细胞重悬于 500 μL 冷 MACS 缓冲液。
4.继续进行磁选。将带有柱翼的 MS 柱插入到 MACS 分隔符中。通过用冷 MACS 缓冲液冲洗来准备 MS 柱：在柱顶部应用 500 μL 脱气 MACS 缓冲液，让 MACS 缓冲液通过。丢弃流出物并更换收集管。注意！色谱柱是“流动停止”的，不会干涸。 MS 色谱柱的最大样本量为2 × 10 8总细胞中的 1 × 10 7标记细胞。
5.将CTR +和 CTR –分数细胞悬浮液应用到准备好的MS柱上。收集通过的流出物。每次当柱水库为空时，通过添加 500 μL 脱气 d MACS缓冲液清洗MS柱三次。收集包含 OSCAR 细胞（非 OLC）的总流出物。
6.从分离器中取出 MS 柱并将其放在新的收集管上。将1 m L的MACS 缓冲液移到 MS 柱上。通过牢固地应用色谱柱随附的柱塞，立即用磁性标记的细胞冲洗掉部分。注意！此步骤中刷新的单元格分别是 OSCAR + CTR + ( MOCs)和OSCAR + CTR –单元格 (OCPs) 。
7.在 300 下离心所需的细胞组分 × g和 4°C 10 分钟以沉淀细胞，弃去上清液。细胞沉淀可以进行 RNA提取用于基因表达测定，例如RT-PCR 和微阵列，或蛋白质提取用于蛋白质印迹。或者，将细胞颗粒重新悬浮在适当的细胞培养基中进行破骨细胞培养，然后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和骨吸收测定，以测量体外破骨细胞活性。关键步骤台盼蓝染色用于计数活细胞。

数据分析

1.丰富 MACS 排序的OCP 和 MOC
MACS 分选的细胞部分中OSCAR + CTR –和OSCAR + CTR +细胞的纯度通常分别为>75% 和 >90 % （图2 ）。 MACS 后这两种细胞部分的富集在OVX 和 Sham 小鼠中都很高且可重复（补充图1a ）。

图 2 ． MACS 分选的 OSCAR + CTR –和 OSCAR + CTR +细胞的纯度。
流式细胞仪分析显示 MACS 分选的 OSCAR + CTR –和 OSCAR + CTR +细胞的纯度。通过 7-氨基放线菌素 D (7-AAD) 染色排除死细胞，而门控活细胞以检测 OSCAR（由 FITC 标记的二抗标记）和 CTR（由 PE 标记的二抗标记）的表达。 MACS 分类的 OSCAR + CTR –破骨细胞前体（中图）和 MACS 分类的 OSCAR + CTR +成熟破骨细胞（右图）。同种型对照抗体用作阴性对照（左图）。

2.MACS分类的OCP和MOC的分子和功能表征
抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP，由ACP5基因编码）的表达定义了 OLC 的分子特征。连同组织蛋白酶 K (CTSK) 的高表达，这些是破骨细胞成熟的重要标志。一致地，实时 qPCR 和蛋白质印迹分析（详见S补充方法）显示破骨细胞标志物 TRAP 和 CTSK 的 mRNA 和蛋白质表达水平在 OSCAR + CTR -和OSCAR + CTR +细胞中，两者都显着高于OSCAR -细胞分数（图3a - b ）。此外，与 OSCAR + CTR +细胞相比， OSCAR + CTR +细胞中 TRAP 和 CTSK的mRNA 和蛋白质表达水平均显着升高。（图3a - b ）。 _另一方面，成熟破骨细胞被表征为具有激活的骨吸收能力的TRAP染色的多核细胞，而破骨细胞前体被表征为没有骨吸收能力的TRAP染色的单核细胞。一致地，TRAP 染色和骨吸收测定（详情见补充方法）显示OSCAR –细胞均为均质TRAP阴性，没有骨吸收能力，OSCAR + CTR –细胞大多是 TRAP 阳性单核细胞，几乎没有骨吸收能力，而 OSCAR + CTR +细胞是具有高骨吸收能力的TRAP阳性多核细胞（图4a - b ）。

图 3 。来自 Sham 小鼠的 MACS 分选的 OSCAR – 、OSCAR + CTR –和 OSCAR + CTR +细胞的分子特征。
– 、OSCAR + CTR –和 OSCAR + CTR +细胞中 TRAP 和 CTSK mRNA 表达的实时 qPC R分析。 (b) OSCAR – 、OSCAR + CTR –和 OSCAR + CTR +细胞中 TRAP 和 CTSK 表达的蛋白质印迹分析。所有数据均为平均值 ± SD * P < 0.05，** P < 0.01。进行了单向方差分析和随后的 Tukey 多重比较测试。

图 4 。来自 Sham 小鼠的 MACS 分选的 OSCAR – 、OSCAR + CTR –和 OSCAR + CTR +细胞的功能表征。
– 、OSCAR + CTR –和 OSCAR + CTR +细胞的 TRAP 染色。对具有三个以上核酸的 TRAP 阳性细胞进行计数。比例尺，100 μm。 (b) OSCAR – 、OSCAR + CTR –和 OSCAR + CTR +细胞的骨吸收测定。比例尺，100 μm。所有数据均为平均值 ± SD * P < 0.05，** P < 0.01。进行了单向方差分析和随后的 Tukey 多重比较测试。

3.卵巢切除术后 MACS 分选的 OCP 和 MOC 的病理变化
卵巢切除术引起的雌激素消耗可导致破骨细胞形成异常增加，骨吸收过度，导致小鼠显着骨丢失。一致地，与从 Sham 小鼠中分离的那些细胞相比，从 OVX 小鼠中分离的OSCAR + CTR和OSCAR + CTR +细胞中 TRAP 和 CTSK的mRNA 和蛋白质表达水平显着更高（补充图 1b-c ）。此外，与从 Sham 小鼠中分离的那些相比，从 OVX 小鼠中分离的 TRAP 阳性单核OSCAR + CTR -细胞在用核因子 kappa-B 配体的受体激活剂 (RANKL) 刺激后产生了更多的 TRAP 阳性多核细胞。类似地，从 OVX 小鼠中分离的 TRAP 阳性多核OSCAR + CTR +细胞表现出比从 Sham 小鼠中分离的更好的骨吸收能力（补充图 1d-e ）。

总之，本文提供了一种易于操作的协议，用于直接从体内小鼠 BMC 中快速分离活 OCP 和 MOC 。通过该方案获得的富集活细胞可以真正保持其体内状态，这对于研究OLC在体内的生物学特征和病理变化具有重要价值。如果用于从各种物种、年龄和性别的小鼠中分离活 OLC，该协议也显示出希望。

笔记

问题可能的原因解决方案
纯度低
（OSCAR + CTR –细胞 < 60%，
OSCAR + CTR +细胞 < 80%)磁性标记的细胞数量超过了 MS 柱的结合能力将正分数重新加载到新列中

列中的非特异性结合
使用 MACS 缓冲液清洗柱子更多次并将阳性部分重新加载到新柱子中

产量低
（OSCAR + CTR –细胞数 < 5 × 10 6每只小鼠，OSCAR + CTR +细胞数 < 1 × 10 5每只小鼠）骨髓中残留的细胞过多尽可能冲洗掉骨髓细胞

细胞在红细胞裂解液中孵育时间过长，导致大量细胞碎片。
严格控制裂解时间

未结合抗体的洗涤不充分
MACS缓冲液洗涤细胞悬液两次

许多死细胞
将细胞悬液置于冰上并使用冷试剂进行所有程序

食谱

1.完整的 DMEM 培养基
将 DMEM 与 10% (vol/vol)的FBS 和 1% (vol/vol) 的青霉素/链霉素混合。提前准备并在 4°C 下储存长达 1 个月。
2.DPBS (1×)
使用 80 g NaCl、2.0 g KCl、11.5 g Na 2 HPO 4 、2.0 g KH 2 PO 4制备1 × DPBS，和 800 mL 蒸馏 H 2 O。调节 pH 至 7.4 并加入蒸馏 H 2 O以调节体积至 1 L。提前准备，高压灭菌，并在室温（21-24 °C）下储存长达 6 个月.
3.1 × RBC 裂解液
将 10 mL 的 10 × Red Blood Cell Lysis Solution 和 90 mL 的蒸馏H 2 O 混合。无需提前准备溶液。
4.1 × DCB 缓冲器
稀释 20 × DCB 缓冲储存溶液与无菌双蒸 H 2 O，制备 1 × DCB缓冲器。
5.MACS 缓冲区
混合 0.37 g EDTA 和 2.5 g BSA，将 1 × DPBS 添加到 500 mL 的体积中，并对溶液进行过滤消毒和脱气。提前准备并在 4°C 下储存长达 1 个月。
6.1% 甲苯胺蓝溶液
将 1 g 甲苯胺蓝混合到 100 mL 的 70% 乙醇中。添加 1 × DPBS 将体积调整到 1,000 mL 并混合均匀。 pH 值应在 2.3 左右且小于 2.5。提前准备并在 4°C 下储存长达 1 个月。

致谢

这项工作得到了国家重点研发计划 (2018YFA0800804 to LC) 和中国国家自然科学基金委员会 (81702189 to J. L) 的资助, 香港研究资助局的主题研究计划 ( T12-201/20-R to AL), 香港研究资助局一般研究基金 (12100918, 12114416 and 12101117 to GZ, 12136616 and 12103519 to J. L, 14112915 to B.-TZ), Basic广东省科技厅应用基础研究基金（2019B1515120089转GZ），2020年广东省科技创新战略专项资金（粤港澳联合实验室，2020B1212030006），跨学科研究集群对接计划香港浸会大学 (RC-IRCs/17-18/02 to GZ; RC-IRCs/17-18/04 and RC-IRMS/15-16/01 to AL), the Inter-institutional Collaborative Research Scheme from Hong Kong香港浸会大学（RC-ICRS/19-20/01 至 AL）。该协议是从以前的工作（Liu等人，2015 和 2021）中修改的。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有实验程序均经香港浸会大学和香港中文大学动物伦理与实验安全委员会批准。

参考

1.Almeida, M.、Garcia-Montero, AC 和 Orfao, A. (2014)。细胞纯化：生物库的新挑战。病理学81（5-6）：261-275。
2.Asagiri, M. 和 Takayanagi, H. (2007)。破骨细胞分化的分子认识。骨40（2）：251-264。
3.Atkins, GJ, Kostakis, P., Vincent, C., Farrugia, AN, Houchins, JP, Findlay, DM, Evdokiou, A. 和 Zannettino, ACW (2006)。 RANK 表达作为人类破骨细胞前体在外周血、骨髓和骨巨细胞瘤中的细胞表面标志物。 J Bone Miner Res 21（9）：1339-1349。
4.Collin-Osdoby, P. 和 Osdoby, P. (2012)。原代鸡破骨细胞的分离培养。方法 Mol Biol 816：119-143。
5.Elefteriou, F. 和 Yang, XL (2011)。用于骨骼研究的遗传小鼠模型 - 优势和局限性。骨49（6）：1242-1254。
6.Feng, X. 和 McDonald, JM (2011)。骨重塑障碍。 Abbas, AK, Galli, SJ 和 Howley, PM (Eds.)病理学年度回顾：疾病机制，第 6 卷。年度回顾，121-145。
7.Glantschnig, H.、Fisher, JE、Wesolowski, G.、Rodan, GA 和 Reszka, AA (2003)。 M-CSF、 TNFalpha 和 RANK 配体通过 mTOR/S6 激酶发出信号促进破骨细胞存活。细胞死亡差异10(10)：1165-1177。
8.Lee, MY 和 Lufkin, T. (2012)。 “三步 MACS”的开发：一种在复杂动物组织中缺乏已知细胞表面标志物的情况下分离稀有细胞群的新策略。 J Biomol 技术杂志23(2): 69-77。
9.Li, D., Liu, J., Guo, B., Liang, C., Dang, L., Lu, C., He, X., Cheung, HY, Xu, L., Lu, C., et人_ （2016 年）。破骨细胞衍生的外泌体 miR-214-3p 抑制成骨细胞骨形成。国家通讯7：10872 。
10.Liu，J.，Dang，L.，Li，D.，Liang，C.，He，X.，Wu，H.，Qian，A.，Yang，Z.，Au，DW，Chiang，MW，等. （2015 年）。一种专门接近骨吸收表面的递送系统，以促进破骨细胞中 microRNA 的治疗性调节。生物材料52：148-160。
11.Liu, J., Wu, X., Lu, J., Huang, G., Dang, L., Zhang, H., Zhong, C., Zhang, Z., Li, D., Li, F.,等人。（2021 年）。破骨细胞衍生的 miRNA 向软骨细胞的外泌体转移有助于骨关节炎的进展。自然老化1（4）：368-384。
12.Madel, MB, Ibanez, L., Rouleau, M., Wakkach, A. 和 Blin-Wakkach, C. (2018)。一种新的可靠且有效的成熟破骨细胞纯化方法，可降低小鼠细胞中的功能性分析。 _ _前免疫 9：12 。
13.Marino, S.、Logan, JG、Mellis, D. 和 Capulli, M. (2014)。破骨细胞的产生和培养。骨键代表3：570。
14.Novack, DV 和 Mbalaviele, G. (2016)。破骨细胞 -骨骼健康和疾病中的关键p层。微生物光谱4（3）：19。
15.Quinn, JMW, Neale, S., Fujikawa, Y., McGee, JOD 和 Athanasou, NA (1998)。人类破骨细胞由血液单核细胞、腹腔巨噬细胞和骨髓细胞形成。 Calcif Tissue Int 62（6）：527-531。
16.Zhang, G., Guo, BS, Wu, H., Tang, T., Zhang, BT, Zheng, LZ, He, YX, Yang, ZJ, Pan, XH, Chow, H.等。（2012）。一种靶向骨形成表面的递送系统，以促进基于 RNAi 的合成代谢疗法。 Nat Med 18（2）：307-314。
17.甄，GH，Wen，CY，Jia，XF，Li，Y.，Crane，JL，Mears，SC，Askin，FB，Frassica，FJ，Chang，WZ，Yao，J.，等。（2013）。抑制软骨下骨间充质干细胞中的 TGF-β 信号传导可减轻骨关节炎。 Nat Med 19（6）： 704-712 。
18. 朱，SA，朱，JX，Zhen，GH，Hu，YH，An，SB，Li，YS，Zheng，Q.，Chen，ZY，Yang，Y.，Wan，M.，等。（2019）。软骨下骨破骨细胞诱导感觉神经支配和骨关节炎疼痛。临床投资杂志 129（3）：1076-1093。