材料和试剂
材料
1. Basix TM 1.5 mL 微量离心管（Fisher Scientific，目录号：02-682-002）
2. Fisherbrand TM 0.2 mL PCR 管（ Fisherbrand ，目录号：14-230-205）
3. 50 mL离心管（ CellPro ，目录号：C5602）
4. 50 mL离心管（ CellPro ，目录号：C5600）
5. 250 mL Erlenmeyer 玻璃烧瓶（Corning，目录号：4980500）
6. 150 mm × 15 mm培养皿（ Fisherbrand ，目录号：FB0875714）
7. 4-硫尿嘧啶（Alfa Aesar ，目录号：591-28-6）
8. DL-二硫苏糖醇（Sigma，目录号：D9779）
9. 0.5毫米氧化锆珠（Fisher Scientific，目录号：11079105z）
10. 抑肽酶（Sigma，目录号：A1153）
11. 胃蛋白酶抑制剂A（ Sigma，目录号，P4265）
12. 蛋白酶抑制剂 Tablet mini，不含 EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32955）
13. Triton X-100（ Sigma，目录号：T9284）
14. 苯甲基磺酰氟（ Sigma，目录号：P7626）
15. Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate（Bio-Rad，目录号：5000006）
16. Streptavidin Sepharose ® High Performance（GE Healthcare，目录号：GE-17-5113-01）
17. SuperScript ® III 逆转录酶（ Invitrogen，目录号：180-80-093）
18. RNaseOUT （ Invitrogen，目录号：P/W 100000840）
19. dNTPs（ dATP 、 dGTP 、 dCTP 、dTTP）（New England Biolabs Inc.，目录号：N0446S）
20. 2 × PCR主混合物（New England Biolabs Inc.，目录号：M0496S）
21. Pierce TM银染色试剂盒（Thermo Scientific，目录号：24612）
22. QIAzol试剂（QIAGEN，目录号：79306）
23. 氯仿（Sigma，目录号：C2432）
24. 异丙醇（Sigma，目录号：19516）
25. 不含RNase的水（Invitrogen，目录号：12183018）
26. 糖原，RNA级（Thermo Scientific，目录号：R0551）
27. 乙醇（ Pharmco Products，目录号：111000200）
28. 甲醇（Fisher Chemical，目录号：A412-4）
29. 冰醋酸（Fisher Chemical，目录号：A38-212）
30. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma，目录号：E9884）
31. 乙酸钠（Sigma，目录号：S2889）
32. 细菌蛋白胨（Thermo Scientific，目录号：J20048-P5）
33. 酵母提取物（Bio Basic，目录号：8013-01-2）
34. D-葡萄糖（Sigma，目录号：G8270）
35. 琼脂（Fisher Bioreagents，目录号：BP9744-500）
36. 超透明快速溶解琼脂糖（EZ Bioresearch，目录号：S-1020-500）
37. Tris-Base（Fisher Bioreagents，目录号：BP152-10）
38. 甘氨酸（Sigma，目录号：G8898）
39. 三氯乙酸（Sigma，目录号：T6399）
40. 丙酮（Sigma，目录号：179124）
41. 碳酸氢铵（AMBIC；Sigma，目录号：A6141）
42. 碘乙酰胺（IAA；Sigma，目录号：I1149）
43. 测序级修饰胰蛋白酶（Promega）
44. 赖氨酰内肽酶R (Lys-C, FujiFilm Wako Pure Chemical Corporation)
45. 三氟乙酸（TFA；Sigma，目录号：T1647）
46. 甲酸 (Sigma)
47. 测序级修饰胰蛋白酶（Promega）
48. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma，目录号：11667289001）
49. β-巯基乙醇（β-ME）（Sigma，目录号：444203）
50. 酸二乙酯（ DEPC）（Sigma，目录号：D5758）
51. 溴化乙锭（Sigma，目录号：E1510）
52. 甲醛（Fisher 生物试剂：BP531-500）
53. 甲酰胺（Sigma，目录号：47671）
54. DNase I（New England Biolabs Inc.，目录号：M0303S）
55. 具有硫酸铵的酵母氮碱（不含氨基酸）（Sigma，目录号：Y1251）
56. 氨基酸（来自 Sigma 的所有氨基酸）
57. MOPS（Sigma，目录号：M3183）
58. 氯化钾（Sigma，目录号：P9541）
59. 醋酸镁（Sigma，目录号：M5661）
60. 亮蓝R（Sigma，目录号：B7920）
61. 溴酚蓝（Sigma，目录号：114391）
62. 二甲苯氰醇FF（Sigma，目录号：X4126）
63. SC-尿嘧啶（不含尿嘧啶的完全合成培养基）
64. YEPD（见食谱）
65. 含有或不含尿嘧啶或亮氨酸的合成完全 (SC) 培养基（参见食谱）
66. 1 × PBS（见食谱）
67. 缓冲区 A（见配方）
68. 考马斯染色的固定溶液（见配方）
69. 染色液考马斯染色（见配方）
70. 脱色溶液考马斯染色（见配方）
71. 1 × TE 缓冲液（见配方）
72. 10 × MOPS 缓冲区（见配方）
73. 6 × RNA 上样染料（见配方）
74. 银染固定液（见配方）
75. 银染敏化剂溶液（见配方）
76. 银染染色液（见配方）
77. 银染显影液（见配方）
质粒
1. D774，pRS426-ADH1-3'-BE-RMB（Ghosh等人， 2021）
2. D844，pRS425-ADH1-5'-RD-RMB（Ghosh等人， 2021）
酵母菌株
1. X2159, MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ire 1:: NatMX hac1:: KanMX , pRS426-ADH1-3'-BE-RMB :URA3
2. X2160， MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ire 1:: NatMX hac1:: KanMX , pRS425-ADH1-5'-RD-RMB :LEU2
设备
1. 摇动培养箱（Innova 42，New Brunswick Scientific）
2. Spectro linker-XL-1000 UV 交联剂（ Spectronics Corporation）
3. 离心机 (Eppendorf 5415R)
4. 离心机 (Eppendorf 5810R)
5. 紫外线透照仪（UVITEC Cambridge）
6. Thermocycler-T100 (Bio-Rad)
7. NanoDrop-1000 分光光度计（Thermo Scientific）
8. 恒温摇床（New Brunswick Innova 42）
9. Mini-100 轨道摇床（精灵）
10. Diagger Vortex（精灵）
11. -80 °C冷冻柜（三洋）
12. 冰箱（三洋）
13. 章动振动器（粘土亚当斯）
14. 高场混合离子阱-Orbitrap 质谱仪（Thermo Scientific Orbitrap Elite）
程序
A. 培养酵母菌株和紫外交联
第 1 天：样本增长
1. 接种菌株 X2159 和 X2160 的单个酵母菌落分别在 10 mL 的 SC-尿嘧啶和 SC-亮氨酸培养基中。
2. °C的摇动培养箱中培养酵母过夜。
第 2 天：样品采集和 UV 交联
3. 将隔夜培养物接种到挡板烧瓶中 100 mL 的 SC-尿嘧啶或 SC-亮氨酸培养基中的起始 OD 600值 ±0.1。
4. °C的摇动培养箱中培养酵母，直到 OD 600值达到 ±0.6。
5. 在每种培养物中加入 100 μL 的 0.1 M 4-硫尿嘧啶和 500 μL 的 1.0 M DTT（最终浓度为 4-硫尿嘧啶 = 100 μM，DTT = 5 mM）。
6. °C的摇动培养箱中将它们再生长 3 小时。
7. 使用 Eppendorf 5810R以 2,900 rpm (291 × g ) 离心 10 分钟，在新鲜的 50 mL Falcon 管中收获每种培养物。
8. 使用 Eppendorf 5810R 将每个细胞沉淀重悬在 20 mL 的 1 × PBS 中并以 2,900 rpm (291 × g ) 的速度离心 10 分钟。
9. 丢弃上清液并将细胞颗粒重新悬浮在 20 mL 的 1 × PBS 中。
10. Stratalinker 2400 紫外线交联剂将每个细胞悬浮液放入培养皿（150 毫米× 15 毫米）和紫外线交联 2.5 分钟两次，间隔 2 分钟。
11. 将细胞转移到 50 mL Falcon 管中并以 2,900 rpm (291 × g ) 10 分钟，使用 Eppendorf 5810R。
12. 丢弃上清液并将细胞颗粒储存在-20 °C 。
B. 全细胞提取物 (WCE) 的制备
第 3 天：全细胞提取物制备和分级分离
1. 准备缓冲液 A 并在冰上放置 5-10 分钟。
2. °C取出细胞颗粒，立即加入 1 mL 缓冲液 A
3. 重新悬浮细胞并将其放入新鲜的 1.5 mL 微量离心机中。
4. 在每个细胞颗粒中加入相当于 0.5 mm 氧化锆珠的 500 μL。
5. °C 下使用vortexer打破细胞10 分钟。
6. 使用 Eppendorf 离心机 (5415R)在 4 °C下以 10,000 rpm (9,300 × g ) 将破碎的细胞离心 10 分钟。
7. 在新鲜的 1.5 mL 微量离心管中收集含有 RNA 蛋白混合物的上清液 (WCE)。
8. 加入 1 mL Buffer A 并重复步骤B 6 和B 7。收集上清液，并汇集到之前的 RNA-蛋白质混合物中。
9. 使用 Eppendorf 离心机 (5415R)在 4 °C下以 13,000 rpm (15,700 × g )离心 10 分钟，以澄清 RNA-蛋白质混合物。
10. 使用 Bio-Rad Bradford 试剂量化蛋白质浓度。
11. 使用 NanoDrop 分光光度计量化 RNA。
C. WCE 中提取生物素化 RNA 蛋白混合物
1. 在 1.5 mL 微量离心管中，将 100 µL 链霉亲和素琼脂糖树脂与 500 µL 缓冲液 A 混合，并使用 Eppendorf 离心机 (5415R)在 2,000 rpm (400 × g ) 下离心 1 分钟。重复此洗涤步骤至少五次。
2. 将 300 μg 的蛋白质从 WCE 添加到 100 μL 的洗涤链霉亲和素琼脂糖树脂中。
3. 通过将管倒置 3–4 次混合反应，并在 4 °C下在nutator 振动筛上孵育 1 小时。
4. 以 2,000 rpm（400 × g ) 使用 Eppendorf 离心机 (5415R) 离心 1 分钟。弃去上清液。
5. 用 500 µL Buffer A 重悬树脂并以 2,000 rpm（400 × g ) 使用 Eppendorf 离心机 (5415R) 离心 1 分钟。重复此洗涤步骤五次。
6. 中加入 50 μL 的 2 × SDS 加载染料。
7. °C 下加热样品 5 分钟，然后以 10,000 rpm（9,300 × g ) 使用 Eppendorf 离心机 (5415R) 离心 1 分钟。
8. 在 10% SDS-PAGE 凝胶上加载 15 μL 的上清液。
9. 在 120 V 的恒定电压下运行 SDS-PAGE 凝胶。
D. RNA结合蛋白的检测
1. 加载 ( i ) 蛋白质阶梯、(ii) 输入和 (iii) 在 SDS-PAGE 凝胶上拉下样品。在 120 V 的恒定电压下运行 SDS-PAGE 凝胶。
考马斯染色：
2. 使用固定溶液固定凝胶 1 小时。
3. 去除固定溶液并使用考马斯染色溶液染色凝胶 30 分钟。
4. 去除染色液，凝胶在脱色液中脱色过夜，用双蒸水洗涤 3-4 次。
银染：
5. 将凝胶在水中洗涤两次，每次 5 分钟。
6. 将凝胶在固定溶液中固定两次，每次 15 分钟。
7. 在 10% 乙醇中洗涤凝胶两次，每次 5 分钟。
8. 将凝胶在水中洗涤两次，每次 5 分钟。
9. 将凝胶在敏化剂溶液中孵育 1 分钟。
10. 在水中洗涤凝胶两次，每次 1 分钟。
11. 将凝胶在染色溶液中孵育 30 分钟。
12. 用水快速清洗凝胶两次，每次 20 秒。
13. 立即加入显影液并孵育直至出现蛋白质条带。
14. 加入终止液，轻轻洗涤，更换终止液，孵育 10 分钟。
E. 生物素化 RNA-蛋白质混合物的下拉和 RNA 分离
1. 在新的 1.5 mL 微量离心管中用 1 mL 缓冲液 A 在 2,000 rpm（400 × g ）下清洗200 μL 链霉亲和素琼脂糖树脂1 分钟。重复洗涤步骤至少五次。
2. 将 300 μg 的 RNA 从 WCE 添加到 200 μL 的洗涤链霉亲和素琼脂糖树脂中。
3. 通过将管倒置 3–4 次混合反应，并在 4 °C下在nutator 振动筛上孵育 1 小时。
4. × g ) 的速度降速1 分钟。分离颗粒 (P) 和上清液 (S) 分数。
5. × g )下清洗 P 分数1 分钟。重复洗涤步骤五次。
6. Trizol方法从 P 和 S 级分中分离 RNA （见下文）。此外，从 WCE（输入）中分离 RNA。
第 3 天：全细胞提取物制备和分级分离
7. 中加入 1 mL 的QIAzol试剂。通过上下移液彻底混合。
8. 在冰上孵育 5 分钟。
9. 彻底加入 200 μL 的氯仿和涡旋。
10. 在冰上孵育 2-3 分钟。
11. 以 12,000 rpm (13,400 × g ) 的速度减速 15 分钟。
12. 将含有 RNA 的水相转移到新试管中。
13. 在水相中加入 1 μL 的无 RNase 糖原（20 μg）。
14. 在水相中加入 500 μL 的异丙醇，通过倒置管轻轻混合，并在 -20 °C下孵育过夜。
15. × g ) 的速度降速20 分钟。
16. 弃去上清液，将沉淀重悬于 1 ml 75% 乙醇中。
17. 短暂涡旋并在 10,000 rpm (9,300 × g ) 下旋转 5 分钟。
18. 弃去上清液，将颗粒风干 5-10 分钟。
注意：不要用真空离心机干燥沉淀，也不要完全干燥沉淀，以确保 RNA 的完全溶解。
19. 将颗粒重新悬浮在 40 μL 的无 RNase 水中。
20. 将 RNA 在 70 °C中孵育3 分钟，然后立即转移到冰上。
21. 使用NanoDrop分光光度计量化 RNA。
22. 将 RNA 储存在 -80 °C或进行 cDNA 制备和 RT-PCR。
F. cDNA 制备和逆转录酶 (RT)-PCR
1. 甲醛凝胶电泳：添加将 0.7 g 琼脂糖加入 50 mL 的 1 × MOPS 缓冲液中并加热溶解。
2. 将 730 µL 甲醛和 1 µL 溴化乙锭 (10 mg/ml) 添加到凝胶中，轻轻混合，然后将凝胶倒入化学罩内的凝胶铸造托盘中。
3. RNA 样品制备和电泳：在 10 µL 中用 1 × MOPS 缓冲液取 1 µg RNA 样品，并与 2 µL 6 × RNA 上样染料混合。
4. 中将样品在 70 °C 下加热3 分钟，然后立即将其转移到冰上。
5. 将样品加载到甲醛凝胶上。以恒定电压 (80 V)在 1 × MOPS 缓冲液中运行凝胶。
6. 使用凝胶文档系统可视化凝胶中的 RNA。
7. DNase I 处理（用于 10 µL 反应）：在 10 µL 反应混合物中混合 10 µg RNA、1 µL 10 × DNase I 反应缓冲液和 1 µL DNase I。
8. 在 37 °C 下孵育10 分钟。
9. 在反应混合物中加入 1 μL 的 0.05 M EDTA（最终浓度为 5 mM）。
10. °C下加热10 分钟使反应失活。
11. cDNA 制备：制备两种主混合物（MM1 和 MM2），如下所示（表 1）：
表1. cDNA 制备
* 5'-CCCGCGACTATCTTACGCACTT-3'
12. 在 0.2 mL PCR 管中添加 9.5 μL 的 MM1 和 2 μL 的 RNA（1 μg/mL）。
13. 将反应混合物在 70 ° C 下孵育 3 分钟。
14. 立即将试管转移到冰上。
15. 将 5.4 μL 的 MM2 添加到反应混合物中，最终体积为 16.9 μL。
16. 将试管放入具有以下设置的热循环仪中。
温度时间循环次数
cDNA合成 50 ° C 45 min1
灭活 65 ° C 10 min1
17. cDNA 样品储存在 -80° C或进行 PCR 扩增。
G. 3'-BE-RMB和5'RD-RMB的PCR扩增
1. 使用以下引物扩增 3'-BE-RMB 和 5'-RD-RMB cDNA。
引物序列（5' 至 3'）
5'-ACGGAAAATGTACCAGAGTCGACGACG-3' 的正向引物
5'-CATAACAACCTCCTCCTCCCCCCCACCTACG-3' 的正向引物
5'-CCCGCGACTATCTTACGCACTT-3' 的反向引物
2. PCR反应：向20 µL 2 × PCR super mix中加入1 µL正向和反向引物和2 µL cDNA，用水定容至40 µL。
3. PCR 条件：PCR 循环程序如下：初始变性 95° C 2 min，然后 30 个循环变性：95°C 15 s，退火：55° C 30 s，延伸：72° C 30 s。
4. 凝胶电泳：在 1.5% 琼脂糖凝胶上加载 5 µL PCR 产物，并在 110 V 下运行 30 分钟。通过紫外光可视化凝胶中的 DNA 条带。
H. 用于质谱分析的生物素化 RNA 结合蛋白消化和净化
1. × SDS 加载染料中）取出剩余的 45 μL 蛋白质-RNA 混合物，并在 1.5 mL 微离心管中用MilliQ水将其稀释至 900 μL。
2. 立即加入 100 μL 的 100% TCA 溶液，混合并在冰上孵育 30 分钟。
3. 加入 400 μL 的冷丙酮，混合并在冰上再孵育 30 分钟。
4. 以 16,000 × g离心10 分钟使沉淀的蛋白质沉淀。
5. 用 P1000 移液器小心丢弃 1，200 μL 的上清液。然后，使用带有凝胶加载尖端的 P200 移液器去除剩余的 200 μL 上清液，而不会干扰在远离离心机转子中心的管侧形成的微小颗粒。值得注意的是，如果回收的蛋白质 <2–5 µg，则看不到任何颗粒。
6. 加入 800 μL 的冷丙酮、涡旋和离心机，以 16,000 × g离心8 分钟。
7. 与步骤 5 一样分两个阶段去除上清液，但 P1000 仅 700 μL，P200 移液器仅 100 μL。
8. 加入 800 μL 的冷丙酮、涡旋和离心机，以 16,000 × g离心8 分钟。
9. 按照第 7 步去除上清液，将管子打开以进行空气染色 5-30 分钟（将管子侧放以防止任何空气滴污染）。
10. 每当样品含有 10-80 µg 总蛋白时，将颗粒溶解在 50 mM AMBIC、pH 8.5 中的 15 µL 8 M 尿素中。对于蛋白质 <10 µg 的样品，在所有步骤中使用一半的体积。对于蛋白质含量 >100 µg 的样品，将含有 8 M 尿素的样品溶解在 50 mM AMBIC、pH 8.5 中，最终浓度为 4 µg/µL，然后取 15 µL (60 µg) 该溶液用于下一步。
11. 如果颗粒在室温 (RT) 下 30 分钟内未完全溶解，则继续下一步以通过减少半胱氨酸二硫键来促进溶解。
12. 在 25 mM AMBIC、pH 8.5 和 42.5 μL 的 25 mM AMBIC、pH 8.5 中添加 2.5 μL 的 25 mM DTT。
13. 将试管在 56°C 下孵育 15 分钟。
14. 冷却至 RT，在 25 mM AMBIC 中加入 3.0 μL 的 55 mM 碘乙酰胺 (IAA) 15 分钟（烷基化）。
15. 通过添加 8 μL 的 25 mM DTT 来终止烷基化反应。考虑到含有 10-80 µg 蛋白质的样品，总体积为 71 µL [15 µL 8 M 尿素（步骤 10）、2.5 µL 25 mM DTT 和 42.5 µL 25 mM AMBIC（步骤 12）、3.0 µL 55 mM IAA（步骤 14）和 8 µL 25 mM DTT（步骤 15）]。
16. 在 25 mM AMBIC 中制备胰蛋白酶/Lys-C 蛋白酶混合物， pH 8.5，含有等量 (100 ng/µL) 的胰蛋白酶（测序级修饰胰蛋白酶）和 Lys-C（赖氨酰内肽酶）。以 1:30 的比例将胰蛋白酶-赖氨酸-C 蛋白酶混合物添加到蛋白质底物中（例如，30 µg 蛋白质底物将含有 1 µg 蛋白酶混合物）。
17. 使用 25 mM AMBIC，pH 8.5，使总体积达到 100 μL（蛋白质底物 <10 μg 的样品为 50 μL）。
18. 在 37°C 下孵育过夜。
19. 用 2.5% TFA 终止消化至 0.3% 最终浓度（酸化）。
20. 在加载到仪器之前执行固相肽提取（根据制造商的协议）。安捷伦的 Bond Elute OMIX C18（10–100 µL；80 µg 容量）移液器吸头是首选，因为它具有结合能力、少量底物的重现性和易用性。
21. 干燥干净的肽样品，并在 0.1% 甲酸中重组至 ±0.5–1 µg/µL 最终肽浓度。
22. 注入 0.5 至 2 μL 的样品进行纳米 LC-MS/MS 分析，具体取决于样品的复杂性和使用的仪器。
23. 在混合线性离子阱-轨道阱质谱仪上分析样品，其中离子阱中 MS/MS 识别的速度与轨道阱中前体肽的高质量精度相结合。还建议使用用于色谱反相分离的纳流系统以获得更高的灵敏度。
24. 如下设置离子阱-Orbitrap：MS1 分辨率：120–240k，质量范围：350–1,600 m/z，CID 或 HCD 型 MS/MS，MS1 扫描中检测到的 20–30 个最强离子，有限冗余动态排除和 MIPS 过滤器模式打开。
25. 将原始数据文件转换为mgf 。使用 Trans Proteomic Pipeline (Seattle Proteome Center, Seattle, WA) 的文件格式并使用Mascot搜索引擎 (Matrix Science) 进行搜索，或使用 Proteome Discoverer 套件 (Thermo Fisher Scientific) 无需文件转换。
26. 使用具有静态半胱氨酸氨基甲酰甲基化和动态蛋氨酸氧化的Mascot搜索引擎，以及天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺作为可能的修饰。
27. 将肽耐受性设置为 10ppm，将片段质量耐受性设置为 0.6Da（离子阱仪器）。
代表性数据：用于验证系统的实验细节在原始发表的研究文章中提供（ Ghosh等人，2021 年）。简而言之，我们发现了一种以前未鉴定的蛋白质，称为 Pal2，它与 3'-BE-RMB 结合。电泳迁移率变动分析进一步证实了这一点。可以通过以下链接访问结果： https ://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34035143/ 。
食谱
1. 环保署
试剂数量
细菌蛋白胨 20 克
酵母提取物 10 克
H 2 O 960毫升
高压灭菌
添加 50 mL 的 40% 葡萄糖
2. 含或不含尿嘧啶或亮氨酸的合成完全 (SC) 培养基
试剂数量
含硫酸铵的酵母氮碱（不含氨基酸） 6.7 g
不含尿嘧啶或亮氨酸的氨基酸混合物（自制） 2 克
H 2 O 960毫升
高压灭菌
添加 50 mL 的 40% 葡萄糖
3. 1 × PBS pH 7.4
138 毫米氯化钠
2.7 毫米氯化钾
10 毫米钠2 HPO 4
1.8 毫米 KH 2 PO 4
用 HCl 调节 pH 至 7.4
4. 缓冲器 A
20 mM Tris-HCl，pH 7.4
200 mM KCl （氯化钾）
5 mM MgOAc （醋酸镁）
1 mM DTT（二硫赤藓糖醇）
1 mM PMSF（苯甲基磺酰氟）
1 µg/mL 抑肽酶
1 µg/mL胃酶抑素A
蛋白酶抑制剂 Tablet mini（每 10 mL 1 片）
0.1% 海卫一-X-100
5. 考马斯染色固定液
50% 甲醇
10% 冰醋酸
6. 染色液考马斯染色
0.1 % 考马斯亮蓝-R250
50 % 甲醇
10% 冰醋酸
7. 脱色液考马斯染色
40 % 甲醇
10 % 冰醋酸
8. 1 × TE 缓冲器
10 mM tris-HCl pH 7.5
1.0 毫米 EDTA pH 8.0
9. 10 × MOPS 缓冲器
0.2 M 拖把，pH 7.0
20 毫米乙酸钠
10 mM EDTA pH 8.0
将 41.8 g MOPS (Sigma) 溶解在 700 mL 的无菌水中，并用 2 N NaOH 将 pH 值调节至 7.0。
加入 20 mL 的 1 M 醋酸钠、20 mL 的 0.5 M EDTA pH 8.0，并将体积调节至 1,000 mL。
在室温下储存缓冲液
10. 6 × RNA 上样染料
95% 甲酰胺
0.025% 溴酚蓝
0.025% 二甲苯氰FF
5 mM EDTA pH 8.0
在室温下储存。
11. 银染定影液
30% 乙醇
10% 醋酸溶液
12. 银染增感剂溶液
50 μL敏化剂（ Pierce TM银染试剂盒）溶于 25 mL 水中
13. 银染染色液
0.5 mL 增强剂（ Pierce TM银染试剂盒）在 25 mL 染色剂中
14. 银染显影液
0.5 mL Enhancer（ Pierce TM银染试剂盒）在 25 mL 显影液中
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院 (NIGMS) (1R01GM124183) 和 UWM 研究生院(发现和创新资助)的资助。该协议源自 Ghosh 等人发表的原始研究文章。 (2021) 在科学信号( https://doi.org/10.1126/scisignal.aaz4401 )。
利益争夺
作者声明他们没有利益冲突。
参考
1. Aragon, T., van Anken, E., Pincus, D., Serafimova, IM, Korennykh, AV, Rubio, CA 和 Walter, P. (2009)。靶向内质网应激信号位点的信使 RNA。自然457（7230）：736-740。
2. Balcerak, A.、Trebinska-Stryjewska, A.、Konopinski, R.、Wakula, M. 和 Grzybowska, EA (2019)。 RNA-蛋白质相互作用：无序、兼职和垃圾有助于真核生物的复杂性。打开 Biol 9（6）：190096。
3. Baron-Benhamou, J., Gehring, NH, Kulozik, AE 和 Hentze, MW (2004)。使用 lambdaN 肽将蛋白质与 RNA 联系起来。方法 Mol Biol 257：135-154。
4. Bevilacqua, PC, Ritchey, LE, Su, Z. 和 Assmann, SM (2016)。 RNA二级结构的全基因组分析。 Annu Rev Genet 50：235-266。
5. 布鲁尔，G. (1991)。一种富含 A + U 元素的 RNA 结合因子调节 c-myc mRNA稳定性体外。摩尔细胞生物学11（5）：2460-2466。
6. Castello, A., Horos, R., Strein, C., Fischer, B., Eichelbaum, K., Steinmetz, LM, Krijgsveld, J. 和 Hentze, MW (2013)。通过相互作用组捕获对 RNA 结合蛋白的全系统鉴定。国家协议8（3）：491-500 。
7. Cocozaki, AI, Ghattas, IR 和 Smith, CA (2008)。噬菌体 P22 抗终止 boxB 的序列要求很复杂，并且与 lambda 的序列要求重叠。细菌杂志190（12）：4263-4271。
8. Cox, JS, Shamu, CE 和 Walter, P. (1993)。编码内质网驻留蛋白的基因的转录诱导需要跨膜蛋白激酶。细胞73（6）：1197-1206。
9. Djebali, S., Davis, CA, Merkel, A., Dobin, A., Lassmann, T., Mortazavi, A., Tanzer, A., Lagarde, J., Lin, W., Schlesinger, F. (2012 ）。人类细胞中的转录景观。自然489（7414）：101-108。
10. Fan, XC 和 Steitz, JA (1998)。 HuR（一种核质穿梭蛋白）的过表达增加了含有 ARE 的 mRNAs的体内稳定性。 EMBO J 17（12）：3448-3460。
11. Gerstberger, S.、Hafner, M. 和 Tuschl, T. (2014)。人类 RNA 结合蛋白的普查。 Nat Rev Genet 15（12）：829-845。
12. Ghosh, C., Uppala, JK, Sathe, L., Hammond, CI, Anshu, A., Pokkuluri, PR, Turk, BE 和 Dey, M. (2021)。蛋白激酶 Kin1 和 Kin2 对 Pal2 的磷酸化可调节酵母中未折叠蛋白反应中的 HAC1 mRNA 剪接。科学信号14（684）。
13. Gonzalez, TN, Sidrauski, C., Dorfler, S. 和 Walter, P. (1999)。未折叠蛋白反应通路中非剪接体 mRNA 剪接的机制。 EMBO J 18（11）：3119-3132。
14. Hetze, MW, Castello, A., Schwarzl, T. 和 Preiss, T. (2018)。一个勇敢的 RNA 结合蛋白新世界。 Nat Rev Mol 细胞生物学19（5）：327-341。
15. Hudson, WH 和 Ortlund, EA (2014)。结合 DNA 和 RNA 的蛋白质的结构、功能和进化。 Nat Rev Mol Cell Biol 15（11）：749-760。
16. Jazurek, M.、Ciesiolka, A.、Starega-Roslan, J.、Bilinska, K. 和 Krzyzosiak, WJ (2016)。识别与特定 RNA 结合的蛋白质 - 专注于简单的重复扩增疾病。核酸研究44（19）：9050-9070。
17. Kastelic, N. 和 Landthaler, M. (2017)。哺乳动物细胞中的 mRNA 相互作用组捕获。方法126：38-43。
18. Katsamba, PS, Myszka, DG 和 Laird-Offringa, IA (2001)。两个功能不同的步骤介导 U1A 蛋白与 U1 发夹 II RNA 的高亲和力结合。生物化学杂志 276（24）：21476-21481 。
19. Keene, JD, Komisarow, JM 和 Friedersdorf, MB (2006)。 RIP-Chip：从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物的 mRNA、microRNA 和蛋白质成分。国家协议1（1）：302-307 。
20. Kertesz, M., Wan, Y., Mazor, E., Rinn, JL, Nutter, RC, Chang, HY 和 Segal, E. (2010)。酵母中 RNA 二级结构的全基因组测量。自然467（7311）：103-107。
21. Lai, WS, Carballo, E., Strum, JR, Kennington, EA, Phillips, RS 和 Blackshear, PJ (1999)。有证据表明三四脯氨酸与富含 AU 的元素结合并促进肿瘤坏死因子 α mRNA 的去腺苷酸化和去稳定化。摩尔细胞生物学19（6）：4311-4323。
22. Mori, K., Ma, W., Geting, MJ 和 Sambrook, J. (1993)。从 ER 到细胞核的信号传导需要具有 cdc2+/CDC28 相关激酶活性的跨膜蛋白。单元格74（4）：743-756。
23. Muller-McNicoll, M. 和 Neugebauer, KM (2013)。细胞如何获取信息：mRNA-蛋白质复合物的动态组装和功能。 Nat Rev Genet 14（4）：275-287。
24. Otsuka, H.、Fukao, A.、Funakami, Y.、Duncan, KE 和 Fujiwara, T.（2019 年）。 AU-Rich 元素结合蛋白翻译控制的新证据。前基因10：332。
25. Ramanathan, M., Porter, DF 和 Khavari, PA (2019)。研究 RNA-蛋白质相互作用的方法。 Nat 方法16（3）：225-234。
26. Ruegsegger, U.、Leber, JH 和 Walter, P. (2001)。在诱导未折叠蛋白反应后，通过细胞质剪接释放通过远程碱基配对阻断 HAC1 mRNA 翻译。单元格107（1）：103-114。
27. Sanchez de Groot, N.、Armaos, A.、Grana-Montes, R.、Alriquet, M.、Calloni, G.、Vabulas, RM 和 Tartaglia, GG (2019)。 RNA 结构驱动与蛋白质的相互作用。国家通讯10（1）：3246。
28. Sathe, L.、Bolinger, C.、Mannan, MA、Dever, TE 和 Dey, M. (2015)。有证据表明内含子和 mRNA 前导序列之间的碱基配对相互作用抑制酵母中 HAC1 mRNA 翻译的启动。 J Biol Chem 290（36）：21821-21832。
29. Srivastava, A.、Yesudhas, D.、Ahmad, S. 和 Gromiha, MM (2021)。使用分子动力学模拟了解蛋白质-RNA 复合物中的无序到有序的转变。 J Biomol Struct Dyn ：1-11。
30. Uszczynska-Ratajczak, B.、Lagarde, J.、Frankish, A.、Guigo, R. 和 Johnson, R. (2018)。迈向人类长链非编码 RNA 转录组的完整图谱。 Nat Rev Genet 19（9）：535-548。
31. Vasudevan, S. 和 Steitz, JA (2007)。富金元素介导的 FXR1 和 Argonaute 2 对翻译的上调。单元格128（6）：1105-1118。
32. Wan, Y., Qu, K., Zhang, QC, Flynn, RA, Manor, O., Ouyang, Z., Zhang, J., Spitale, RC, Snyder, MP, Segal, E.等。（2014）。人类转录组中 RNA 二级结构的景观和变异。自然505（7485）：706-709。
33. Yoon, JH, Srikantan, S. 和 Gorospe, M. (2012)。 MS2-TRAP（MS2 标记的 RNA 亲和纯化）：标记 RNA 以识别相关的 miRNA。方法58（2）：81-87。