材料和试剂
1.成年斑马鱼（Tübingen 品系）
2.亚克力隔板（ Toyuto ，目录号： B07BF477K1）
3.补充有 60 mg/L 速溶海盐的反渗透纯化水（Aquariums Systems，目录号： 210083 ）
4.彩色卡片（白色亚克力定制卡片，带有绿色/红色胶膜）
5.培养的红虫（Ocean Nutrition，目录号： I120E00）
6.注射器12 mL（Terumo，目录号： SS-10S ）
7.航空管（Marina，目录号： A1130）
设备
1.29 × 14 × 17 玻璃缸（定制水族箱）
2.半径向迷宫（定制水族箱，内部设计；详情请参阅程序）
3.行为记录相机（HP，目录号： HD 4310）
4.两个鱼网（Marina，目录号： 11274、11276；有关更多详细信息，请参见程序）
软件
1.Eyeline 视频监控系统（NCH 软件，2.06 版）
2.Observer XT（诺德斯技术，第 9 版）
程序
A.通过程序养鱼（第 0 天）
一般描述：在行为协议开始前的 24 小时内，鱼（参见材料和试剂 #1）保持在半隔离条件下（即存在来自同种的嗅觉和视觉提示），以尽量减少相关的任何压力通过个体测试（斑马鱼是一种高度社会化的物种）。隔离罐由 6 L罐（图 1A，参见设备 #1）组成，并由透明和穿孔的隔板（图 1B，参见材料和试剂 #2）分隔。
1.在 28 °C ，750下用 5 L 系统水（参见材料和试剂 #3）填充隔离罐 μ S和 pH 7.0。这些水质参数在整个过程中得到保持。隔离罐的系统水每天更新。
2.选择将暴露于判断偏差测定的实验斑马鱼。
3.将选定的鱼放在隔离罐的各个隔间中（每个隔离罐四条鱼）。鱼在隔离池中被剥夺食物。

图 1. 鱼壳材料。
(A)在协议期间鱼被安置的隔离罐。 (B)隔离罐中使用的透明穿孔分隔器，以便允许来自同种动物的视觉和嗅觉线索。
B.准备行为仪器（第 1 天）
一般描述：行为装置（参见设备 #2）由白色丙烯酸制成的半臂径向迷宫（图 2A）组成。它包含可移动的彩色卡片（图 2B；参见材料和试剂 #4 ），放置在每条手臂的末端。包含颜色提示的手动断头台门（图 2C）将起始盒与径向迷宫的臂分开。两个参考（训练）臂 [正 (P) 和负 (N)] 彼此成 180 °放置，并配备全彩色卡片（绿色或红色）。三个模糊（测试）臂 [近正 (NP)、模糊 (A) 和近负 (NN)]位于两个参考臂之间的等距角（每个相隔 45 ° ），并包含混合色卡（绿色和红色），颜色比例分别为 3:1、1:1 和 1:3。每个臂的位置也被视为提示刺激（除了颜色提示），因为中央测试臂 (A) 位于 P 和 N (90°) 之间的中间，而其他两个 (NP 和 NN) 位于中间A 和每个参考臂（分别为 45 °和 135°）。研究人员在窗帘后面进行操作，因此在行为分析过程中，实验斑马鱼看不到它们。鱼行为的可视化和记录由连接到头顶摄像机的个人计算机启用（参见设备#3）。判断偏差分析由三个阶段组成，连续三天进行：习惯化（第 1 天）、训练（第 1 天和第 2 天两次）和测试（第 3 天）阶段。
1.°C 、 750 μS和 pH 7.0下用 15 L 的系统水填充行为装置。

图 2. 行为仪器。
(A)显示两个参考位置 [例如，正面/奖励 (A) 和负面/厌恶 (E)] 和三个模棱两可的位置 [例如。 , 近正 (B), 模棱两可 (C) 和近负 (D)]。 (B)可移动的彩色卡片放置在每条手臂的末端。 (C)手动操作的断头台门，将起始箱与每个臂连接起来。
C.习惯阶段（第 1 天）
一般描述：斑马鱼在此阶段第一次单独暴露于行为装置。每次试验都会记录门打开和鱼离开手臂之间的时间（一旦显示特定结果）。
1.使用运输网将个体从其隔离罐转移到行为装置（参见设备#4）。行为设置的所有门都在会话开始时打开。
注意：重要的是有两个大小和颜色不同的网（图 3），以避免在坦克之间运输鱼被错误地与使用同一个网的惩罚联系起来。较大的黑色网用于鱼的运输（运输网），较小的绿色和白色网用于惩罚（惩罚网）。

图 3. 判断偏差分析过程中使用的网络。
2.让鱼探索整个水箱 10 分钟。
3.10 分钟后，关闭所有门，将鱼放入带有运输网的实验装置的起始箱中。
4.随机分配左臂或右臂作为正 (P) 训练的位置。
5.随机选择全绿色或全红色作为正 (P) 训练的颜色。将全彩色卡片（绿色或红色）添加到先前选择的手臂。
6.应用 1 分钟的试验间间隔 (ITI)。
7.手动打开位于 P 臂入口处的断头台门，让鱼进入臂。
8.当鱼进入手臂时，在手臂末端使用手动分配器（图 4）提供1 毫米的红虫（参见材料和试剂 #5）。手动分配器由一个 12 mL 注射器（参见材料和试剂 #6）和一个 3 mm 透明 PVC 管（参见材料和试剂 #7）组成。分配器允许研究人员在此过程中看不到实验斑马鱼。

图 4. 判断偏差分析过程中使用的手动分配器。
9.连续四次执行步骤 C7-C8，两次试验之间有 1 分钟的 ITI。
10.用运输网将鱼放回隔离池。
11.个人之间换水。
D.培训阶段 1（第 1 天）
一般描述：习惯后，连续两天对鱼进行辨别任务训练。一旦每条实验鱼的习惯阶段结束（阶段间间隔为 4-6 小时），就会执行训练阶段的第 1 阶段。该阶段由伪随机序列（即， P P N N PNPN）中的总共八个条目[四个正（P）和四个负（N）]组成。在此会话期间，每次试验只打开一扇门，与 P（奖励）或 N（厌恶）结果相关的一扇门（图 5）。训练臂（P 和 N）的位置（即，右或左）和相关的颜色提示（即，红色或绿色）必须在个体之间进行平衡。每次试验都会记录门打开和鱼离开手臂之间的时间（一旦显示特定结果）。
1.用运输网将一个人从其隔离罐转移到行为装置。行为设置的所有门都在会话开始时关闭。
2.将鱼放在实验装置的起始框中 1 分钟。
3.手动打开位于 P 臂入口处的断头台门，让鱼进入臂。
4.提供1 毫米的红虫。
5.让鱼吃掉那块食物，然后自己回到起始箱。关闭 P 臂的断头台门并应用 1 分钟的 ITI。
6.手动打开位于负 (N) 臂（包括第二种颜色提示；绿色或红色）入口处的断头台门，让鱼进入臂。
7.当鱼进入N 臂时，通过在惩罚网中捕捉鱼并轻轻摇晃 10 秒，执行负面结果（惩罚）。
8.让鱼返回起始箱并关闭 N 臂的断头台门。
9.以伪随机序列（即P P N N PNPN ）连续执行步骤 D3 – D5 或 D6 – D8 总共八次[四个正 (P) 和四个负(N)]。
10.用运输网将鱼放回隔离池。
11.个人之间换水。

图 5. 训练阶段的示意图。
(A)在开始每次试验之前，将鱼放在实验装置的起始箱中。 (B)经过 1 分钟的试验间隔 (ITI), 位于 P 臂入口处的断头台门被手动打开, 让鱼进入手臂并获得积极的结果 (食物奖励; 1 毫米片红虫），它在手臂末端交付。一旦试验结束，鱼就可以自行返回到起始框。 (C) ITI 额外 1 分钟后，手动打开位于 N 臂入口处的断头台门，让鱼进入手臂并接受负面结果（惩罚；鱼被困在 N 臂内的网中N 臂在网中轻轻摇动 10 秒）。八个条目[四个正 (P) 和四个负 (N)] 以伪随机序列 (即P P N N PNPN ) 执行。
E.培训阶段 2（第 2 天）
一般描述：培训阶段的第二节课在第 2 天进行，与第一节课类似。
1.执行训练阶段课程 1 的步骤 D1 - D11（参见程序的D部分）。
F.测试阶段（第 3 天）
概述：测试环节包括六个预训练试验（即P P N N PN），然后是提示测试的介绍。每个提示测试都穿插有一个 P 和一个 N 结果呈现（即，训练试验）。预训练课程和穿插的训练试验都包括在尝试中通过潜在地增强短期记忆性能，确保快速准确地识别任务。事实上，鱼学习任务的时间缩短了，学习任务的鱼的数量增加了（我们的试点实验的个人观察）。因此，测试序列总共由 19 次试验组成（例如， P P N N PN P P N N PN NP PN A PN NN ；以粗体显示提示测试）。提示测试中没有增强物。三个模棱两可的线索的呈现顺序在个人之间是平衡的。在此会话期间，每次试验仅打开一扇门，P（奖励）或 N（厌恶）结果之一（图 6）。每次试验都会记录门打开和鱼离开手臂之间的时间（一旦显示特定结果）。
1.用运输网将一个人从其隔离罐转移到行为装置。行为设置的所有门都在会话开始时关闭。
2.将鱼放在实验装置的起始框中 1 分钟。
3.手动打开位于 P 臂入口处的断头台门，让鱼进入臂。
4.提供1 毫米的红虫。
5.让鱼吃掉那块食物，然后自己回到起始箱。关闭 P 臂的断头台门，等待 ITI 1 分钟。
6.手动打开位于负 (N) 臂（包括第二种颜色提示；绿色或红色）入口处的断头台门，让鱼进入臂。
7.当鱼进入N 臂时，通过在惩罚网中捕捉鱼并轻轻摇晃 10 秒，执行负面结果（惩罚）。
8.让鱼返回起始箱并关闭 N 臂的断头台门。应用 ITI 1 分钟。
9.以伪随机序列（即P P N N PN ；预训练试验）总共连续六次执行步骤 F3 – F5 或 F6 – F8 [三个正 (P) 和三个负(N)] .在试验之间应用 1 分钟的 ITI。
10.手动打开位于 P 臂入口处的断头台门，让鱼进入臂（阳性提示测试）。没有提供加固。应用 ITI 1 分钟。
11.执行步骤 F3 – F5 和 F6 – F8 [一个正 (P) 和一个负 (N)] （即PN ；穿插训练试验）。在试验之间应用 1 分钟的 ITI。
12.手动打开位于 N 臂入口处的断头台门，让鱼进入臂（负提示测试）。没有提供加固。应用 ITI 1 分钟。
13.执行步骤 F11。
14.手动打开位于 NP 臂入口处的断头台门，让鱼进入臂（接近阳性提示测试）。没有提供加固。应用 ITI 1 分钟。
15.执行步骤 F11。
16.手动打开位于 A 臂入口处的断头台门，让鱼进入臂（模糊提示测试）。没有提供加固。应用 ITI 1 分钟。
17.执行步骤 F11。
18.手动打开位于 NN 手臂入口处的断头台门，让鱼进入手臂（Near Negative cue test）。没有提供加固。应用 ITI 1 分钟。
19.用运输网将鱼放回隔离池。
20.个人之间换水。
图 6. 测试阶段的示意图。
记录延迟的过程包括(A)在断头台门打开时开始计时和(B)在鱼进入目标手臂时停止计时。 (C)记录每次测试试验(P、NP、A、NN 和 N)进入目标臂的延迟时间 (最长 60 秒)。测试序列总共由 19 个试验组成（例如， P P N N PN P P N N PN NP PN A PN NN ；测试试验以粗体显示）。 (D)预计每次测试试验的潜伏期存在显着差异，鱼进入 P 臂的潜伏期较低，并逐渐向 N 附近的颜色提示/位置增加。
数据分析
记录进入目标臂的延迟（最长 60 秒）（参见软件 #1），并使用多事件记录器软件（参见软件 #2）对每次探测试验进行分析。在 P 和 N 之间的延迟中显示差异 <20 s 的鱼（即，在 P 和 N 测试之间的区分失败）被排除在后验分析之外。在试点实验中，我们观察到学习刺激测试（P 和 N）之间的延迟反应一致且分化良好，显示 P 和 N 之间的平均延迟差异为 47.9 ± 6.1 s。我们已经建立了一个 20 秒的阈值，以获得一个足够宽的“窗口”，以促进对模糊刺激的准确分类，因为狭窄的范围可能会削弱个体的分类。在我们之前的研究中（ Espigares 等。 , 2021)，斑马鱼进入不同臂（P、NP、A、NN 和 N）的潜伏期有显着差异，这反映了泛化反应，鱼进入 P 的潜伏期较低，潜伏期逐渐增加颜色提示/位置接近 N。如果我们假设每种全色（即绿色或红色）预测特定结果（即正或负；正如全色训练所学的那样），我们可以声称对模棱两可的线索的反应与颜色比例有关，而不是只识别一种颜色。重要的是，A 刺激不应该对 P 或 N 有任何偏差（即始终使用固定的 1:1 颜色比例），因为这是鱼在乐观/悲观维度中分类的基础。对于每条鱼，判断偏差分数 ( JBS ) 是根据进入每条鱼的 P、N 和A臂的延迟 (L) 计算得出的 [JBS = (L A –L P )*100/(L N –L P )]。 JBS 低于 50 表示对模糊线索的总体积极判断和“乐观”解释（鱼将模糊刺激视为积极刺激），而较高的 JBS值表示负（悲观）期望偏差（鱼将模糊刺激视为一个负面的）。然而，选择表型分布的极端（例如， JBS的上四分位数和下四分位数）将提高检测表型之间行为和/或生理差异的能力，因为斑马鱼中的 JBS 属于双峰分布（未发表的数据）。
笔记
由于联想学习成功执行辨别任务的基本要求，压力鱼以及学习表型受损的转基因或突变系可能不适合执行判断偏差测定。此外，在每个会话期间交付的食物量（即， 1 毫米红虫片）旨在避免鱼的饱腹感。事实上，我们之前的结果表明，鱼消耗了整个检测过程中提供的所有食物奖励。在试验的任何时候都没有完全消耗食物奖励的鱼应该被排除在实验之外。
致谢
这项工作得到了 BIAL 基金会的资助。 130/12 授予 RFO，并获得Fundação para a Ciência ea Tecnologia的资助（FCT、PTDC/BIA-COM/31010/2017 授予 FE 和 RFO）。 FE 得到了 Horizon 2020 框架计划(H2020) 下的 Marie Skłodowska -Curie Actions - 个人奖学金 (H2020-MSCA-IF/703285) 的支持。作者感谢 Instituto Gulbenkian de Ciência （葡萄牙）的鱼类设施平台用于动物护理。作者还感谢 Lara Chapuis对图 5 和图 6 中的插图。该协议改编自以前的工作（ Espigares 等人，2021）。
利益争夺
作者声明他们没有相互竞争的利益。
伦理
所有程序均按照机构和国家法规和指南进行，由 Instituto Gulbenkian de Ciência伦理委员会审查，并获得葡萄牙主管当局 ( Direcção ) 的批准 Geral de Alimentação e Veterinária ;许可证号0421/000/000/2019）。
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