材料和试剂
1.6孔板（Corning，目录号：3516）
2.Corning HYPERFlask M 细胞培养容器（Corning，目录号： 10030）
3.Corning ® 250 mL PP 离心管（Corning，目录号： 430776）
4.白色 96 孔板，透明底部（PerkinElmer，目录号： 6005181）
5.白色 384 孔板，透明底部（PerkinElmer，目录号： 6007480）
6.铝箔_
7.用于 96 和 384 孔板的白色粘合剂底部密封件（PerkinElmer，目录号：6005199）
8.HEK293T 细胞（ATCC# CRL-3216， RRID:CVCL _0063）
9.化学感受态 DH5α 细胞（New England Biolabs（NEB），目录号：C2987H）
10.青霉素/链霉素（PS）（Thermo Fisher，目录号： 10378016）
11.胰蛋白酶（Thermo Fisher，目录号： 25300054）
12.DMEM（赛默飞世尔，目录号：10566016）
13.OptiMEM培养基（Thermo Fisher，目录号： 31985070）
14.Lipofectamine 2000（Thermo Fisher，目录号： 11668019）
15.胎牛血清（FBS；Sigma，目录号：F2442）
16.磷酸盐缓冲盐水（PBS；Thermo Fisher，目录号： 10010023）
17.RLuc8 构建体（参见表 1， Bery等人免费提供的序列，2018 ）
18.GFP 2构建体（见表 1， Bery等人免费提供的序列，2021 ）
19.LMO2 竞争者的质粒（见表 1，序列可在贝里等人，2018 ）
20.OptiMEM无红苯酚（Thermo Fisher，目录号： 11058021）
21.Coelenterazine 400a（Cayman Chemicals，目录号： 16157）。如果不复溶，请在 -20°C 下储存。
22.100％乙醇（Sigma，目录号：32221-M54）
23.二甲基亚砜（DMSO；Sigma，目录号：D2650）
24.QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，目录号：28704）
25.琼脂糖（Sigma，目录号：A9539-500G）
26.限制酶： NotI -HF 、 XbaI 、 PspOMI （NEB，目录号：分别为 R3189S、R0145S 和 R0653S）
27.Vent DNA聚合酶（NEB，目录号：M0254S）
28.T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202S）
29.氨苄青霉素（Sigma，目录号：A0166）
30.pEF-myc-cyto ，空质粒（Invitrogen，目录号： V89120）
31.10,720 种化合物的内部库（包括来自 BioFocus 的 6991 种化合物和来自ChemBridge的 3729种化合物）。储存于 -20°C
32.BRET 培养基（见食谱）
33.BRET底物（见食谱）

表1. 可用于基于 BRET2 的 LMO2 生物传感器的供体和受体结构列表
RLuc8 供体结构GFP 2受体结构竞争对手构造
LMO2iDAb LMO2 WTiDAb LMO2-myc（阳性对照， Bery等人，2018 年）
iDAb LMO2 S55A/T107A
( iDAb LMO2分米)iDAb RAS- myc （阴性对照， Bery等人，2018 年）
iDAb LMO2 S28G/H31G/S55A/T107A
( iDAb LMO2 dm1 )
iDAb LMO2 S55A/E102A/T107A
( iDAb LMO2 dm2 )
iDAb LMO2 S28G/H31G/S55A/E102A/T107A
( iDAb LMO2 dm3 )
iDAb LMO2 S28G/H31G/S55A/S103A/T107A
( iDAb LMO2 dm4 )
iDAb LMO2 S55A/E102A/S103A/T107A
( iDAb LMO2 dm5 )
iDAb LMO2
S28G/H31G/S55A/E102A/S103A/T107A
( iDAb LMO2 dm6 )
设备
1.血细胞计数器（Sigma，目录号：Z359629 ）
2.SpeedVac仪器（任何供应商）
3.Janus 液体处理工作站 (PerkinElmer)
4.Echo 声学分配器（ Labcyte ）
5.CLARIOstar酶标仪，包括发光模块（BMG Labtech）
6.PHERAstar FSX 酶标仪（BMG Labtech）
7.细胞培养 37°C 培养箱（任何供应商）
8.离心机（任何供应商）
软件
1.MARS 数据分析（BMG Labtech ，包含在酶标仪中）
程序
A.iDAb LMO2突变体的构建（去成熟过程）
为了建立一个基于 BRET 的生物传感器，能够监测可以被小分子取代的 LMO2-iDAb LMO2 相互作用，我们首先构建了iDAb LMO2 的各种突变体。这些突变位于参与 LMO2 结合的关键残基上，并且位于iDAb的互补决定区 (CDR) 上。在此，目的是充分降低相互作用（即，去成熟过程）以促进其被化学文库中的化合物抑制。我们使用 pEF-GFP 2 -iDAb LMO2 dm -myc（即iDAb LMO2 S55A /T107A）作为模板（Bery等人，2018）。
1.通过聚合酶链反应 (PCR) 定点诱变产生 pEF-GFP 2 -iDAb LMO2 S55A/E102A/T107A-myc 载体：
a.× PCR 缓冲液，使用iDAbPspOMIFor和 E102ARev 引物以及 E102AFor 和MyctagstopXbaIRev引物（参见表 2）对iDAb LMO2 S55A/T107A-myc 进行PCR 扩增, 2 µL dNTP 混合物（各 10 mM）、0.4 µL MgSO 4 、0.6 µL DMSO、0.5 µL 每个 F&R 引物 (50 µM)、1 µL Vent DNA 聚合酶和 39 µL dH 2 O]。
b.PCR：在 95°C 下放置 5 分钟，然后进行 35 个循环：94°C 1 分钟、60°C 1 分钟和 72°C 1 分钟，然后是 72°C 的单个延伸步骤 10分钟。退火温度因引物而异。这可以在线检查： https ://tmcalculator.neb.com/#!/main 。
c.运行在 1% 琼脂糖凝胶（120 V，30 分钟）上生成的两个 PCR 产品。
d.QIAquick凝胶提取试剂盒纯化PCR 片段，并在 30 μL 的洗脱缓冲液中洗脱。
e.iDAbPspOMIFor和MyctagstopXbaIRev引物按照步骤 A1a-b 中的相同方案对两种 PCR 产物进行 PCR 组装。
f.在 1% 琼脂糖凝胶（120 V，30 分钟）上运行整个组装的 PCR 产品。
g.QIAquick凝胶提取试剂盒纯化PCR 片段，并在 30 μL 的洗脱缓冲液中洗脱。
h.PspOMI和XbaI在 37°C消化 PCR 片段2 小时（每种酶 1.5 µL，10 × 5 µL Cutsmart和 1 µg PCR 产物，H 2 O 至 50 µL 终体积）。
i.加热20 分钟使消化失活。
j.在室温（RT：22°C）下将消化的 PCR 产物（插入）2 小时连接到 pEF-GFP 2 -MCS 载体（Bery 和 Rabbitts，2019） [10 ng pEF-GFP 2 -MCS ( NotI / XbaI )、40 ng iDAb LMO2 S55A/E102A/T107A-myc 插入物、2 µL 10 × T4 DNA 连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA 连接酶、H 2 O 至 20 µL 终体积]。
k.将 5 μL 的结扎加入 50 μL 的 DH5α 感受态细胞中，然后在冰上转化 30 分钟。 42°C 热休克 40 秒，然后置于冰上 10 分钟。加入 500 µL 溶原肉汤 (LB) 培养基，在 37°C 下摇动 1 小时。用氨苄青霉素 (100 µg/ml) 将细胞铺板在 LB 琼脂板上。
2.按照步骤 A1 中所示的相同程序并使用表 2 中的引物生成所有其他iDAb LMO2 突变体。

表 2. 用于定点诱变成熟的引物 iDAb LMO2
iDAbPspOMIFor5' TTATTCGGGCCCGTATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGG 3'
MyctagstopXbaIrev5' TATTAATCTAGACTATGCGGCCCCATTCAGATCC 3'
S28GHFor5' CCTCTGGATTCGGCTTCAGTCATAGTCC 3'
S28GHRev5' GGACTATGACTGAAGCCGAATCCAGAGG 3'
H31G为5' GGATTCAGCTTCAGTGGCAGTCCTATGAATTGG 3'
H31GRev5' CCAATTCATAGGACTGCCACTGAAGCTGAATCC 3'
E102AFor5' GAGAGGGTTGACGGCCTCTCTTGAGTTGGC 3'
E102ARev5' GCCAACTCAAGAGAGGCCGTCAACCCTCTC 3'
S103AFor5' 嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎嘎 3'
S103ARev5' GCCAACTCAAGCGCCTCCGTCAACCCTCTC 3'
B.LMO2/ iDAb LMO2 突变体的 BRET2 供体饱和度
为了检查iDAb LMO2 突变体是否与 LMO2 相互作用，进行了供体饱和度测定（图 1A）。该测定还将深入了解每个突变体对 LMO2 的相对亲和力，因为必须确定在细胞内表达的正确受体数量，以避免在竞争测定中滴定抑制剂（参见 C 部分）。整个协议在组织培养罩中进行，以保持无菌条件。

图 1. 选择用于化学文库筛选的最佳iDAb LMO2 突变体。
成熟过程（受体）后获得的各种iDAb LMO2 突变体之间的 BRET 供体饱和测定。如供体饱和测定所示， CDR环中添加的突变（去成熟）降低了相应 iDAb 的相对亲和力。 B. LMO2 与待测试的不同iDAb LMO2（突变体）之间的 BRET 竞争测定。 iDAb对照是不相关的iDAb ( iDAb RAS)， iDAb LMO2 是具有高亲和力的野生型iDAb结合 LMO2（阳性对照）。
1.第 1 天，在 DMEM 培养基的 6 孔板的每个孔中放置 650,000 个 HEK293T 细胞，辅以 10% FBS 和 1% PS。
2.第 2 天，转染细胞：
a.添加 100 μL 的OptiMEM培养基： 50 ng RLuc8 构造和不同数量的 GFP 2构造：50、100、250、500、750 和 1,000 ng。 pEF-myc-cyto空质粒用于平衡每种条件之间的转染 DNA 总量（总 DNA 量为 1.6 µg ）。
b.将 4 μL 的 Lipofectamine 2000 转染试剂添加到带有 100 μL OptiMEM培养基的单独管中。
c.将步骤 B2a 中的 DNA 混合物添加到步骤 B2b 中的 Lipofectamine 混合物中，混合并在室温下放置 20 分钟。
d.在每口井中加入 200 μL 的转染混合物。
e.2的细胞培养箱中）。
3.第 3 天，准备 BRET 板：
a.吸出培养基并在每口井中加入 500 μL 的胰蛋白酶以分离细胞（RT 时 2 分钟）。
b.用 1 mL 的完整 DMEM（含 10% FBS）中和胰蛋白酶。
c.计数一个或两个条件的细胞（假设在显微镜下检查后每个条件之间的细胞数相等）。
d.在 15 毫升猎鹰管中添加 500,000 个细胞和 1 毫升 PBS。
e.240 ×离心机 g和 20°C 5 分钟，吸出上清液。
f.添加 1 mL 的OptiMEM无酚红，辅以 4% FBS（BRET 培养基），并小心地重新悬浮细胞。
g.在白色透明底部 96 孔板的每孔中添加 100 μL 的细胞悬浮液（为每种条件制作一式四份）。
h.在执行 BRET 读数之前，将细胞在 37°C（在 5% CO 2的细胞培养箱中）放置 20 小时。
C.BRET2竞争测定
在 B 节中描述的供体饱和测定之后，进行竞争测定以 ( i ) 检查相互作用的特异性，以及 (ii) 确定最佳的成熟将用于化学库筛选的iDAb 。在这种情况下，最佳突变iDAb显示出高 BRET 信号，但它与 LMO2 的相互作用必须在竞争分析中被野生型iDAb LMO2 几乎完全抑制（图 1B）。该协议在组织培养罩中执行以保持无菌条件。
1.第 1 天，在 DMEM 培养基的 6 孔板的每个孔中放置 650,000 个 HEK293T 细胞，辅以 10% FBS 和 1% PS。
2.第 2 天，转染细胞：
a.加入 100 µL OptiMEM培养基： 50 ng LMO2-RLuc8 构建体，100 ng GFP 2 -iDAb LMO2 突变体构建体和 100 ng pEF-iDAb竞争者（始终使用阴性对照（即竞争分析中的iDAb RAS） . pEF-myc-cyto空质粒用于平衡每种条件之间的转染 DNA 总量（总 DNA 量为 1.6 µg ）。
b.将 4 μL 的 Lipofectamine 2000 转染试剂添加到带有 100 μL OptiMEM培养基的单独管中。
c.将步骤 C2a 中的 DNA 混合物添加到步骤 C2b 中的 Lipofectamine 混合物中，混合并在室温下放置 20 分钟。
d.在每口井中加入 200 μL 的转染混合物。
e.将细胞在 37°C（在 5% CO 2的细胞培养箱中）孵育 24 小时。
3.第 3 天，按照步骤B3 中的说明准备 BRET 板。
D.BRET2 测量
注意：此步骤不需要使用无菌组织培养罩。
1.μL 的 100% 乙醇中重新悬浮腔肠素 400a（BRET 底物）的等分试样。
2.添加 750 μL 的 BRET 介质，在 100 μM 处制作 1.25 mL 的 BRET 基板。
3.具有以下设置的CLARIOstar仪器上读取 GFP 2荧光：激发 395 ± 30 nm 和发射 510 ± 40 nm。
4.在 BRET 读数之前用白色胶带将 96 孔板的底部贴上胶带（否则会观察到信号丢失）。
5.悬浮的 BRET 基板与CLARIOstar的泵/注射器相连。
6.配备发光模块的CLARIOstar仪器读取 BRET 信号。设置具有两个多色的发光协议并使用以下单色器设置：410 ± 40 nm（发射 1）和 515 ± 15 nm（发射 2），这是确定 BRET 信号所需的（请参阅 BRET 信号计算的数据分析部分）。以孔模式读取板，在 RT 下执行：在 A1 孔中注入 10 µL 底物，在 A1 孔中读取 BRET 信号，然后在 A2 孔中注入底物，在 A2 孔中读取 BRET 信号，直到您盘子上最后选择的孔。
7.在 480 ± 40 nm 处读取 RLuc8 信号。
E.iDAb LMO2 突变体 BRET 生物传感器进行高通量化学筛选 (HTS)
一旦突变体得到验证，它就可以用于 HTS 测定。在开始 HTS 测定之前，必须优化或测试几个参数，例如 BRET 底物在 RT 下的稳定性、测定的小型化（从 96 孔板到 384 孔板格式）以及放大用 BRET 对转染 HEK293T 细胞，以获得足够用于 HTS 测定的细胞数量（图 2A 和 2B）。筛选是使用来自BioFocus和Chembridge文库的10,720种化合物的内部文库以10 µM 压缩成 384 孔板格式进行的。在 68 个测定板（34 个板在重复）因为时间/处理目的。一节 34 块板的协议如下所述。

图 2.基于细胞的高通量筛选试验的优化和实施，以确定 LMO2/ iDAb LMO2 PPI 的抑制剂。
A. LMO2/ iDAb LMO2 dm3相互作用的 BRET 信号，使用在 RT 下孵育指定时间（避光）的 BRET 底物。 B. 扩大细胞转染形式（从 6 孔板到HYPERFlask ）和小型化HTS 分析（从 96 孔板到 384 孔板形式）时对 BRET 信号的影响。 384 孔板和 96 孔板的每孔分别接种 20,000 和 50,000 个细胞。 C. HTS 化合物 384 孔板布局。 D. 来自基于单元的 HTS 的代表性数据。这些数据来自一个 384 孔板，其中包括 3 个以橙色表示的潜在命中 [低于BRET DMSO （平均值）的 3 ×标准偏差 (SD) 的阈值]。 E. 使用 LMO2/ iDAb LMO2 dm3对通过 BRET 竞争测定确认 10 µM 的主要命中。两个命中被证实抑制 LMO2/ iDAb LMO2 dm3相互作用，并用蓝条表示。阈值 [BRET DMSO (mean) ± 3 × SD] 用虚线显示。
1.第 1 天，每个HYPERFlask接种 120 × 10 6 个HEK293T 细胞。一个 HTS 会话需要两个HYPERFlask （即，总共 240 × 10 6 个HEK293T 细胞）。一个HYPERFlask的表面对应于 ~10 × T175 的表面。用培养基填充HYPERFlask （最多 560 mL，这是HYPERFlask的最大体积）。
HYPERFlask中填充培养基时要小心，因为很容易产生大量气泡，这些气泡需要避免才能正常细胞生长。始终将HYPERFlask填充至盖子以避免气泡。
2.用 BRET 对 pEF-LMO2-RLuc8 和 pEF-GFP 2 -iDAb LMO2 dm3转染HYPERFlasks中的细胞。对于一个HYPERFlask ：
a.在 15 mL Falcon 管中，加入 10 mL OptiMEM ：19 μg pEF-LMO2-RLuc8、37 μg pEF-GFP 2 - iDAb LMO2 dm3和 244 μg pEF-myc-cyto空质粒。
b.在单独的 50 mL Falcon 管中，将 750 µL Lipofectamine 2000 添加到 10 mL OptiMEM 中，并通过涡旋5 s轻轻混合。
c.将步骤 E2a 中的 DNA 混合物添加到步骤 E2b 中的 Lipofectamine 混合物中，轻轻涡旋 5 秒，然后等待 20 分钟。
d.将此混合物 ( DNA+Lipofectamine ) 添加到 500 mL 的完整 DMEM 中，轻轻混合培养基，然后将其倒入无菌烧杯中。取出 HYPERFlask 的培养基，小心地将转染混合物倒入HYPERFlask中，不要产生任何气泡。用培养基完成直到烧瓶的顶部。
注意：使用烧杯可避免将培养基倒入HYPERFlask时形成气泡。
3.在第 3 天（早上，转染后 24 小时），收获转染的细胞：
a.每个HYPERFlask加入 100 mL胰蛋白酶（即总共 200 mL）。
b.将烧瓶在 37°C 下孵育 2 分钟。
c.将胰蛋白酶化细胞转移到含有 100 mL完整培养基的无菌烧杯中。
d.mL的完全培养基清洗每个烧瓶，然后将其倒入烧杯中（一个烧瓶的最终体积为 300 mL ）。将所有细胞拉入一个烧杯中（最终体积为 600 mL ）。
e.轻轻但彻底地混合，以确保细胞的良好解离。
f.计数细胞。
g.每250 mL康宁离心管加入90 × 10 6 个细胞，准备4个离心管，共对应360 × 10 6 个转染细胞。
h.×离心细胞 g和 20°C 5 分钟。
i.小心取出上清液，用 200 mL的 BRET 培养基重新悬浮每个细胞颗粒，并辅以 1% PS（总共 4 个颗粒）。这对应于 0.45 × 10 6 个细胞/ mL的浓度。
j.在白色 384 孔板的每孔中播种 45 μL细胞悬浮液，PerkinElmer Janus 液体处理工作站安装在 2 类外壳中。使用该设备播种 6 × 384 孔板大约需要 10 分钟。
注意：首先运行未使用的板，以去除液体处理工作站中所有剩余的气泡。将细胞与磁性搅拌棒轻轻混合，同时将它们分配到 384 孔板中以保持它们分离，因为 HEK293T 可能有形成可能堵塞工作站的聚集体的趋势。
k.和 5% CO 2的细胞培养箱中孵育24 小时。此步骤将确保通过每个孔均匀电镀细胞。
4.在第 3 天（下午开始），将化学库（初始浓度为 10 mM）稀释至 100 μM。
使用 Echo Acoustic Dispenser ( Labcyte )将 150 nL的每种化合物添加到 15 μL 的 BRET 培养基中。
5.在第 3 天（下午晚些时候），将化合物添加到细胞中。
a.添加 5 μL 的 1% DMSO（在 BRET 介质中制备）作为阴性对照（图 2C）。
b.使用 PerkinElmer Janus 液体处理工作站向每个孔中的细胞中添加 5 μL 浓度为 100 μM 的化合物（每个孔中的最终浓度：10 μM，0.1% DMSO）。
c.将板在 37°C（5% CO 2的细胞培养箱）孵育 20 小时。
6.第 4 天，读板（早上，孵化 20 小时）。
a.PHERAstar FSX读板器读取 BRET2 之前读取每个板的 GFP 2信号。
b.在 GFP 2读数后，用白色胶带（随盘子提供）将 384 孔板的底部贴上胶带。
c.准备 80 mL的 100 μM BRET 基板：用 32 mL 的100% 乙醇溶解 3 mg 的腔肠素 400a ，然后通过添加 48 mL的 BRET 介质完成至 80 mL 。
d.使用带有PHERAstar FSX 读板器的 BRET2 光学模块读取 BRET2 信号：将 5.5 μL 的 BRET 底物（最终浓度为 10 μM）注入孔中，在注射 1 秒后 0.2 秒读取 BRET2 信号，注入另一个孔, 并以相同的设置读取 BRET2 信号。
e.一块 384 孔板的读取时间约为 8 分钟。读取 34 个板需要约 4.5 小时（有关HTS 板分析和命中确定，请参见数据分析部分，图 2D）。
注意：E 节中描述的所有步骤均在组织培养罩下完成，以保持无菌，步骤 4 和 6 除外。
F.确认主要命中
在 HTS 分析之后，我们确定了 34 个主要命中，它们降低了由相互作用 LMO2 / iDAb LMO2 dm3产生的 BRET 比率。下一步是使用与 HTS 相同的 BRET 测定重新测试这些化合物，以检查这些化合物是否是真正的命中（图 2E）。以下是在完整的 96 孔板中使用 BRET 对 LMO2/ iDAb LMO2 dm3进行竞争测定的方案。它可以根据要测试的化合物的数量进行放大。
1.第 1 天，在 6 孔板的每个孔中培养 650,000 个 HEK293T 细胞，如步骤 C1 中所述。
2.第 2 天，转染细胞：
a.在 100 μL 的OptiMEM培养基中，加入 50 ng LMO2-RLuc8 结构和 100 ng 的 GFP 2 -iDAb LMO2 dm3结构和 1，450 ng pEF-myc-cyto空质粒（总 DNA 量为 1.6 μg ）。
b.将 4 μL 的 Lipofectamine 2000 转染试剂添加到带有 100 μL OptiMEM培养基的单独管中。
c.步骤F2a中的 DNA 混合物添加到步骤F2b 中的 Lipofectamine 混合物中，混合并在室温下放置 20 分钟。
d.在每口井中加入 200 μL 的转染混合物。
e.2的细胞培养箱中）。
注意：6 孔板的四个转染孔通常会产生足够的细胞以在完整的 96 孔板中进行竞争测定。
3.第 3 天，准备 BRET 板：
a.吸出培养基并在每口井中加入 500 μL 的胰蛋白酶以分离细胞（RT 时 2 分钟）。
b.用 1 mL 的完整 DMEM（含 10% FBS）中和胰蛋白酶。
c.将细胞汇集在 15 mL 猎鹰中并计数细胞。
d.在新的 15 mL Falcon 管中添加 500 万个细胞，并添加 5 mL 的 PBS。
e.240 ×离心机 g和 20°C 5 分钟，吸出上清液。
f.添加 12 mL 的 BRET 培养基并小心地重新悬浮细胞。
g.白色透明底部 96 孔板的每孔种子 90 μL 细胞（≈ 38,000 个细胞）。
h.在添加化合物之前，将细胞在 5% CO 2的细胞培养箱中于 37°C 下放置 4 小时。
4.第 3 天，准备化合物：
a.在 BRET 培养基中稀释 100% DMSO 中的 10 mM 化合物库存，以达到 100 μM、2% DMSO（10 ×测定浓度，即 10 μM）。
b.在 96 孔板的每个孔中添加 10 μL 的 10 ×化合物，包括 DMSO 负控制。井中的最终浓度为 10 μM，0.2% DMSO。对每个点执行一式四份。
c.在 BRET 读数之前，将细胞在 37°C 下再孵育 20 小时。
5.在第 4 天，按照 D 节中的说明读取 BRET 信号。
注意：F 部分中描述的所有步骤均在组织培养罩下完成，以保持无菌状态，但第 5 步（BRET 读数）除外。
数据分析
A.供体饱和和竞争分析的 BRET 比率计算
BRET 信号或 BRET 比率对应于加入腔肠素 400a 后 GFP 2受体构建体发出的光 ( 515 ± 15 nm)除以 RLuc8 供体构建体发出的光 (4 ± 10 ± 40 nm) 。仅供体阴性对照，其中仅将 RLuc8 质粒转染到细胞中，并给出从 BRET 比率中减去的背景信号。使用CLARIOstar和PHERAstar仪器，我们将 BRET 比率的值乘以 100 得到整数（大于 1）。
对于滴定曲线，假设双曲线模型通过非线性回归分析结果。
B.竞争分析的 BRET 比率标准化
在 BRET 竞争测定中，将数据标准化为阴性对照（例如，对于iDAb ，无竞争者或非 LMO2 粘合剂，对于小分子，则为 DMSO）以比较竞争者（ iDAb或小分子）的效果。标准化的 BRET 比率计算如下：
BRET化合物/ BRET DMSO × 100
BRET iDAb LMO2 / BRET iDAb对照 × 100
BRET iDAb LMO2 / BRET没有竞争对手 × 100,
其中BRET化合物对应于化合物处理细胞的 BRET 比率，BRET DMSO对应于 DMSO 处理细胞的 BRET 比率， BRET iDAb LMO2对应于抗 LMO2 iDAb （突变体）转染的细胞， BRET iDAb对照对应于阴性对照iDAb转染的细胞（非 LMO2 结合剂，例如抗 RAS iDAb ）和BRET无竞争者对应于未用竞争者转染的细胞。
C.高温超导数据计算
1.MARS 数据分析软件分析 HTS 数据。 BRET 比率的计算如 A 中所示，不去除仅供体信号。
2.分析每个板块的命中：
a.从一个板 = SD计算所有 DMSO 处理的井（阴性对照）的 BRET 比率平均值。因此，每板计算一个 BRET DMSO （平均值）。
b.将所有化合物的 BRET 比率数据标准化为同一板的 BRET DMSO （平均值）。
c.因为没有可用的阳性命中，所以命中被定义为显示低于 BRET DMSO （平均值）的标准化 BRET 比率 - 3 × SD。
d.阳性命中是在两个重复板中显示低于指定阈值的 BRET 比率的化合物（图 2D）。
e.从超过 10,720 个筛选的化合物中，确定了 34 个匹配项。使用此 HTS 获得了 0.3% 的命中率。
食谱
1.BRET培养基
OptiMEM无酚红 + 4% FBS（+ 1% PS，用于 HTS 测定）。
2.BRET底物
a.将 1 mg 腔肠素 400a 重新悬浮在 10.2 mL 的 100% 乙醇中，制成 250 μM溶液。
b.将此溶液分成 20 个 500 μL的等分试样。
c.SpeedVac仪器从溶液中蒸发乙醇，并在 -80°C 下储存等分试样（干燥时在 -80°C 下稳定长达 1 年）。
d.一等份足以读取一个 96 孔板。 Coelenterazine 400a 基材对光敏感，用铝箔避光。
致谢
NB 得到了法兰西基金会 (n°00097692)的奖学金支持。
THR 得到了癌症研究所和英国血癌的支持。该协议的工作得到了Bloodwise的支持计划拨款 12051。
这项工作最初作为研究文章发表在《科学进展》杂志上(DOI: 10.1126/ sciadv.abg 1950)。
利益争夺
作者声明他们没有相互竞争的利益。
参考
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