材料和试剂
材料
1. 全细胞酿酒酵母裂解物（BY4741 WT 菌株），在液氮中快速冷冻并在 -80°C 下储存（见注 2）
2. 10 cm 或 15 cm 无菌细胞培养板（ Sarstedt ，目录号：83.3902 和 83.3903）
3. 细胞提升器（Santa Cruz，目录号： sc-395252）
4. 预灭菌、无 RNase 1、250 µL 、200 µL、20 µL 和 10 µL 微量移液器滤芯吸头
5. 预灭菌、无 RNase 的 0.5 mL、1.5 mL 和 2 mL 微量离心管
6. 4 mL 开口薄壁聚丙烯管 11 × 60 mm（Beckman，目录号： 328874）
7. RiboZero Gold Kit（Illumina，目录号： MRZG126，见注 3）
8. DynaMag TM -2磁性支架（Invitrogen，目录号：12321D）
9. Cutfix不锈钢手术刀（Braun，目录号：5518040）
10. 0.45 µm NanoSep MF 管（PALL，目录号： ODM45C34）
11. 21 G注射器针头（Terumo Neolus ，目录号：NN-2150R）
12. MicroAmp光学 384 孔反应板（Applied Biosystems，目录号：4309849）
13. MicroAmp光学胶膜（Applied Biosystems，目录号：431971）
14. 安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（安捷伦，目录号： 5067-4626）
15. 安捷伦小 RNA 试剂盒（安捷伦，目录号： 5067-1548）
16. DeNovix dsDNA 高灵敏度试剂盒（ Biozym ，目录号： 31DSDNA-HI2）
17. Qubit microRNA 试剂盒（ ThermoFisher Scientific，目录号： Q32880）
18. NEXTflex small RNA-Seq Kit v3（Hiss Diagnostics，目录号： NOVA-5132-06）
19. NextSeq 500/550 高输出试剂盒 v2.5（Illumina，目录号： 20024906）
试剂
1. DMEM（Gibco，目录号： 41965-039）（在 RPE1 细胞的情况下，使用 DMEM/F12（Ham's）培养基 1：1（Gibco，目录号： 11320-033））
2. L-谷氨酰胺（PAN Biotech，目录号： P04-80100）
3. 青霉素/链霉素（PAN Biotech，目录号： P06-07100）
4. 胎牛血清（FBS，Sigma，目录号： F7524）
5. 放线菌酮（CHX，AppliChem，目录号：A0897）
6. 无核酸酶水（ Ambion ，目录号：AM9937）
7. 特里斯
8. 氯化镁2
9. 氯化钠
10. 氯化钾
11. Triton X- 100（Roth，目录号：3051.A）
12. NP-40（ Genaxxon Bioscience，目录号：M3165）
13. DTT（AppliChem，目录号：A2948）
14. 完全蛋白酶抑制剂，不含 EDTA（Roche，目录号： 11836170001）
15. Superase抑制剂（Invitrogen，目录号： AM2694）
16. RNase I（ Ambion ，目录号： AM2294）
17. 蔗糖
18. 尿素
19. 乙二胺四乙酸
20. 安全数据表
21. 苯酚：氯仿：异戊醇（PCI，25:24:1，AppliChem，目录号： A0944）
22. 异丙醇
23. GlycoBlue （15 mg/mL， Ambion ，目录号： AM9515）
24. 乙醇
25. 碳酸氢钠3
26. 钠2 CO 3
27. 甘油
28. 溴酚蓝（AppliChem，目录号：A2331 ）
29. 二烯醇（AppliChem，目录号：A4976）
30. 硼酸
31. NaOAc
32. Rotiphorese Gel 30（37.5：1）聚丙烯酰胺（Roth，目录号： 3029.1）
33. 四甲基乙二胺（ TEMED，AppliChem，目录号：A1148）
34. 过二硫酸铵（APS，AppliChem，目录号：131138）
35. 小 RNA 梯（ Abnova ，目录号： R0007）
36. SybrGold （Invitrogen，目录号： S11494）
37. RNase OUT（40 U/µL，Invitrogen，目录号： 10777019 ）
38. ATP（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0441）
39. T4多核苷酸激酶（10 U / µL，NEB，目录号： M0201S）和反应缓冲液（10 × ，NEB，目录号：B0201S）
40. SybrGreen Master Mix（Applied Bio systems，目录号： A25742）
41. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（参见食谱）
42. Polysome 缓冲液 A (2×)（参见食谱）
43. Polysome 缓冲液 B (2×)（参见食谱）
44. Polysome 裂解缓冲液 A（参见配方）
45. Polysome 裂解缓冲液 B（参见配方）
46. 尿素缓冲液（见配方）
47. 随机碎片缓冲区（参见食谱）
48. 停止/沉淀溶液（见配方）
49. Tris-Borate-EDTA (TBE, 10×)（见食谱）
50. RNA 上样染料 (3×)（参见食谱）
寡核苷酸
1. 25 nt大小标记寡核苷酸 ( GCGCGUUACAUCUGGAGUACGAUAC)
2. 35 nt大小标记寡核苷酸 (GGUCCGUCCGGUCUUCUAAUGAACUAGCGAACGAA)
3. 用于测试 qPCR 的正向引物 ( GTTCAGAGTTCTACAGTCCGA)
4. 用于测试 qPCR 的反向引物 (CCTTGGCACCCGAGAATTCCA)
设备
1. 冷藏台式微量离心机
2. 端对端旋转器
3. 荧光计（ DeNovix ，型号： DS-11FX+）
4. 可选：梯度主站（ BioComp ）
5. 摆桶式超速离心机转子（日立，型号： P56ST）
6. 超速离心机（日立，型号：CP80NX）
7. 连续紫外光监测器和分馏器 (Teledyne Isco Foxy Jr)
8. 通风柜
9. 热块
10. 涡流
11. 热循环仪（Eppendorf Mastercycler ）
12. Mini Protean Tetra Cell 聚丙烯酰胺凝胶盒（Bio-Rad）和电泳电源
13. 摇床
14. 紫外透照器或蓝光台
15. Quant Studio 实时荧光定量 PCR 系统（ LifeTech ，型号： 5384）
16. 生物分析仪（安捷伦，型号： 2100 生物分析仪）
17. 测序仪（Illumina，NextSeq500）
软件
我们在 Ubuntu 16.04 LTS 下执行了所有测序数据分析步骤。必须安装gzip包、 perl和 R（在 / usr /bin 下带有RScript ）。根据您要执行的步骤，并非所有工具都可能是必需的。为了完全按照我们在文章（Haneke等人， 2020 年）中介绍的方式重现分析，您可以从我们的 OSF 项目页面下载目录“工具”，其中包含我们使用的版本。对于新数据的分析，最好下载这些工具的最新版本：
1. 领结（ http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）（Langmead等人，2009 ）
2. DESeq2 ( http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html ) (Love et al ., 2014)
3. FastQC ( https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ )
4. fastx ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html )
5. PeakTrak v1.10（Teledyne ISCO，见注 4）
6. perl ( https://www.perl.org/ )
7. R ( https://www.r-project.org/ )
8. samtools ( https://www.htslib.org/ )
9. seqinr ( http://seqinr.r-forge.r-project.org/ )
10. sratoolkit ( https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/02.-Installing-SRA-Toolkit )
数据库
本协议中显示的代码、我们内部开发的脚本以及其他所需文件可从我们的 OSF 项目页面获得。其他版本的 tRNA、rRNA、转录组和基因组序列可以从 UCSC 基因组浏览器的表格浏览器下载。我们自己研究的未处理读取序列可通过 SRA 从 GEO 获得（参见数据分析，D）：
1. UCSC 基因组浏览器 ( https://genome.ucsc.edu/ )
2. OSF ( https://osf.io/wr23s/?view_only=1f6fafb4f1d144f8a6093730ebe50f2a )
3. GEO（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE128538 ）
程序
A. 准备加标样品
1. 解冻全细胞酿酒酵母裂解物并在 20, 000 ×离心 g和 4°C 5 分钟，以去除细胞碎片。
2. 在五倍体积的多核糖体裂解缓冲液 A 中预稀释上清液（参见食谱）。稀释后，我们获得了每毫升约 7 A 260单位的浓度，这大约对应于 RPE1 裂解物的浓度，因此便于移液（参见步骤 D2）。分装并在 -80°C 下再次快速冷冻。等分试样在解冻后只能使用一次。
B. 细胞的接种和处理
1. 实验前一天，将哺乳动物细胞接种到每个条件下一个 10 或 15 厘米的细胞培养皿中。我们在饥饿前每 15 cm 培养皿接种 3 × 10 6 个RPE1 细胞（Haneke et 等，2020）。对于 HeLa 细胞，将 1.2 × 10 6 个细胞接种到 10 cm 细胞培养皿中。需要预先对所有细胞系的数量和适当的细胞数量进行测试，以获得足够的材料进行测序，并确保细胞始终保持亚汇合，从而防止接触抑制引起的翻译抑制（见注 5）。
2. 对于细胞处理，在含有 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。（对于 RPE1 细胞，使用 Ham 的 F12 培养基而不是 DMEM）。处理细胞并在 37°C 和 5% CO 2中孵育适当的时间。即使不进行药物处理，一般仍建议将细胞培养基更换为新鲜培养基几个小时，以获得具有高翻译率的细胞。
C. 哺乳动物细胞裂解物的制备
注意：细胞裂解应在 4°C 的冷室或冰上进行。
1. 可选：在室温下用 100 µg/mL 放线菌酮 (CHX) 处理细胞 5 分钟，以阻止核糖体（见注 6）。
2. 去除上清液并用含有 100 µg/mL CHX 的 1× PBS 洗涤细胞。完全除去洗涤液。
3. 在 150 – 250 µL（取决于板的大小）多核糖体裂解缓冲液 A（见配方，见注 7）中裂解细胞，直接用细胞提升器刮擦板。将裂解液转移到 1.5 mL 反应管中。
4. 将裂解物在 4°C 下颠倒旋转孵育 10 分钟。
5. 10,000 ×离心清除裂解液 g和 4°C 在台式离心机中 10 分钟，以去除细胞核。将上清液转移到新管中。
D. 酵母掺入
1. 在分光光度计中测量细胞裂解物在 260 nm 处的吸光度，使用多核糖体裂解缓冲液对仪器进行消隐。将样品调整到相同的 A 260 ，并用多核糖体裂解缓冲液填充高达 300 μL 的总体积。
2. 向每个样品中加入等量的酵母裂解物。酵母裂解物应为哺乳动物细胞裂解物的 2% (w/w)（根据 A 260测量值调整）。例如，如果每个样品使用 2 A 260单位的哺乳动物裂解物，则添加 0.04 A 260单位的酵母裂解物。确保移取至少 5 μL 的酵母裂解液，以减少因移液错误引起的变化。这可能需要用多核糖体裂解缓冲液 A 进一步预稀释酵母裂解液。
3. 对于输入样品，将大约 10% 的裂解物（哺乳动物加酵母加入）放入新试管中，并用多核糖体裂解缓冲液填充高达 300 μL。添加 300 μL 的尿素缓冲液（参见食谱）和 300 μL 的苯酚：氯仿：异戊醇（PCI）。涡旋并在 -20°C 下储存样品，直到进一步处理或直接进入 G 部分。
E. RNase I 消化
1. 260单位的60 U RNase I (60 U/µL) 添加到细胞裂解物中。
2. 在 4°C 下颠倒旋转孵育 5 分钟（见注 8）。
3. Superase抑制剂（每个样品 6 个单位）停止消化离子。
F. 多核糖体分馏
1. 将超速离心机预冷至 4°C。超速离心机转子和铲斗以及蔗糖梯度在使用前应保持在 4°C。蔗糖梯度应在细胞裂解之前或期间制备。
2. 使用自动梯度生成器（步骤 F3 – F8）或逐步制备（步骤 F9 – F13）制备蔗糖梯度（参见注释 9）。
3. 通过将蔗糖溶解在也用于细胞裂解的多核糖体缓冲液中来制备两种蔗糖溶液（17.5% 和 50%）。每个梯度大约需要 2 mL 的每种溶液。
4. 根据Biocomp的 Gradient Master Station 的标记块标记 4 mL 聚丙烯管。
5. 用 17.5% 的蔗糖溶液填充管子，直到达到标记。
6. 使用注射器，将 17.5% 的蔗糖与 50% 的蔗糖打底，直到您看到界面达到标记。
7. 将试管放入磁性支架并使用以下设置运行 Gradient Master 系统：
a. 步数：1
b. 时间：1分25秒
c. 角度：82°
d. 速度：19转
8. 将新制备的梯度转移到 4°C 并在接下来的几个小时内使用。
9. 通过将蔗糖溶解在也用于细胞裂解的多核糖体缓冲液中，制备具有五种不同浓度（17.5%、25.6%、33.8%、41.9% 和 50%）的蔗糖溶液。
10. 吸取 780 µL 50% 蔗糖溶液到 4 mL 聚丙烯管中，并在 -80°C 下冷冻管子，直到溶液完全冷冻。
11. 在冷冻溶液上加入 780 µL 的 41.9% 蔗糖，然后在 -80°C 下再次冷冻。
12. 重复这些步骤，直到所有的蔗糖溶液都在梯度中分层。快速工作以避免先前的蔗糖层解冻。完成的梯度可在 -80°C 下保存数月。
13. 将梯度转移到 4°C 解冻几个小时或实验前一天。
14. 加载250-300 μ L的消化裂解液。在将梯度转移到超速离心机转子的桶之前，使用多核糖体裂解缓冲液将单个梯度的体积调整到相同水平，并使用刻度平衡梯度。
15. ×的最大 g 力 G 平均重力为 157,600 × G 在 SW60 转子中）持续 2 小时，加速设置为 7，减速设置为 1。取回铲斗并放在冰上直至使用。
16. 根据制造商的说明准备梯度分馏器。准备 2 mL反应管，其中每个反应管含有 300 μL 尿素缓冲液（参见食谱），用于收集梯度分数。
17. 将梯度置于分馏器的夹持装置中，并用针泵刺穿管底。将含有尿素缓冲液的管子放在馏分架的相应位置。以 50% 的泵速从底部泵入 60% 的蔗糖（溶于水），使梯度从顶部洗脱。使用 PeakTrak软件（见注 4）同时记录灵敏度为 2.0 或 1.0 的梯度的紫外吸光度，以识别 80S 单体峰。图 2 显示了(Haneke et al ., 2020)中使用的 RPE1 细胞和 RAW264.7 细胞的示例图谱， ADDIN EN.CITE RAW264.7 细胞是一种具有更高翻译率的小鼠巨噬细胞系。每 14 s 收集一次馏分（每个馏分约 300 μL），关闭管子，并通过反转混合。一旦梯度完全洗脱（总共大约 12-14个分数离子），将管子转移到通风橱中，并在每个管子中添加 300 μL 的 PCI。涡旋并在 -20°C 下冷冻样品，直到处理完所有梯度或直到进一步使用。在这一步可以延长样品的储存时间。

蔗糖密度梯度离心后单体组分的鉴定。
A.梯度洗脱过程中 254 nm 处的紫外吸光度，有和没有 RNase I 消化 RPEI 裂解物。分数边界的位置以轮廓中的急剧下降为标志。 B.与 A 中一样，用于 RAW264.7 单元格。
G. RNA分离
1. 根据 UV 吸收曲线识别含有单体核糖体的管，该曲线通常在分数 4 和 5 中（图 2）。并行处理输入样本。
2. 在热块中将样品在 65°C 下加热 10分钟。在通风橱下打开管子一次，以释放压力。
3. ×旋转 20 分钟 g在台式离心机中的 RT。
4. 在通风柜中，将上层水相（约 600–700 µL）移至新管中，同时小心避免接触界面。在添加 700 μL 异丙醇之前，向每个样品中添加 1 μL GlycoBlue 。在 -20°C 下涡旋并沉淀 RNA 过夜。
5. 以 17,000 ×短暂涡旋和离心 g在预冷的 4°C 台式离心机中 20 分钟。
6. 用 800 μL 的冰冷 70% 乙醇丢弃上清液并洗涤颗粒。以 17,000 ×再次旋转 g和 4°C 10 分钟。
7. 完全去除上清液，在室温下干燥沉淀10-30分钟。
8. 沉淀重悬于 10 – 20 µL 无 RNase 的水中（取决于沉淀的大小），并通过在 65°C 的加热块中孵育10 – 20分钟来溶解它，偶尔涡旋。如果单体核糖体包含在一个以上的试管中，此时应合并 RNA。将 RNA 储存在 -80°C 或直接进一步处理样品。
H. 来自输入和核糖体足迹的 rRNA 的Rem椭圆形
1. 根据制造商的协议，使用RiboZero Gold rRNA 去除试剂盒（见注 3）从样品中去除 rRNA。
2. 通过 Nanodrop 测量确定汇集 RNA 的浓度。每个样品最多使用 5 µg RNA。
3. 在最后一步，将 90 μL 的含有 rRNA 耗尽 RNA 的上清液转移到新管中。
4. 加入 89 µL 无 RNase 水、1 µL GlycoBlue和 20 µL 3 M NaCl，然后在 -20°C 下用 200 µL 异丙醇沉淀过夜。
5. ×短暂涡旋和离心 g在预冷的 4°C 台式离心机中 20 分钟。
6. 丢弃上清液并用 800 μL 的冰冷 70% 乙醇洗涤颗粒。以 17,000 ×再次旋转 g和 4°C 10 分钟。
7. 完全去除上清液，在室温下干燥沉淀10-30分钟。
8. 将沉淀重悬于 10 µL 无 RNase 的水中，并在 65°C 的加热块中孵育10 – 20分钟以溶解它，偶尔涡旋。
I. 输入材料的随机 RNA 片段化
核糖体足迹样本中生成与受核糖体保护的片段长度相似的 RNA 片段，输入 RNA 通过随机碱性片段化处理。重要提示：在 PCR 管中处理样品并在热循环仪中孵育样品，因为在此步骤中精确设置温度至关重要！
1. 使用上一步中的所有 rRNA 耗尽 RNA (10 µL) 并与 10 µL 的 2× 碎片缓冲液混合 (参见食谱)。
2. 在热循环仪中在 95°C 下孵育 12 分钟（加热盖子！）。
3. 通过添加 180 μL 的停止/沉淀缓冲液（参见食谱）停止碎片化，并立即添加 200 μL 的异丙醇。
4. 在 -20°C 过夜沉淀 RNA。
5. 短暂涡旋并以 17,000 ×离心 g在预冷的 4°C 台式离心机中 20 分钟。
6. 丢弃上清液并用 800 μL 的冰冷 70% 乙醇洗涤颗粒。以 17,000 ×再次旋转 g和 4°C 10 分钟。
7. 完全去除上清液，在室温下干燥沉淀10-30分钟。
8. 将沉淀重悬于 10 µL 无 RNase 的水中，并在 65°C 的加热块中孵育10 – 20分钟以溶解它，偶尔涡旋。
J. 尺寸选择
1. 如下制备 15% 聚丙烯酰胺 TBE-尿素凝胶（用于 2 块凝胶）：
5 毫升Rotiphorese聚丙烯酰胺 (30%)
1 mL 10× TBE
4.24 g 尿素（最终浓度 8 M）
用H 2 O 填充至 10 mL
添加 50 µL 的 10% APS 和 7 µL 的 TEMED
2. 混合并倒入预先组装好的 Mini Protean Tetra Cell 聚丙烯酰胺凝胶盒中。让凝胶凝固。
3. 在 1× TBE 中以 100 – 200 V预运行凝胶15 – 30 分钟。
4. 在预运行凝胶时，准备用于加载的 RNA 样本。在样品中加入 5 μL 的 3× RNA 上样染料（参见配方）。同时，准备小 RNA 梯和/或大小标记寡核苷酸（25 nt和 35 nt ，见注 10）用于加载。对于标记，将 2 μL 的小 RNA 梯与 8 μL 的无 RNase 水和 5 μL 的 3× RNA 加载染料（足够两条车道）混合。对于寡核苷酸，将 5 pmol的寡核苷酸用无 RNase 水填充至 10 μL，并添加 5 μL 的 3× RNA 加载染料。
5. 在 65°C 下变性样品 10 分钟。
6. 装载前，用注射器冲洗凝胶袋以去除多余的尿素。将样品、小 RNA 梯和/或大小标记寡核苷酸加载到凝胶上；如果可能，在样品之间留一条空闲通道。
7. 在 1× TBE 中以 150 V 运行凝胶，直到溴酚蓝运行前沿距离凝胶底部约 1 cm。
8. 拆开凝胶并用SybrGold （在 1× TBE 中以 1:10,000 稀释）通过在室温下轻轻摇晃5-10 分钟对其进行染色。
9. 可视化紫外线透射仪或蓝光表中的染色，并用手术刀切除 25 至 35 nt之间的区域。
10. 用 21 G 针在 0.5 mL 无 RNA 反应管的底部打一个孔，并将管子放入带开盖的 1.5 mL 反应管中。将凝胶切片转移到 0.5 mL 管中。
11. 在台式离心机中以最大速度离心 5 分钟，以迫使凝胶切片通过孔。如果凝胶块留在上管中，请重复或用移液器转移剩余的凝胶块。丢弃 0.5 mL 管。
12. 将 300 µL 的 0.3 M NaCl 和 2 µL 的 RNase OUT 添加到每个试管中，并在 4°C 下孵育过夜，并进行端到端旋转。
13. 切割 1，250 μL 过滤移液器尖端的尖端，并将凝胶浆转移到 0.45 μm NanoSep MF 管中。在台式离心机中以最大速度在 4°C 下离心 5 分钟。
14. 将流出液转移到新试管中，加入 1 µL GlycoBlue和 300 µL 异丙醇，充分混匀，然后在 -20°C 下过夜沉淀 RNA。
15. 在预冷的 4°C 台式离心机中以 17,000 × g的速度短暂涡旋并离心 20 分钟。
16. 丢弃上清液并用 800 μL 的冰冷 70% 乙醇洗涤颗粒。在 17,000 × g和 4°C 下再次旋转 10 分钟。
17. 完全去除上清液，在室温下干燥沉淀10-30分钟。
18. 将沉淀重悬于 14 µL 无 RNase 的水中，然后在 65°C 的加热块中孵育5 – 10分钟以将其溶解，偶尔涡旋。
K. 末端修复
1. 设置以下反应：
14 µL RNA
2 µL 10 mM ATP
2 µL 10× T4 PNK 缓冲液
1 µL T4 PNK
1 µL RNase OUT
2. 恒温块中 37°C 孵育 1 小时。
3. 中加入 159 μL 的无 RNase 水、1 μL 的GlycoBlue和 20 μL 的 3 M NaCl。用 200 µL 异丙醇在 -20°C 下沉淀过夜。
4. 在预冷的 4°C 台式离心机中以 17,000 × g的速度短暂涡旋并离心 20 分钟。
5. 丢弃上清液并用 800 μL 的冰冷 70% 乙醇洗涤颗粒。在 17,000 × g和 4°C 下再次旋转 10 分钟。
6. 完全去除上清液，在室温下干燥沉淀10-30分钟。
7. 将沉淀重悬于 12 µL 无 RNase 的水中，并在 65°C 的恒温箱中孵育5 – 10 分钟以将其溶解，偶尔涡旋。
L. 文库制备和深度测序
1. 使用 Qubit microRNA 试剂盒确定 RNA 的浓度。
2. 如果您想查看 RNA 的大小分布，可以使用安捷伦小 RNA 试剂盒和安捷伦生物分析仪。
3. 根据制造商的说明，使用NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3准备测序文库（参见注释 11）。重要提示：手册中描述的所有反应都应在 PCR 管中进行并在热循环仪中孵育，因为精确设置温度对于这些步骤至关重要。
4. 在手册的步骤 F 之后，通过 qPCR 确定必要的 PCR 循环数：
a. 2 O稀释 1 μL 的 cDNA 。
b. 将正向和反向引物稀释至 10 pmol /µL。
c. 准备包含每个样品的主混合物：
0.4 µL 正向底漆
0.4 µL 反向底漆
1.7 µL H 2 O
5 µL SybrGreen预混液
d. 在 384 孔板中，将 2.5 μL 的稀释 cDNA 与 7.5 μL 的主混合物混合并密封板。一式三份测量样品。
e. 使用以下设置运行 qPCR：
95°C 下 2 分钟
30 个循环：
95°C 时 20 秒
60°C 下 30 秒
72°C 时 18 秒
f. 手册步骤 G 的 PCR 循环数应比 qPCR 确定的 Ct 少 3 个循环，以产生约 20 nM浓度的库。
5. 在手册步骤 G 之后，取 1 µL PCR 产物，用 3 µL 水稀释，并用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒检查大小分布。除非在 130 bp 处有强峰，否则可以使用无凝胶大小选择。
6. 完成的文库可以在 -20°C 下长时间保存。我们建议将所有库调整到相同的浓度。浓度越高（例如，需要 20 nM ），文库越稳定。
7. 根据需要复用文库并在 NextSeq500 设备上进行测序。
数据分析
A. 确保在您的 Linux 设备中安装了perl 、R（在 / usr /bin下带有RScript ）和gzip包。
B. 在您的工作目录中创建一个名为“tools”的目录，用于存储所需的软件（ bowtie、 fastx 、 FastQC 、 samtools和 STAR）。整个目录可以从我们的 OSF 项目页面下载。
C. 准备对齐参考：
1. 所需fasta文件的目录“ ref_fasta ” ，其中包含人类 tRNA 和 rRNA 序列，以及人类和酵母转录组序列集。
2. 可选：如果您更喜欢这些序列的更新版本，或者如果您使用不同的物种，您可以从 UCSC 基因组浏览器或其他来源下载fasta文件，并替换相应的序列。在第三个比对步骤中（参见数据分析中的 G 部分），您需要一个包含转录组序列和标题的fasta文件，该文件由转录 ID 和由下划线分隔的基因 ID 组成（例如，ENSMUST00000169927.1_Adora1）。这是必要的，因为读数是在基因水平上汇总的（见注释 12）。为了准备这个fasta文件，您可以使用我们 OSF 项目页面中名为 scripts 的目录中的 R 脚本create_fasta.R 。从 UCSC 基因组浏览器下载的酵母fasta文件不需要修改，因为在标题中有一个字符串来区分酵母和人类转录本就足够了。
3. 为索引创建一个目录并运行 bowtie-build：

D. 将fastq文件存储在名为“ raw_data ”的目录中。
如果您想下载我们原始文章(Haneke et al ., 2020)中提供的数据，请使用sratoolkit和您可以在我们的 OSF 项目页面上找到的加入列表：

E. 删除带有fastx的适配器以及使用perl脚本 trim.pl的第一个和最后一个 4 nt （它们是随机序列）。只有包含接头序列且末端至少包含 20 nt的序列才会被保留。

F. 可选：在剪辑后的序列上运行FastQC ，以获取有关移除适配器后读取的数量、长度和质量的信息。

G. 将剪辑的序列连续对齐到 tRNA、rRNA以及酵母和人类的联合转录组。只有在一个步骤中未对齐的读取才会传递到下一步。如果您使用自己的序列，则必须调整转录组索引（联合）的前缀。

H. 或者，您可以保留映射到 tRNA 或 rRNA 的序列，以及根本没有映射的序列。它们可能包含有关可能不需要的污染物的有价值信息。
1. 对齐剪辑的序列：

2. FastQC和我们内部开发的脚本 bam2fq_unique.pl检查一组 bam 文件中读取的数量、大小分布和序列，例如污染 rRNA 片段；这确保每次读取只计算一次，即使它可能在 bam 文件中表示多次：

I. 过滤转录组 bam 文件以删除与多个基因的同种型对齐的所有序列（基于通用基因符号）。因此，与人类和酵母序列对齐的读取也将被删除。每次读取，只会保留一个对齐。

J. 准备一个名为 start_stop.csv 的 csv 文件，其中起始和终止密码子的坐标从 1 开始。第一列包含 ORF 的转录本 ID，例如ENST00000371007.6 表示 ENST00000371007.6_C1orf141，第二列包含转录本上起始密码子的第一个核苷酸的位置，第三列包含第一个核苷酸的位置终止密码子。我们在 OSF 项目页面的ref_fasta目录中为我们的参考转录组提供此文件。如果您想自己制作这个文件，您可以按照我们的 OSF 项目页面上的脚本start_stop.R 。
K. 可选：起始密码子和终止密码子周围的读数的周期性和分布可以分别针对不同的读数长度进行可视化，作为质量控制并确定起始密码子处的 P 位点偏移（参见注释 13）。
1. 生成包含 5' 末端与起始或终止密码子之间特定距离的读取次数的文件。我们通常检查 27-33 nt长度的读数，并且只考虑 UTR 至少为 40 nt 的 mRNA。

2. 生成可视化读取分布的 PDF，如图 3 f或 29-31 nt长读取示例所示：

图 3. 起始密码子和终止密码子周围的周期性和读数分布。
读取的 5' 末端与起始或终止密码子之间的距离针对不同的读取长度分别确定。三帧以不同的颜色表示（1：红色，2：紫色，3：蓝色）。
L. 读数在基因水平上进行总结。对于人类 mRNA，仅考虑与注释的 ORF 对齐的读取。因此，需要文件 start_stop.csv（参见数据分析中的 J部分）。我们没有根据大小排除读取，而是考虑了 20 nt ( min_len ) 和 85 nt ( max_len ) 之间的所有读取。在起始密码子和终止密码子处，我们假设 P 位点偏移为 12 nt （ offset_start和offset_stop ，参见注释 13）。此外，还需要一个标识酵母转录本的字符串（酵母标记）。

M. 对于我们原始文章中的数据，可以使用 R 脚本analyze_RD.R确定每个条件和基因的平均 RD 。人类读取计数按样本除以与蛋白质编码基因对齐的酵母读取计数的总和，以考虑 RD 的全局变化。蛋白质编码酵母基因由表“sacCer3_ensemblSource”定义，从 UCSC 基因组浏览器下载。此外，该脚本包含统计分析，可使用 DESeq2 包的 LRT 测试来识别 RD 中具有显着变化的 mRNA，而不受全局影响（图 4）。结果导出为文件 results.csv。

图 4. 标准化 RD 作为散点图。
人类 ORF 读取计数标准化为酵母 ORF 读取计数的总和。核糖体密度 (RD) 计算为足迹计数与输入计数 (FP/IN) 的比率。该比率的平均值由三个独立的生物学重复确定。差异调节的 mRNA 使用 DESeq2 包进行鉴定。突出显示在Benjamini -Hochberg 多重测试校正后 p 值 <0.05且倍数变化 >2 或 <0.5 的 RD。总最小二乘回归线用红色表示，通过原点的直线用黑色表示，斜率 =1。
笔记
1. 尽管有许多人类蛋白质的酵母同源物，但编码序列对于我们的目的来说是完全不同的。在决定使用酿酒酵母裂解物作为掺入之前，我们生成了人类参考转录组的小片段（数据分析中使用的参考fasta文件，G）并将它们与酵母参考对齐，反之亦然。在这个过程中，与核糖体足迹相关的长度片段（≥28 nt ）与相反转录组的对齐率小于 0.05%。这些片段将被排除在我们的分析之外，因为它们不能被唯一地归因。
2. 冷冻的全细胞酿酒酵母裂解液可以制备一次，并以等分试样形式储存，以备后用在- 80°C。可以如前所述制备含有裂解物的酿酒酵母多核糖体(Friedrich et al . , 2021) 。
3. 的RiboZero Gold rRNA 去除试剂盒不再单独购买。它已被Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo -Zero Plus 试剂盒 (20040525) 取代，该试剂盒包括用于文库制备和总 RNA 测序的试剂。可以购买该试剂盒并仅使用RiboZero试剂，也可以使用其他公司的 rRNA 去除试剂盒。示例包括ThermoFisher Scientific的Ribominus试剂盒和 NEB 的NEBNext rRNA Depletion Kits。或者，可以使用自制的杂交寡核苷酸去除 rRNA (Kraus et al ., 2019) 。
4. Isco Foxy Jr 梯度分馏器设计的PeakTrak软件不再更新/支持，并且可能无法在较新的计算机上运行。
5. 在Haneke等人使用的原始协议中。 (2020) ，在血清饥饿的 RPE1 细胞中执行Ribo -seq 方案，以确保细胞已退出细胞周期并进入静止状态。为此，将 3 × 10 6 R PE1 细胞稀释到含有 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的不含 FBS 的 Ham's F12 培养基中，并在 48 小时前接种到 15 cm 培养皿中本实验。对于药物治疗，还使用了含有 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的新鲜无血清 Ham's F12 培养基。
6. 用 CHX 处理细胞可稳定现有的多核糖体并防止核糖体在裂解过程中流失，但也已知会在 RD 中引入偏差，尤其是在转录物的 5' 端。因此，在Haneke等人使用的原始协议中省略了此步骤。（2020 年）。
7. 我们在实验中经常使用多核糖体缓冲液 A 和多核糖体裂解缓冲液 A，但也测试了多核糖体缓冲液 B 和多核糖体裂解缓冲液 B，它们显示出相同的效率。
8. 可能需要根据样品的来源调整核酸酶消化条件。所描述的条件对我们手中的哺乳动物细胞系最有效，但在 RT 下用较少的 RNase I 进行较长时间的消化也是可能的。一般来说，建议始终运行并记录消化和未消化样品的多核糖体谱，以便能够估计样品的质量和整体翻译状态。此外，还运行并记录加载酵母掺入的多核糖体梯度，以评估掺入样品的质量、数量和翻译状态。
9. 我们建议通过蔗糖密度梯度离心而不是蔗糖垫来分离亚多聚体和多聚体部分，因为它可以更好地判断 RNase I 消化和更好地将单体与残留的未消化多聚体分离。
10. 对于常规的核糖体足迹，不一定需要小 RNA 梯，因为两个大小的标记寡核苷酸定义了从凝胶中切出的区域。然而，如果需要其他片段大小（例如 21 nt片段用于停滞的核糖体，或 60 nt片段用于碰撞核糖体），小 RNA 标记是有益的。或者，可以设计和购买不同大小的大小标记寡核苷酸。
11. 手册中提到的起始材料被认为是总 RNA。由于来自Ribo -Seq 实验的 RNA 已经经过大小选择，因此可以使用较少的材料，并且试剂盒中提供的接头不应被稀释（与手册中的说明相反）。
12. 我们将人类核糖体保护片段或输入片段的测序读数与转录组序列对齐，并在基因水平上对其进行总结。为此，所有仅与一个特定基因（由一个共同基因符号定义）的同种型比对的序列都被计算为该基因。我们采用这种务实的方法作为折衷方案：一方面，我们只想考虑可以唯一归因于特定基因的读取；另一方面，我们希望避免源自重复基因或基因内串联重复的读数丢失，这种情况发生在映射到整个基因组后仅允许唯一比对时。
13. 作为质量控制的一个可选步骤，我们将起始和终止密码子周围的读数的周期性和分布可视化为样本中所有唯一注释读数的集合（数据分析，L.2）。为此，我们确定了每个读数的 5 '端与基因任意异构体的起始或终止密码子的第一个核苷酸之间的距离。由于替代翻译起始位点，这个距离不一定总是正确的，核糖体足迹的质量可能被低估了。通常，读取在起始密码子上游 12 nt处积累，起始密码子源自在 P 位点携带起始密码子的起始核糖体。此 P 位点偏移量可用于计数 ORF 读取（数据分析，M， offset_start ）。同样，可以限制读取的长度，例如，显示周期性的读取长度，尽管我们没有限制我们在这方面的分析（数据分析，M， min_len和max_len ）。
食谱
注意：列出的所有浓度均为最终浓度。
1. PBS (20×)
2.7 M 氯化钠
54 毫米氯化钾
200 毫米钠2 HPO 4
pH 7.4，高压灭菌
2. 多核糖体缓冲液 A (2×)
40 mM Tris-HCl pH 7.4
10 毫米氯化镁2
300 毫米氯化钠
3. 多核糖体缓冲液 B (2×)
40 mM Tris-HCl pH 7.4
20 毫米氯化镁2
400 毫米氯化钾
4. Polysome 裂解缓冲液 A
20 mM Tris-HCl pH 7.4
5 毫米氯化镁2
150 毫米氯化钠
1% 海卫 X-100
100 µg/mL 放线菌酮
1 毫米 DTT
完全蛋白酶抑制剂
5. Polysome 裂解缓冲液 B
20 mM Tris-HCl pH 7.4
10 毫米氯化镁2
200 毫米氯化钾
1% NP-40
100 µg/mL 放线菌酮
1 毫米 DTT
完全蛋白酶抑制剂
6. 尿素缓冲液
10 mM Tris-HCl pH 7.5
350 毫米氯化钠
10 毫米乙二胺四乙酸
1% 安全数据表
7 M尿素
7. 随机碎片缓冲区
注意：应在使用前直接新鲜制备！ 100 mM NaHCO 3和 Na 2 CO 3储备溶液可以在室温下储存更长的时间。
2 毫米乙二胺四乙酸
88 毫米碳酸氢钠3
12 毫米钠2 CO 3
8. 停止/沉淀溶液（每个样品的体积）
20 µ L 3 M NaOAc pH 5.2
1 µL糖蓝
20 µL 3 M NaCl
139 µL 无 RNase 水
9. TBE (10×)
1 M Tris
0.889 M 硼酸
20 毫米乙二胺四乙酸 (pH8.0)
10. RNA 上样染料 (3×)
1× TBE
8 M 尿素
30 毫米乙二胺四乙酸
20% 甘油
痕量溴酚蓝和二甲苯酚
致谢
该方案最初应用在我们由 The Journal of Cell Biology (Haneke et al. , 2020)发表的“ CDK1将增殖与蛋白质合成结合”的研究中。我们的工作得到了 SPP 1935 (DFG) 和 TRR 319 (DFG) 的资助。我们要感谢 Ulrike Friedrich、Guenter Kramer 和 Bernd Bukau （均在德国海德堡大学分子生物学中心）提供酵母裂解物。此外，我们要感谢 Georg Stoecklin （海德堡大学曼海姆医学院）对我们工作的宝贵支持，以及 Doris Lindner（海德堡大学曼海姆医学院）为建立该协议提供的技术援助。
利益争夺
作者声明没有竞争利益。
参考
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