材料和试剂
1. Fisherbrand高精度无菌手术刀刀片（Fisher，目录号： 12-000-161）
2. Nunc TM EasYFlask TM T-75 细胞培养瓶（Fisher，目录号：12-565-349）
也可以使用组织培养皿（直径 100 mm）（ Nunc TM EasyDish TM菜肴； Fisher 目录号：12-600-003)。
3. 冰冷的1.5 mL微量离心管（Fisher，目录号：05-408-129）
4. 5 mL微量离心管（Eppendorf，目录号：0030119401）
5. 无菌15 mL离心管（Thermo Scientific Nunc，Fisher，目录号：12-565-268）
6. 无菌 50 mL 离心管（ ThermoScientific Nunc，Fisher，目录号：12-565-270）
7. Thermo Scientific Nunc Lab-Tek 八孔 Permanox塑料腔室滑动系统（Fisher，目录号：12-565-22）
8. A549人NSCLC细胞（ATCC，目录号：CCL-185）
9. F-12K 培养基（ Kaighn对 Ham 的 F-12 培养基的改进；ATCC；目录号：30-2004）。储存于 4 °C
10. Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640 酚红培养基（ATCC，目录号：30-2001）。储存于 4 °C
11. Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640 培养基，不含酚红（Fisher，目录号：30-404-014）。储存于 4 °C
12. 胎牛血清（FBS）（ATCC，目录号：30-2020）
FBS 的长期储存温度为 -20 °C 。在我们的实验室中，FBS 被等分到 50 mL 离心管中，并在 -20 °C 下储存。 FBS 等分试样储存在 4 °C以供立即使用。
13. 胰蛋白酶-EDTA（0.25% 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA，ATCC，目录号：30-2101）
胰蛋白酶-EDTA 的长期储存在 -20 °C 下储存。然而，胰蛋白酶-EDTA 被等分并储存在 4 °C以供立即使用。
14. 不含钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，Fisher，目录号：21-031-CM）。储存在 4 °C 。
15. Matrigel膜基质（Fisher，目录号：CB-40234）
°C时为液体，在 37 °C时固化。将 Matrigel 等分并储存在 -70 °C以供长期储存。实验前，Matrigel 在 4 °C 下放置过夜解冻。 Matrigel 在整个实验过程中保持在冰上。
16. 无酚红Matrigel膜基质（Fisher，目录号：CB-40234C）
17. PP2（ Src家族酪氨酸激酶的有效和选择性抑制剂）购自 Enzo Biosciences（目录号，50-201-0681）
PP2 是粉末，储存在-20 °C 。 PP2 以 10 mM的最终浓度溶解在 DMSO（Corning DMSO，Fisher MT-25950CQC）中。将这种 PP2 溶液的储备溶液等分到微量离心管中并储存在 -20 °C 。在 SIA 之前，将 PP2 解冻并使用无血清 RPMI稀释至所需浓度。使用后，丢弃剩余的稀释 PP2 溶液（浓度为10 µM）。
18. 10 mM PP2（见配方）
19. 200 µM PP2（见配方）
设备
1. NU-540 ( LabGard ® ES NU-540 Class II, Type A2) 层流生物安全柜 ( NuAire , Plymouth, MN)
2. 保持在 37°C 和 5% CO 2的细胞培养箱（ Heracell VIOS 150i 细胞培养箱，Thermo Scientific，Waltham，MA）
3. 带摄像头的 Leica DM IL LED 倒置相差显微镜（Leica Microsystems， Welzar ，德国）
4. Corning 细胞计数室（Fisher，目录号：07-200-988）
5. 实验室网 Hermle Z306 通用台式离心机； 120V ( Labnet International, Cary, NC)
软件
1. LAS 图像捕捉软件（徕卡显微系统）
2. Adobe Photoshop 2021（适用于 Windows 的 Adobe Inc.）
3. Adobe Illustrator 2021（适用于 Windows 的 Adobe Inc.）
4. NIH ImageJ 1.47 版（美国国立卫生研究院，贝塞斯达）
5. GraphPad 棱镜版本 8
程序
A. 在补充有 10% FBS 的 RPMI 中培养 A549 细胞
1. 人类 NSCLC 细胞系 A549 已通过 ATCC 细胞认证服务 (ATCC, Manassas, VA) 的认证。
2. 在含有 2 mM 谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素、50 µg/mL 链霉素和 10% FBS 的 F12K 培养基混合物中，A549 细胞在37°C 的湿润环境中生长至 70-80% 融合（在 5 % CO 2 ) 在细胞培养箱中。
B. 使用基质胶
1. 将 Matrigel 分装在冰冷的微量离心管中并储存在 -70°C。
2. 在开始实验之前，将所需量的 Matrigel在 4 °C 下解冻过夜。 Matrigel 始终保持在冰上。
3. °C时为液体，在 37 °C时固化。因此，在处理 Matrigel 时，所有塑料器皿和试剂都必须保持冰冷。
4. 解冻的 Matrigel 是一种浓稠的粘性液体。因此，移液器吸头应在吸头处进行修整（以增加吸头的直径），以便将 Matrigel 移入/移出微量离心管。使用无菌手术刀刀片修剪尖端。在处理 Matrigel 时，所有微量离心管和移液器吸头都保持冰冷。在我们的实验室中，我们使用冰冷的 RPMI 作为冷却介质。在使用它们处理 Matrigel 之前，将所有移液器吸头浸入冰冷的介质中以使其冷却。
C. 球形侵袭试验
第1 天
1. 在开始实验之前，请绘制如图 1所示的检测模式。该测定将设置在八孔室载玻片中。腔室滑块侧面的黄色区域用于将其抬起并四处移动。

图1.八井室载玻片中的示例球形入侵检测示意图。
2. A549 人 NSCLC 细胞在补充有 10% FBS 的 F-12K 中的 T-75 组织培养瓶中生长至约 70-80% 汇合。
3. 用 DPBS 清洗细胞一次，并使用 0.25%胰蛋白酶-EDTA 从烧瓶中对它们进行胰蛋白酶处理。
4. 添加 1 mL 的 FBS 以使胰蛋白酶失活。通过轻轻上下吹打吸出细胞，并将它们收集在 15 mL/50 mL 无菌离心管中。
5. 以 800 ×轻轻旋转细胞 g 5 分钟。吸出培养基并将细胞重新悬浮在 RPMI（含酚红）/20% FBS 中。
6. 使用康宁细胞计数室计数细胞。在含有 20% FBS 的 RPMI（含酚红）中将细胞浓度调整为 50 × 10 6 个细胞/mL。该管被标识为 TUBE A。
7. PP2 在无血清 RPMI（含酚红）中稀释至 200 µM 的浓度。该库存始终以 20 ×浓度制备，其中 x 是 SIA 中药物的最终浓度。用于 SIA 的 PP2 的最终浓度为 10 µM。因此，PP2 库存为 200 µM。
8. 在单独的离心管中，将细胞（来自 TUBE A）与 PP2（浓度为 200 μM）以 10:1（v/v）的比例混合。这会将 PP2 稀释至 PP2 = 20 µM 的浓度。例如，您可以将 45 µL 细胞悬液（来自 TUBE A）添加到 5 µL PP2 中。因此，PP2 的新浓度 = 20 µM。我们称它为 TUBE B。
9. 将几个离心管放在冰上以使其冷却。在冰冷的离心管中以 1:1 的比例将细胞与 Matrigel 混合。如步骤 6 所述，将细胞重新悬浮在 RPMI（含酚红）/20% FBS 中。一旦细胞在 Matrigel 中混合（以 1:1 的比例），培养基的最终浓度将降至 RPMI（含酚红）/10% FBS。例如，将 15 μL 的 Matrigel 与 15 μL 的细胞悬浮液（取自 TUBE B）混合。通过轻弹管将细胞与基质胶混合，使管中的最终 PP2 浓度为 10 μM。该管被称为TUBE C。
10. 同样，将 15 µL 未经处理的对照 A549 细胞与 15 µL Matrigel 在单独的微量离心管中混合。该管称为 TUBE D。
11. 从包中取出一个腔室幻灯片。将腔室幻灯片放在一张薄纸上的盘子里。如果将其直接放在头部表面，则腔室滑轨的底部往往会粘在引擎盖的地板上，并且很难抬起腔室滑轨。
12. 取出 6 μL 的细胞悬浮液，并将其作为液滴放在腔室幻灯片的中心。每个样品均重复测定。 TUBE D 遵循类似的过程。腔室载玻片在细胞培养箱中在37 °C下孵育一小时。图 2是腔室载玻片的示意图，其中下落位于井的中间。

图2.八井室载玻片中球形入侵检测的第一步示意图。
将细胞与含酚红的基质胶（作为 1:1 悬浮液）混合，并以液滴的形式铺板在腔室载玻片的每个孔的中间。这个水滴在上图中用粉红色的圆圈表示。
13. 1 小时后，在每口井中加入 250 μL 的 RPMI（含酚红）和 10% FBS。在细胞培养箱中将腔室幻灯片在 37 °C 下放置 24 小时。
14. °C 下过夜解冻一小瓶无酚红基质胶。如果检测设置如上图所示，那么我们将需要 125 μL 的无酚红基质胶每孔室载玻片。
第 2 天
1. 用等体积的含有 20% FBS 的无酚红 RPMI 稀释无酚红基质胶。将此溶液放在冰上。
2. 在相差显微镜下观察腔室载玻片。细胞位于液滴内。
3. 从腔室幻灯片中吸出介质。使用移液器轻轻取出介质，而不会干扰腔室幻灯片中心的液滴。
4. 将 250 μL 的 1:1 无酚红 Matrigel 溶液（用无酚红 RPMI 稀释，辅以 20% FBS）覆盖在滴下。下面提供了腔室幻灯片的示意图（图 3）。粉红色滴代表基质胶的初级层，粉滴周围的浅灰色区域代表不含酚红的基质胶。腔室载玻片在细胞培养箱中在 37 °C下孵育 1 小时。 1 小时后，在每口井中加入 250 μL 的 RPMI（含酚红）和 10% FBS。在细胞培养箱中将腔室幻灯片在 37 °C 下放置 24 小时。
我们通过将药物（在本例中为 PP2）添加到 Matrigel 的第二层来执行 SIA。然而，我们观察到药物在第二基质胶层中的存在/不存在对测定结果没有显着差异。因此，我们不将药物添加到 Matrigel 的第二层。

图3.八孔室载玻片中球形入侵检测的第二步示意图。
第一步是将细胞与含酚红的基质胶（以 1:1 的比例）混悬液混合，然后将它们以液滴的形式放置在腔室载玻片的每个孔的中间（如上图中的粉红色圆圈所示）。在第二步中，将不含酚红的基质胶与不含酚红的 RPMI（体积比为 1:1）混合并覆盖在第一层上（如上图中灰色区域所示）。
第 3 天
1. 在相差显微镜下观察腔室幻灯片。清楚地看到细胞从初级基质胶层径向侵入到次级基质胶层。第一层含有高浓度的 A549 细胞和含有酚红的基质胶。第二层由不含酚红的基质胶组成，不含细胞。因此，细胞从初级层到次级层的迁移非常清晰和明显。另一个有助于使界面非常清晰的因素是使用两种不同颜色的Matrigel来创建主要层和次要层。第一层由与含有酚红的基质胶混合的 A549 细胞组成。在相差显微镜下，该层外观呈红黑色（图 4）。第二层是使用不含酚红的 Matrigel 制成的，颜色为浅粉色。界面总是非常清晰和明确。为每个样本拍摄三个独立的字段。
使用 adobe illustrator 和 ImageJ 处理图像。
1. 图 4显示了从 SIA 获得的代表性图像。以 20 ×放大倍率（比例尺 = 1 mm）拍摄图像。黑色箭头表示从初级基质胶层侵入到次级基质胶层的 A549 细胞。

图4.执行 SIA 后获得的代表性图像，如 C 节所述。
2. 在 ADOBE ILLUSTRATOR 中打开图像。使用钢笔曲率工具，在两层的界面上画一条虚线（图 5）。

图5. Adobe Illustrator 用于处理图 4 中获得的图像。
在两层的界面上画一条虚线。
3. 将图像导出到 ADOBE PHOTOSHOP 并以 jpeg 格式保存。
4. 在 ImageJ 中打开 jpeg 文件。使用线工具，绘制一组十条线，追踪 A549 细胞侵入次级基质胶层的距离（图 6）。画完每条线后，按CTRL-M即可获得所画线的长度。

图 6. 图 5 中获得的图像文件通过 ImageJ 打开。
在线条工具的帮助下，绘制了一组十条线，追踪 A549 细胞侵入次级基质胶层的距离。
5. 打开 GraphPad 棱镜。使用 ImageJ 程序获得的数字，创建一个柱形图（图 7）。由符号 * 表示的值相对于对照具有统计学差异 ( P < 0.05)。

图 7. 通过 ImageJ 程序量化显微图像后，使用 GraphPad Prism 绘制数据。
由符号 * 表示的值与对照在统计学上显着不同（ P ≤ 0.05）。
数据分析
在 SIA 中对每个样品进行一式两份测试。整个测定重复六次独立的时间。使用相差显微镜对该测定进行量化。为每个样品捕获了三个代表性图像（放大倍数为 20倍）。这些图像由 ImageJ 由三位独立观察者以随机双盲方式进行量化。使用 GraphPad Prism（版本 8）绘制数据。所有数据均绘制为平均值±标准偏差 (SD)。通过执行方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 事后检验来分析数据。所有分析均使用 95% 置信区间完成。当P <0.05时，数据被认为是显着的。 SIA 的协议已发表在 Cell Adhesion and Migration 上。该论文的链接如下：
Hurley，JD，Akers，AT，弗里德曼，JR，诺兰，NA，布朗，KC，达斯古普塔，P 。（2017 年）。无刺激性长链辣椒素类似物 arvanil 和 olvanil 在人类小细胞肺癌中显示出比辣椒素更好的抗侵袭活性。细胞粘附移民11（1）：80-97。
讨论
SIA 是一种测量细胞、生长因子、细胞因子和类固醇侵袭能力的新方法。它还可用于量化抗转移药物的侵袭抑制活性。在此测定中要记住的一个非常重要的因素是使用相关浓度的药物。例如，如果使用非常高浓度的抗癌药物，它会杀死细胞，这也会阻止细胞侵入次级基质胶层。因此，药物应以不影响细胞活力的浓度使用。如果该药物不影响细胞活力，但对第二层的侵袭减少，则可以推测该药物具有抗侵袭活性。 SIA 的结果应通过 Boyden室侵袭试验确认，并且基于这两种试验的综合结果，我们可以确定候选药物是否具有抗侵袭活性。包括对 SIA 的相关控制也很重要。细胞侵入的距离（在第二基质胶层中）不是一个绝对数；它因细胞系的性质、培养条件、Matrigel 的批间差异以及测定的时间尺度而异。必须将测试样本的入侵与对照进行比较，以确定入侵过程是否有影响。例如，PP2 处理的细胞侵入的绝对距离可能因细胞系而异，但始终低于未处理细胞的促侵入活性。在我们的实验室中，我们在 48 小时内执行 SIA。然而，SIA 可以在比 48 小时更短的时间点进行。我们观察到细胞从初级层迁移到次级层大约需要 12-18 小时。牢记这一事实，可以相应地调整测定的时间范围。
SIA 可以使用减少生长因子的 Matrigel 进行。这使研究人员能够控制存在于次级层中的促侵入生长因子、趋化因子梯度和内源性抗侵入因子。这个过程允许在实验中创建特定的趋化因子梯度和定义的肿瘤微环境。一个重要的问题涉及在 SIA 中使用阳性和阴性对照。侵袭的过程不仅限于癌症；它发生在许多正常的生理过程中，如伤口愈合、月经、组织重塑、发育、胚胎发生和免疫反应。给定适当的细胞信号，所有细胞都有能力侵入周围的基质，因此不可能识别出不会在 SIA 中显示任何侵入的细胞系。通常观察到，与正常细胞相比，癌细胞显示出更高的侵袭性。考虑到这一点， SIA 的良好阳性对照是使用已知的促侵入或抗侵入药物，具体取决于实验的性质。
食谱
1. 10 毫米 PP2
PP2的分子量=301.78
在无菌 5 mL 离心管中称量 6 mg PP2。在层流罩中，将 PP2 溶解在 2 mL 的 DMSO（康宁 DMSO、Fisher MT-25950CQC）中。短暂涡旋以获得 10 mM PP2。将这种 PP2 溶液的储备溶液等分（作为 50 µL 等分试样）到微量离心管中，并在 -20°C 下储存。
2. 200 µM PP2
解冻一份 PP2。在 1 mL 的无血清 RPMI 中加入 20 μL 的 PP2。大力旋涡。现在 PP2 的浓度为 200 µM。按照 C 部分第 7 步中的说明使用此 PP2 溶液。丢弃剩余的溶液。
致谢
Chellappan博士及其实验室的持续支持。 SDR 分别是 NSF-SURE 和 WV-NASA 太空联盟本科奖学金的获得者。 PD 和 MAV 得到美国国立卫生研究院 R15 学术研究增强奖（赠款 1R15CA161491-02 和 2R15CA161491-03）的支持。 NIH R15AI15197-01 和 R15HL145573-01 也支持 MAV。这项工作部分得到了西弗吉尼亚州IDeA生物医学研究卓越网络 (WV-INBRE) 赠款 (NIH 赠款 P20GM103434; PI: G. Rankin 博士)、美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的支持奖励编号 P30GM122733。 SIA 的协议基于Evensen的研究论文等人。（2013 年）和 Stitt等人。（2005 年）。埃文森的论文等人。 (2013) 描述了一种筛选新型抗癌药物的高通量侵袭试验。 Stitt等人发表的报告。 (2005) 概述了 Matrigel Duplex 检测的方案。
利益争夺
作者声明没有竞争利益。
参考
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