材料和试剂

材料

1. 48孔花盘（Mp2 Labs，目录号：MTP-48-B）

2. 密封箔减少蒸发（Mp2 Labs，目录号：F-GPR48-10）

3. 无菌 1.5 mL 管（Eppendorf，目录号： 0030120086）

4. 培养管（VWR，目录号：211-0082）

5. 比色皿 PS（VWR，目录号：634-0676）

6. 50 mL Falcon 管（Corning，目录号：352070）

7. 培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5731）

生物材料和试剂

1. 酿酒酵母菌株 B184 ura3 Δ

2. 质粒 pRS416-TEF1 -roGFP2 - PRX1 ( Morgan et al ., 2016 )

3. 质粒 pRS416M1-TEF1（对照）（ Kaur 和 Bachhawat，2009 ），但质粒 pRS416-TEF1 也同样有效。 pRS416M1-TEF1 是通过去除 pRS416-TEF1 克隆位点中的所有限制性位点构建的，除了 BamHI 和 EcoRI。

4. 煮沸的ss-载体DNA

5. 无菌 H ₂O（储存在 RT）

6. 无菌 0.1 M LiAc（储存在 RT）

7. YNB w/o AA（Formedium，目录号：CYN0405）

8. NaH ₂PO ₄·2H ₂O（Merck，目录号：06342）

9. Na ₂HPO ₄（Merck，目录号：06586）

10. 葡萄糖·H ₂O（Merck，目录号：08342）

11. BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）

12. 精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5006）

13. 天冬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9256）

14. 谷氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G1251）

15. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126）

16. 组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H8000）

17. 异亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：I2752）

18. 亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L8000）

19. 蛋氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）

20. 苯丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2126）

21. 苏氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8625）

22. 色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0254）

23. 酪氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T3754）

24. 缬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：V0500）

25. 酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：AC451120010）

26. LiAc （Sigma-Aldrich，目录号：L6883）

27. PEG 3350（Sigma-Aldrich，目录号：202444）

28. 琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：05040）

29. 完整的补充剂混合物 Single Drop-Out-Ura（Formedium，目录号：DCS0169）

30. SD2xSCAA 培养基（储存在 4 °C）（参见食谱）

31. SD-URA 琼脂板（4 °C 储存）（参见食谱）

32. 酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基 (YPD)（储存在 RT）（参见食谱）

33. 无菌 50% PEG 0.1 M LiAc（储存在 RT）（见食谱）

设备

1. 微量移液器（Eppendorf，型号：Research ^®plus ）

2. BioLector I ( Mp2 Labs, BioLector)

3. 排放过滤器：

一个。 GFP 滤光片：激发 480 nm 和发射 520 nm （ Mp2 Labs，型号：E-OP-404）

湾。 UV-GFP 滤光片：激发波长 405 nm，发射波长 508 nm（ Mp2 Labs，型号：E-OP-412）

C。生物质过滤器：吸收 620 nm （ Mp2 Labs，型号： E-OP-401）

4. OD 分光光度计( ThermoFisher, Genesys 20 )

5. 温度控制在 30°C 的环境

6. 42°C水浴

7. 带有 96 个培养管支架的摇床（VWR，高级轨道摇床）

8. 紫外线杀菌层流罩

9. 离心机（Eppendorf，型号： 5417 R）

软件

1. RStudio：R 的集成开发环境。（2021）（ Rstudio Team，Vienna，Austria， https ://www.rstudio.com ）（可选）

2. BioLection 软件 ( Mp2 Labs )

程序

A. 改造 酿酒酵母 具有pRS416 -TEF1- roGFP2-PRX1和 pRS416M1-TEF1的 ura3 Δ菌株

1. - roGFP2-PRX1和 pRS416M1-TEF1的质粒 DNA （如有必要）。

2. 酿酒酵母ura3 Δ菌株在培养管中接种 2 mL 液体 YPD，并摇晃（30 °C时 200 rpm ）过夜。

3. 将 20 mL 新鲜 YPD 接种到 50 mL Falcon 管中，加入 1 mL 过夜培养物，并在30°C下以 220 rpm 摇动。

4. 孵育 5-6 小时后，旋转S. cerevisiae细胞（3,500 × g时 3 分钟）。

5. 在无菌环境中取出 YPD（例如，在层流罩中），用无菌水、涡旋洗涤细胞并向下旋转（3，500 × g下3 分钟）。

6. 在无菌环境中取出无菌水，用 0.1 M LiAc、涡旋洗涤细胞并向下旋转（3，500 × g下3 分钟）。

7. 在无菌环境中取出 0.1 M LiAc ，加入200 μL新鲜的0.1 M LiAc，涡旋，保持悬浮细胞这样。

8. 每个菌株取三个高压灭菌的 Eppendorf 管，加入 5 μLl 煮沸的 ss-载体 DNA 和两种质粒（100-500 ng）到分离管中，留下一个阴性对照（不添加 DNA）。还加入 25 μL 酵母 0.1 M LiAc 混合物，最后加入 200 μl 50% PEG 0.1 M LiAc。涡旋管并在 30 °C 的房间中孵育 35 分钟至 3 小时，同时摇动。可以丢弃其余的单元格。

9. 打开水浴至 42°C 并孵育管子 20-30 分钟。

10. 以 8,000 rpm 的速度旋转 20-30 秒并去除上清液。

11. 加入100-200 μL 无菌水并重悬沉淀。

12. 将悬浮液放在标记的 SD-URA 琼脂板上。

13. 30 °C 下孵育板 72 小时。

B. BioLector 中的微培养

在开始这个实验之前，确定 48 孔板的布局。留下一个或两个只含有培养基的孔，它可以作为 BioLector 的“空白”和无菌处理的控制。我们包括三个生物学重复，每个包括两个技术重复 pRS416-TEF1-roGFP2-PRX1 质粒的菌株，以及两个生物学重复，每个菌株携带pRS416M1-TEF1 对照质粒两个技术重复。如果要比较菌株的细胞内 H ₂O ₂，则应在同一实验中检查它们，因为实验之间的确切曲线略有不同。 BioLector 板是无菌交付的，仅供一次性使用，但在按照以下程序清洁后可以重复使用一次或两次。上一次运行后直接收集废物，并用 70% 乙醇洗涤板两次。用软化水冲洗多次以去除乙醇。让盘子风干，并在底部用塑料层保护。在下一次运行之前，用紫外线消毒至少 30 分钟。

1. 在选择性固体 SD-URA 培养基上对每个菌株重新划线三个（或更多）菌落。

2. 在含有 1 mL SD2xSCAA 的单独培养管中接种从每个菌株的 SD-URA 选择性板中分离的三个菌落。

3. 以大约 45° 的角度孵育培养物并摇动过夜（在 30 °C下 220 rpm ）。

4. 过夜孵育后，确定 O D ₆₀₀ 用分光光度计进行预培养。

5. 准备 3 ml新鲜的 SD2xSCAA 培养基并添加预培养物，直到 OD ₆₀₀为 0.01 或 0.005（无洗涤步骤）。

6. 从这些 3 ml 管中，将两个 1 mL的技术复制品添加到 48 孔花板的孔中。

7. 在所有孔都填满后，用密封箔盖住板以减少蒸发，并确保点位于孔的中间。

8. 将板装入 BioLector。之前，去除底部的保护层！

9. 确保将（去矿物质的）水重新加注到 BioLector 中的 150 mL 标记以上，以控制湿度。

BioLector 的设置。

a. 温度控制打开并设置为30 °C。

b. 湿度控制打开并设置为 85%。

c. 摇动并设置为 1200 rpm。

d. 滤光片和测量：使用三种不同的滤光片测量 1) 生物量浓度（620 nm 处的吸光度）、2) GFP 荧光（激发 488 nm）和 3) UV-GFP 荧光（激发 405 nm）。 BioLector 允许同时测量六个通道。由于该实验只需要三个不同的滤波器，因此可以选择测量每个滤波器的两个增益。对于 OD ₆₂₀，我们选择增益 20 和 30，对于 GFP，增益 50 和 100，对于 UV-GFP，增益 50 和 100。BioLector 测量所选六个通道的循环时间为 20 分钟。表 1 中显示了使用的滤波器和增益的概述。

表 1. BioLector 中使用的过滤器和增益设置。

三个 BioLector 滤光片的激发和发射波长以及用于每个滤光片的相应增益设置的信息。

10. 开始测量（仔细检查塑料是否已从板底部移除）。运行过程中经常检查培养情况。

11. 完成后，取下盘子（并立即清洁）。

数据分析

数据分析协议提供了四个示例应变的测量值，此处重命名为应变 1、应变 2、应变 3 和应变 4，以将注意力引向氧化还原传感器测量。表 2 中显示了使用的菌株的说明，并将在协议末尾简要讨论；这也可以在原始文章( Gast et al ., 2021 )中找到。

1. 将数据从 BioLector 软件 (Biolection) 导出为 Excel 格式（或任何选择的格式）。

对于数据分析，我们仅使用 UV-GFP 和 GFP 的增益 100 和 OD _{620的增益 20 的数据}。

2. 将数据导入 R（或任何其他选择的软件）。数据包括每口井的三个测量值，OD ₆₂₀、 UV-GFP和GFP，每个测量值在每个时间点和时间都有其选择的增益。

3. 根据您的设置，第一步是从测量中去除介质的背景信号。这可以通过 BioLector 或手动完成。

表 2. 本协议中使用的菌株的基因型。

菌株基因型详细信息有助于解释我们实验中协议生成的数据。有关更多详细信息，请参阅原始研究（ Gast等人，2021 年）。

4. 绘制每个菌株的 OD ₆₂₀、 UV-GFP和GFP与时间的关系。

5. 将带有传感器质粒的每个菌株的生长情况与带有对照质粒的同一菌株的生长情况进行比较。检查 OD ₆₂₀以确定表达roGFP2-Prx1传感器质粒(pRS416-TEF1- roGFP2-PRX1)的菌株是否生长和带有对照质粒的菌株（ pRS416M1-TEF1）具有可比性。在图2A中，我们显示了基于 OD ₆₂₀测量的菌株 4 的可比生长，该菌株 4 表达带有roGFP2-Prx1传感器的质粒与对照质粒（图 2A）。如果增长不具有可比性，则需要采取注释部分中概述的额外步骤。

图 2. OD ₆₂₀、UV-GFP 和 GFP 的测量值随时间作图。

编码roGFP2-Prx1传感器或控制质粒的质粒对菌株 4进行 OD ₆₂₀测量的平均值。光条显示每个应变的独立 OD ₆₂₀测量值的标准偏差，（B）使用 roGFP2-Prx1传感器（粉红色）或对照（橙色）对应变 4 的 UV-GFP 测量，（C）使用应变 4 的 GFP 测量值roGFP2-Prx1传感器（青色）或控制（浅绿色）。

6. roGFP2-Prx1传感器的 UV-GFP 和 GFP 测量值以及每种菌株的对照。

7. roGFP2-Prx1之间的荧光强度存在差异，请特别注意传感器和控制应变。

roGFP2 -Prx1传感器的细胞和对照细胞中UV-GFP 的原始测量结果，图 2C 中的 GFP 也是如此。在这两个图中，应变与roGFP2-Prx1 传感器和控件。在此步骤中，您可以验证传感器是否在您的设置中工作并控制重复中存在的异常值。异常值可能会被删除，但请确保您仍然使用roGFP2-Prx1传感器进行至少四次测量，使用对照进行三次测量。在具有对照质粒的菌株中测量的荧光对应于相应菌株的自体荧光。该控制的 UV-GFP 和 GFP 荧光强度应在下一步用生物传感器对应变的 UV-GFP 和 GFP 荧光测量值中减去。

8. 通过从roGFP2-Prx1 UV-GFP 和 GFP测量值中去除自发荧光来确定 UV-GFPcorr 和 GFPcorr 。

从 UV-GFP 和 GFP 值（ roGFP2-Prx1 测量值）中减去自发荧光（对照测量值）。首先，计算每个菌株的自发荧光平均值。每个时间点确定一个平均值。从相应应变的单个 UV-GFP 和 GFP 值中减去平均自荧光值。 UV-GFPcorr (1) 和 GFPcorr (2) 的计算公式如下所示。 UV - GFPcorr 和 GFPcorr 的平均值如图 3 所示。

(1)

(2)

9. 确定最终的 Ox/Red 比率。

在这最后一步中，使用为每个井和时间点确定的单个 UV-GFPcorr 和 GFPcorr 值来确定每个时间点和井的 Ox/Red 比率。使用实验中可用的 Ox/Red 比率，并确定每个应变和时间点的平均值以及相应的标准偏差。方程如下（3）所示。绘制最终图，在其中绘制应变与时间的平均比率，包括有关标准偏差的信息。图 4 显示了一个示例。

(3)

图 3。 应变 1（红色）、应变 2（绿色）、应变 3（蓝色）和应变 4（紫色）的 UV-GFPcorr 和 GFPcorr 测量值的平均值。

(A) UV-GFPcorr 值的平均值。 (B) GFPcorr 值的平均值。光条代表每个菌株中所有样品的标准偏差。

图 4. 菌株 1（红色）、菌株 2（蓝色）、菌株 3（绿色）和菌株 4（紫色）的平均比率 [Ox/Red]。

光条代表每个菌株中所有样品的标准偏差。

数据解读

为了将图 4 中的结果放在上下文中，我们在此提供原始研究的简要背景（ Gast等人，2021 年）。已知重组蛋白产生是H ₂O ₂和氧化应激的来源。然而，由于 H ₂O ₂检测方法的局限性，研究这些现象仍然很复杂（ Malhotra等人，2008 年）。在最初的研究中，roGFP2-Prx1 生物传感器用于记录重组蛋白生产对酿酒酵母胞质 H ₂O ₂水平的影响。菌株 1 是产生重组淀粉酶的酿酒酵母菌株，而菌株 3 是不产生重组蛋白的对照菌株。图 4 显示菌株 1 在大部分培养过程中具有较高的 Ox/Red 比率，表明由于重组蛋白生产，胞质溶胶中的 H ₂O _{2水平较高。}我们还对蛋白激酶 Gcn2 在重组蛋白生产和氧化应激中的作用感兴趣。激酶 Gcn2 以其在一般氨基酸控制途径中的作用而闻名（ Hinnebusch，2005 ）。当酿酒酵母经历氨基酸饥饿时，激酶 Gcn2 被激活并使翻译起始因子 eIF2a 磷酸化，导致翻译起始减少（ Hinnebusch，1984 年）。有趣的是，激酶 Gcn2 也可以通过向培养基中添加 H ₂O _{2来激活（}Shenton等人，2006 ）。在我们的研究中，我们检查了激酶 Gcn2 是否也可以被作为重组蛋白生产副产物产生的内源性 H ₂O _{2激活，以及激酶的去除是否会影响细胞溶质 H 2}O ₂和重组蛋白生产_。菌株 2 和 4 分别与菌株 1 和 3 相似，但缺少GCN2基因。有趣的是，尽管蛋白产量提高了两倍，但激酶 Gcn2 的去除导致产生淀粉酶的菌株中细胞溶质 H ₂O _{2的减少（将菌株 1 与菌株 2 进行比较）} （ Gast等人，2021 年）。然而，这在没有重组蛋白生产的菌株中看不到（比较菌株 3 和菌株 4）。

笔记

a) 我们发现 GFP 测量非常敏感，如果可能，我们建议使用新的 48 孔板。在重复使用 48 孔板时，我们确实获得了类似的结果，但似乎在清洁和重复使用时，板的灵敏度略有下降。

b) 如果携带带有roGFP2-Prx1传感器的质粒的菌株与对照质粒的生长不相似，则有必要将 GFP 和 UV-GFP 测量值标准化为生物量。这应该在从 GFP 和 UV-GFP 测量中去除自发荧光之前完成。然而，我们发现这种归一化导致了嘈杂的 Ox/Red 比率，尤其是在实验开始时细胞数量较少时。因此，我们决定排除这种标准化，因为在我们的实验中，携带带有roGFP2-Prx1传感器的质粒和对照质粒的菌株的生物量生长非常相似。如果使用roGFP2-Prx1传感器的菌株和对照质粒之间的生长相似，则不需要对生物量进行标准化。

c) 虽然在这里我们在 SD2xSCAA 培养基中培养细胞，但我们还在酵母合成基本培养基中使用传感器进行了实验（Verduyn等人，1992 年； Gast等人，2021 年）。另一方面，强烈着色的培养基（例如，丰富的 YPD 培养基）可能更成问题，因为它的荧光更强。

d) 我们希望这种方法可以用于几种原核生物和真核生物，如果该物种可以在 BioLector 中悬浮生长，并且有合适的荧光报告基因可用。

食谱

我们使用了一种特定于高产量蛋白质的培养基，称为 SD2xSCAA 培养基（ Wittrup 和 Benig，1994 年）。为了生成它，我们制作了四种单独的解决方案，由于不同的灭菌方法，最终只混合在一起。将在最终培养基中使用的这些溶液中的每一种的分数在括号中表示。

1. SD2xSCAA

a. YNB + 钠缓冲液 0.05 M，pH 6.4 – 添加 (7/10)

YNB 不含 AA 6.9 克/升

NaH ₂PO ₄·2 H ₂O 8.56 g/L

Na ₂HPO ₄5.4 克/升

磷酸钠缓冲液和 YNB 的组合不易溶解。我们建议先制备两种溶液，一种仅含 YNB，另一种含钠缓冲液，并在成分溶解后混合。

过滤消毒并储存在4 °C。

灭菌后，在一天内加入其他三种溶液，因为钠容易沉淀；但是，当添加所有组分时，混合物保持相当稳定。

b. 20% 葡萄糖- 添加 (1/10)

葡萄糖·H ₂O 220 g/L

过滤灭菌并储存在 RT

c. 1% BSA – 添加 (1/10)

BSA 10 克/升

过滤除菌并储存在4 °C

d. 氨基酸溶液– 添加 (1/10)

精氨酸 1.9 克/升

天冬氨酸 4 g/L

谷氨酸 12.6 克/升

甘氨酸 1.3 克/升

组氨酸 1.4 g/L

异亮氨酸 2.9 克/升

亮氨酸 4 克/升

蛋氨酸 1.08 克/升

苯丙氨酸 2 克/升

苏氨酸 2.2 g/L

色氨酸 0.4 g/L

酪氨酸 0.52 克/升

缬氨酸 3.8 克/升

过滤除菌并储存在4 °C

我们将 10 ×储备液（葡萄糖、BSA 和氨基酸溶液）和 YNB+钠缓冲液（10/7 × ）新鲜制成，然后将其他组分的三个 10× 储备液直接添加到 YNB+钠缓冲液中制备，以确保钠盐不沉淀。将最终的 SD2xSCAA 媒体存储在4 °C 并在 6 个月内使用。使用前检查沉淀。

2. YPD

酵母抽提物 10 g/L

肉类蛋白胨 20 g/L

葡萄糖·H ₂O 22 g/L

在 RT 高压灭菌和储存

3. SD-URA 琼脂板

要制备 SD-URA 板，应制备两种单独的溶液并将其组合成最终的 SD-URA 琼脂溶液，然后倒入培养皿中。以下配方用于制作 1 L SD-URA 琼脂溶液，可制作约 50 个 SD-URA 琼脂板。

a. 溶液 1 (250 毫升)

CSM 单退出：

市建局 0.77 克

YNB 不含 AA 6.9 克

葡萄糖·H ₂O 22 g

将 pH 值设置为 5.5-6.0

在微波炉中将溶液加热至 60°C

过滤除菌

b. 溶液 2 (750 毫升)

琼脂 20 克

高压釜

让溶液 2 冷却至大约 60°C。将溶液 1 添加到溶液 2 中，并在准备板前彻底混合。旨在向每个培养皿中添加 20 mL 的 SD-URA 琼脂溶液。

4. 50% PEG 0.1 M LiAc

准备 0.2 M LiAc 并添加 PEG 3350 1:1

在 RT 高压灭菌和储存

致谢

我们要感谢凯特坎贝尔博士为这项研究奠定了基础。这项工作得到了 VINNOVA 中心 CellNova (2017-02105) 和 Cancerfonden (2017-0778)、ÅForsk 和 Vetenskapsrådet (2020-05422) 的资助。该协议来源于原始研究文章 Gast V et al (2021)，doi: 10.1128/AEM.00301-21

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

1. Dever, TE, Kinzy, TG 和 Pavitt, GD (2016)。酿酒酵母蛋白质合成的机制和调控。 遗传学203（1）：65-107。

2. Gast, V.、Campbell, K.、Picazo, C.、Engqvist, M.、Siewers, V. 和 Molin, M. (2021)。酵母 eIF2 激酶 Gcn2在重组蛋白生产过程中促进 H ₂O _{2介导的蛋白质合成和内质网氧化折叠的反馈抑制。} 应用环境微生物87（15）：e0030121。

3. Hinnebusch, AG (1984)。酵母中一般氨基酸控制激活剂的翻译调控的证据。 Proc Natl Acad Sci USA 81（20）：6442-6446。

4. Hinnebusch, AG (2005)。 GCN4的翻译调控和酵母的一般氨基酸控制。 Annu Rev 微生物59：407-450。

5. 杰米森，DJ (1998)。酵母酿酒酵母的氧化应激反应。酵母14（16）：1511-1527。

6. Kaur, J. 和 Bachhawat, AK (2009)。跨膜结构域 4 中的 Gln-222 和跨膜结构域 9 中的 Gln-526 对于酵母高亲和力谷胱甘肽转运蛋白 Hgt1p 中的底物识别至关重要。生物化学杂志 284（35）：23872-23884 。

7. Lukyanov, KA 和 Belousov, VV (2014)。基因编码的荧光氧化还原传感器。 Biochim Biophys Acta 1840（2）：745-756。

8. Malhotra, JD, Miao, H., Zhang, K., Wolfson, A., Pennathur, S., Pipe, SW 和 Kaufman, RJ (2008)。抗氧化剂可降低内质网应激并改善蛋白质分泌。 Proc Natl Acad Sci USA 105(47): 18525-18530。

9. Morgan, B.、Van Laer, K.、Owusu, TN、Ezerina, D.、Pastor-Flores, D.、Amponsah, PS、Tursch, A. 和 Dick, TP (2016)。使用基于过氧还蛋白的探针实时监测基础 H ₂O _2水平。 自然化学生物学12（6）：437-443。

10. Schwarzländer, M., Dick, TP, Meyer, AJ 和 Morgan, B. (2016)。使用荧光蛋白传感器解剖氧化还原生物学。 抗氧化氧化还原信号24（13）：680-712。

11. Shenton, D., Smirnova, JB, Selley, JN, Carroll, K., Hubbard, SJ, Pavitt, GD, Ashe, MP 和 Grant, CM (2006)。对氧化应激的全球翻译反应影响蛋白质合成的多个水平。生物化学杂志 281（39）：29011-29021 。

12. Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, WA 和 Van Dijken, JP (1992)。苯甲酸对酵母代谢通量的影响：呼吸和酒精发酵调节的连续培养研究。酵母8（7）：501-517。

13. Wittrup, KD 和 Benig, V. (1994)。优化酿酒酵母异源蛋白分泌的氨基酸补充剂。 生物技术技术8：161-166。