材料

1. 硬质非卷曲玻璃盖玻片，3 号或 2 号（Ted Pella，目录号：260156）

2. 35 mm培养皿（Corning，Costar，目录号：CLS430588）

3. 15 mL锥形离心管（BD，目录号：14-959-49D）

4. 无菌滤纸（Thermo Fisher Scientific，目录号：09-802-1B）

5. 2.5 cm 常规注射针（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-817-144）

6. T47D 人乳腺癌细胞（ATCC ^®，编号 HTB-133 ^TM）

7. Dulbecco 改良鹰培养基 DMEM（Lonza，BioWhittaker，目录号：BW12-604F）

8. 热灭活的 FBS（Corning，目录号：35011CV）

9. 100 ×抗生素青霉素 - 链霉素（Gibco，目录号：15140148）（以防止细胞培养物的细菌和真菌污染）

10. 100 ×丙酮酸钠（Gibco，目录号：11360-070）

11. 胶原蛋白 I，3 mg/mL（Gibco，目录号：A1048301）

12. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza，BioWhittaker，目录号：BW17516F）

13. 胰蛋白酶-EDTA（Lonza，Trypsin-Versene，目录号：BW17161E）

14. Heregulin β1（HRGβ1）（R&D Systems，目录号：396-HB）

15. 台盼蓝溶液 0.4%（Gibco，目录号：15250061）

16. 邓恩室（Hawksley，目录号：DCC100）

17. DMEM S+ 培养基（见配方）

18. 胶原蛋白溶液 (10 μg/mL)（参见食谱）

设备

1. 扁平镊子（Thermo Fisher Scientific，目录号：12342158）

2. 细胞培养箱设置为 37°C 和 5% CO ₂（Thermo Fisher Scientific，目录号：51030303）

3. 水浴设置为 37°C（Thermo Fisher Scientific，目录号：TSCIR35）

4. II级A2型生物安全柜（细胞培养罩）

5. 计数室 Malassez（Marienfeld Superior，目录号：0640610）

6. 电动倒置显微镜 Axiovert 200 M (Carl Zeiss)

7. 37°C 空气中含有 5% (v/v) CO _2的活细胞成像环境室（Climabox，Carl Zeiss）

8. 显微镜相机（Coolsnap HQ；Roper Scientific ^®）

9. 10 ×物镜 [10 × plan apochromat (NA 1.4) 物镜；卡尔蔡司]

软件

1. MetaMorph 显微镜自动化和图像分析软件^®(Molecular Devices)

2. 趋化性和迁移工具 1.01，ImageJ Plugin ^®(ibidi)

3. ImageJ® （美国^国立卫生研究院）

4. 微软 Excel (微软^®)

程序

A. I型胶原蛋白涂层

1. 将消毒盖玻片放入每个培养皿中。

2. 在 37°C 下用 500 μL 胶原蛋白-I 溶液（成分如下所述）涂抹盖玻片 1 小时，然后用 2 mL PBS 轻轻清洗。

3. 立即将 2 mL 的 DMEM S+ 培养基（成分如下所述）放入培养皿中，以防止干燥。

B. 细胞培养

1. 使用融合度为 70% 的人 T47D 细胞。

2. 在 DMEM S+ 培养基中培养细胞。

3. × PBS清洗细胞两次，然后加入 1 mL 胰蛋白酶。在 37°C 下孵育 5 分钟。

4. 添加 2 mL 的 DMEM S+ 介质以灭活胰蛋白酶。

5. 通过轻轻上下吹打分解成单个细胞，然后将它们放入 15 mL 锥形离心管中。

6. × g离心 3 分钟，将细胞向下旋转。

7. 在 2 mL 的 DMEM S+ 培养基中吸出上清液并重新悬浮细胞。

8. 将 100 μL 的细胞悬浮液与等体积的台盼蓝溶液混合，并使用 Malassez 计数细胞对细胞进行计数。

9. 放入 10 ^{5 个}重悬细胞（如果需要，可以在扩散前用 siRNA 或质粒转染细胞）。

10. 在细胞培养箱中孵育细胞两天，以获得最佳的粘附和迁移。

C. 邓恩迁移试验

1. 在细胞培养箱中预热无菌 Dunn 室 30 分钟 [Dunn 室在Chaubey等人中有所描述。 (2011) 和 Monypenny等人。（2009 年） ] 。

2. 在水浴中预热 DMEM S+培养基。

3. 放置足够的 DMEM S+ 介质以覆盖整个腔室，两个井和桥，形成一个圆形的水滴。

4. 更换培养基，去除任何死细胞，然后使用无菌注射针将盖玻片从井中取出，并用扁平镊子夹住。

5. 反转盖玻片并将其降低到 Dunn 室上，使播种区域与井对齐。留下一个非常紧的开口（0.5 毫米）。

6. 使用无菌滤纸轻轻但紧紧地按压盖玻片的外边缘。一旦盖玻片干燥，介质表面张力就会形成屏障。在这个阶段，你应该看到牛顿环。因此，盖玻片在数小时内牢固地粘附在腔室上，没有空气或介质泄漏。

7. 使用无菌滤纸通过紧密的开口清空外孔。介质将被毛细作用缓慢吸引。

8. 用 10 nM 的 HRGβ1 提供的 DMEM S+ 介质填充空的外井。

9. 小心地将盖玻片推 2-3 毫米，刚好足以密封紧密的开口。梯度将稳定至少 8 小时（Benseddik等人，2013）。

10. 有关详细信息，请参阅注 1。

D. 细胞成像

1. 先前将活细胞成像显微镜及其活细胞成像环境室预热 1 小时以平衡温度。

2. 将 Dunn 室放在台上并用夹子固定，然后将其放在样品室上，并平衡温度 15 分钟。

3. 选择带有环形桥的字段，单个单元格不超过七个。始终在显微镜视野中包括桥的外边界，以识别梯度方向。

4. 使用 Metamorph ^®软件或任何细胞跟踪软件进行延时图像采集，并使用相位对比将延时成像设置为 4 小时，每 4 分钟 1 帧。请注意，帧和总持续时间是根据每种细胞类型的速度（速度）设置的。

5. 保存文件并开始延时成像。在成像结束时，每个字段都保存在包含一个图像堆栈的单独文件夹中。

6. 有关详细信息，请参阅注 2。

数据分析

A. Metamorph®分析

1. 在 Metamorph ^®软件中打开一个图像堆栈。

2. 如果在图像采集期间无法旋转相机，则使用“显示”菜单中的“旋转”命令旋转图像堆栈，使桥的外边界朝向监视器屏幕的顶部。因此，图像堆栈旋转允许从内井到外井定向的 HRGβ1 梯度方向从底部到顶部垂直重新定向。因此，HRGβ1 梯度轴在细胞跟踪期间与 y 轴对齐（图 1）。

3. 保存每个图像堆栈（每个字段）的特定旋转角度值 (θ)。跟踪后，每个字段的旋转角度值将用于重新调整所有 x 和 y 坐标（见下文）。

图 1.图像旋转和偏角测量示例。

细胞轨迹用青色、黄色、粉红色、绿色或蓝色标记。比例尺，20 µm。（一）。与桥外边界相切的直线（白色）垂直于自下而上的 HRGβ1 梯度轴（橙红色）。如前所述，当您将每个单元格的轨迹原点选项设置在“轨迹中的第一个点”时，每个单元格的 x 轴和 y 轴平行于监视器屏幕边缘（白色坐标平面）。（乙）。要正确分析细胞行为，并根据 HRGβ1 梯度方向调整轨迹坐标，应在梯度轴（橙红色）上重叠 y 轴（红色坐标平面）。旋转图像堆栈，直到桥的外部边界升到顶部。旋转角度对应于 y 轴与梯度轴的偏差角 (θ)。请注意，共享相同场的单元格（例如，具有青色、黄色或粉红色轨迹的单元格）接受相同的偏差角。在本例中，偏角为 45°。

4. 要跟踪单元格，请在“应用程序”中打开“跟踪对象”。

5. 在图像堆栈中选择要分析的帧（平面）。

6. 打开 Microsoft Excel ^®并在“配置日志”中选择所需的测量值。然后单击“日志数据”（图 2，步骤 1）。

7. 设置“搜索选项”：在“算法”中，选择“模板匹配”。在“延迟”处，选择合理的延迟，以便您可以轻松观察细胞（0.4 秒/对象）。之后，勾选“Update Template Each Frame”和“Use derived image”，然后点击“OK”（图2，步骤2）。

8. 设置“跟踪对象间隔选项”：对于 T47D 细胞，每 4 分钟捕获一次图像（图 2，步骤 3）。

9. 设置“Track Overlay Options”：勾选“Display point on current plane”和“Highlight display track path”。您可以方便地调整跟踪点的颜色和类型（图 2，步骤 4）。

10. 在“轨迹中的第一个点”处设置“原点选项”（图 2，步骤 5）：轴原点坐标 (0, 0) 对应于第一帧中的每个单元格位置，x 和 y 轴平行于监视器屏幕边缘。

11. 跟踪其轨迹未被任何障碍物阻挡的细胞。

12. 单击“跟踪”、对象的精确大小以及软件应在其中搜索单元格的区域大小（图 2，步骤 6 和步骤 7）。大小取决于单元大小和单元速度。在我们的实验中，物体大小由细胞核定义，因为它在迁移过程中不会改变形状。

13. 要选择一个单元格，请在按下“Control”键的同时单击它。选择要跟踪的所有单元格后，单击“确定”开始跟踪。

14. Metamorph ^®允许您自动跟踪细胞。但是，如果您的监视器屏幕上出现错误，您可以使用“Escape”键停止跟踪，然后单击“Step Back”，更正位置，然后单击“Update Position And Continue”（图 2，步骤 8）。

15. 当分析所有选定的帧时，跟踪会自发停止。您需要的跟踪信息在 Excel 文件中的“显示统计”中生成（图 2，步骤 9）。对于 ImageJ 分析，您需要 (x, y) 坐标。

16. 对所有图像堆栈重复这些步骤。图 1 中提供了旋转和跟踪后的图像示例。

图 2. Metamorph ^®软件上细胞定位所需基本设置的总结。

上面列出了编号为 1 到 9 的菜单选项的详细设置。

B. 为 ImageJ 分析准备文件

1. 打开每个图像堆栈的 Excel 文件。电子表格必须基本上包含每帧的 x、y 位置坐标，以及根据您在 Metamorph ^®“显示统计”上进行调整的其他信息。

2. 请记住，由于 Dunn 室具有环形形状，因此在大多数观察到的场中，跟踪细胞的 y 轴与 HRGβ1 梯度轴不对齐。因此，您之前已经执行了图像堆栈旋转，因此 y 轴变得平行于梯度轴。每个字段都有一个您在 Metamorph ^{®分析步骤中保存的旋转角度 (θ)}。

3. 有关详细信息，请参阅注 3。

调整所有 x, y 位置坐标使用旋转角 (θ)。要将 (x, y) 围绕原点 (0, 0) 旋转 θ 度，只需应用以下定理（θ 以弧度为单位）：

�� ' = �� cos θ - ysin θ

�� ' = xsin θ + ycos θ

4. 将新的 (x', y') 位置坐标与其他迁移参数信息一起保存在同一电子表格中（图 3）。这些新的 (x', y') 位置坐标对应于您将在 ImageJ 分析中使用的最终 (x, y) 坐标。

图 3. 在 Excel 上使用数学公式进行数据分析和 x、y 坐标旋转的示例。

同一图像堆栈的单元跟踪信息收集在一个电子表格中。在这里，我们将单个实验的所有电子表格组合到一个 Excel 文件中。在此电子表格示例中，G 列包含对象（单元格）编号，H 列包含帧编号，I 和 J 列包含每个帧的 (x, y) 坐标。所有关于旋转角 θ 和 (x', y') 新坐标的附加信息都手动添加到 Excel 电子表格中。在此示例中，旋转角度为 75°，它添加到 V 列中。W、X 和 Y 列包含我们用于旋转公式的计算，以将坐标 (x, y) 重新调整为 (x', y' ）。 y' 坐标的公式在 Z 列中，在上方屏幕截图中突出显示。 x' 坐标的公式在 AA 列中，在下方屏幕截图中突出显示。

5. 在一个新的 Excel 文件中，收集单个实验中不同单元格的信息，或者在同一个电子表格中一个接一个地收集一组类似实验的信息（图 4）：

a. 文件必须按以下顺序组织：图像平面、对象、框架、x' 坐标、y' 坐标。

b. 如果逗号以前用作小数点，请将所有逗号替换为点。

c. 无论字符如何，第一个 Excel 单元格都必须包含文字，并且行或列之间不得有空格。必须删除补充信息或电子表格。

6. 首先将其保存到“.xls”文件以保留其属性，然后将第二个文件保存为“.txt”（文本（制表符分隔））以将其用于 ImageJ 分析。

7. 有关详细信息，请参阅注 4。

图 4. 为在趋化性和迁移工具 1.01 上分析而准备的 Excel 文件示例。

该文件包含一个电子表格，其中：在 A1 单元格中写入，然后在第二行中写入图像平面编号、对象编号、帧编号，最后是 x' 坐标和 y' 坐标。

C. ImageJ 分析

1. 在 ImageJ 中安装插件“趋化和迁移工具”1.01 版，然后打开它。

2. 在“导入数据”中，添加要分析的“.txt”文件。

3. 设置“切片数”：放置特定于您的实验的帧数。在我们的例子中，它是 61 帧。

4. 在“设置”中，添加单位 (µm) 以及与延时成像频率相对应的时间间隔。在我们的实验中，它是每 4 分钟一帧。

5. 现在，回到“导入数据集”，点击“添加数据集”。然后，选择“选定数据集 1”，最后点击“应用设置”。

6. 单击“显示信息”可获得有关迁移参数的汇总信息。

7. 在“绘图功能”选项卡中，在“设置标记”中选择“向上/向下标记”，同时选择“在新窗口中打开”、“显示质心”和“显示附加信息”。

8. 单击“Plot graph”显示矢量图，并使用默认图形设置（标签、轴、范围等），或单击绘图底部的“更多>>”进行调整（图5）。

9. 在“图表特征”选项卡下，选择“在新窗口中打开”和“显示附加信息”，“内角”和“距离间隔”分别自动调整为 66° 和 10°。

10. 点击“绘制玫瑰图”显示玫瑰图，并使用默认的图形设置（标签、轴、范围等），或通过点击玫瑰图底部的“更多>>”进行调整（图 4）。

11. 在“统计特征”选项卡下，单击滚动菜单中的“系列功能”，可获取有关迁移和趋化参数的补充详细信息：速度、距离、方向性（定向持久性）、前向迁移指数、质心等。

12. 要探索对梯度的方向响应，请执行瑞利测试。单击滚动菜单上的“瑞利测试”。在“与原点的距离”中选择“使用端点”，然后单击“计算瑞利测试”。瑞利检验使用端点 x、y 坐标验证细胞散射：

a. 当P > 0.05 时，这意味着细胞散射是同质的，因此细胞在迁移时没有显示方向性的偏好。

b. 当P < 0.05 时，这意味着细胞散射朝向给定方向。

13. 为了进一步确认细胞在 HRGβ1 梯度上显示出显着响应，您可以计算置信区间。平均细胞方向（所有端点的质心）的置信区间必须与 HRGβ1 梯度的方向相同。要计算置信区间：

a. 转到“统计功能”选项卡下滚动菜单中的“系列功能”。通过单击“方向性”获取 x、y 端点值。

b. 将整个表格复制到新的 Excel 电子表格中，然后使用端点 x、y 坐标计算置信区间 (alpha = 0.05)。

c. 您可以在矢量图上绘制代表计算置信区间的最小值和最大值的两个箭头。如果对梯度有方向响应，则这些箭头形成的扇区应与 HRGβ1 梯度的方向相同（图 5）。

图 5 。表示趋化性迁移的图示例。

红色箭头表示 HRGβ1 梯度轴。（一）。显示单个细胞轨迹的矢量图。最终位置位于图表下部的单元格为红色，位于图表上部的单元格为黑色。绘制质心（蓝点）和置信区间（蓝色箭头）以统计表示图中的趋化性迁移。（乙）。玫瑰图（也称为圆形直方图）显示了整个细胞的趋化趋势。每个段 (10°) 区域代表位置适合所选角度 (内角 66°) 的单元格计数。

14. 有关详细信息，请参阅注释 5。

笔记

1. 邓恩室组装的最后一步必须非常小心地进行。请注意：

a. 如果盖玻片被不小心搅拌，这可能会压碎细胞。

b. 如果盖玻片不够厚，则其柔韧性会干扰趋化梯度。

c. 不要过度排放外井。

d. 必须在没有压力的情况下被动地填充外井。将适合的带支架的微量移液器尖端放在紧密的开口上，然后轻轻“倾倒”培养基。

e. Zicha等人使用了一种热封混合物。（1991）密封开口。然而，使用染料填充外孔，我们验证了在不干扰梯度的情况下密封开口的可能性，只需轻轻推动盖玻片 2 mm。然后使用 HRGβ1 确认该结果，并定向迁移 T47D 细胞。要正确执行此手势，建议使用染料进行一些练习。

f. 绝对应避免气泡，因为它们会导致梯度失真。不要犹豫，为每个实验条件并行准备多个设备，以确保以至少一个没有气泡的情况结束。

g. 在操作、运输或安装用于活细胞成像的 Dunn 室时，切勿按压或摇晃它。

h. 鉴于盖玻片的厚度，不可能使用高倍率。因此，不可能使用 Dunn 室分析亚细胞结构。

2. 如果可能，请旋转相机以将桥的外边界与监视器屏幕的顶部对齐，这将有助于对数据进行数学分析。我们的相机无法做到这一点。

3. 旋转图像堆栈，以便在 HRGβ1 梯度轴上对齐跟踪细胞的 y 轴。但是，Metamorph® 软件在细胞跟踪时并未考虑这些旋转，并且 (x, y) 位置坐标仍然是根据原始坐标平面（视频旋转之前）建立的。尽管如此，这种旋转仍允许精确估计 y 轴与梯度轴 (θ) 的偏差角“θ”（图 1）。然后在数学计算中使用 θ 角来调整坐标（图 3）。

4. 在分析趋化性和迁移工具 1.01 版上的数据之前，请注意，由于未知原因，此插件会以相反的方向显示细胞。因此，（x，y）坐标位置显示为（x，-y）。要在绘图上正确显示单元格，在最后一步中，在使用最终 Excel 电子表格之前反转您的“y”坐标位置（未显示）。

5. MetaMorph 软件^®和趋化性和迁移工具 1.01 ^®插件允许进行多种参数分析。该协议仅描述在我们的上下文中使用的那些。

食谱

1. DMEM S+ 培养基

500 毫升 DMEM

50 毫升胎牛血清

5 mL 100 ×抗生素青霉素-链霉素

5 毫升 100 ×丙酮酸钠

2. 胶原蛋白溶液 (10 μg/mL)

10 毫升 PBS

166.6 μL 胶原蛋白 I (3 mg/mL)

致谢

该协议的改编版本灵感来自 Benseddik等人发布的一个更大的项目。（2013 年），由 BFA、FRM 和 GEFLUC 向 K. Benseddik 提供奖学金的支持。该项目由法国马赛 Inserm U1068 的马赛癌症研究中心开发，由 Ali Badache 团队开发，由 ARC、INCa 和 Inserm Avenir 计划资助，并在 Daniel Isnardon 的协助下进行。我们感谢他们的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争的财务或非财务利益。

参考

1. Benseddik, K.、Sen Nkwe, N.、Daou, P.、Verdier-Pinard, P. 和 Badache, A. (2013)。 ErbB2 依赖性趋化性需要由不同信号通路协调的微管捕获和稳定。 公共科学图书馆一号8(1)：e55211。

2. Chaubey, S., Ridley, AJ 和 Wells, CM (2011)。使用 Dunn 趋化室实时分析原代细胞迁移。 方法 Mol Biol 769：41 - 51。

3. 陈 Y. (2012)。使用人乳腺癌上皮癌细胞的 Transwell 细胞迁移测定。 生物协议2(4)：e99。

4. Entschladen, F.、Drell, TL t.、Lang, K.、Masur, K.、Palm, D.、Bastian, P.、Niggemann, B. 和 Zaenker, KS (2005)。人体细胞迁移的分析方法。 Exp Cell Res 307（2）：418-426。

5. Gau, DM 和 Roy, P. (2020)。使用人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞系的单细胞迁移测定。 生物协议 10（8）：e3586。

6. Monypenny, J.、Zicha, D.、Higashida, C.、Oceguera-Yanez, F.、Narumiya, S. 和 Watanabe, N. (2009)。 Cdc42 和 Rac 家族 GTP 酶在血小板衍生的生长因子依赖性趋化过程中调节原发性成纤维细胞迁移的模式和速度，但不调节方向。 摩尔细胞生物学29（10）：2730-2747。

7. Stuelten, CH, Parent, CA 和 Montell, DJ (2018)。癌症侵袭和转移中的细胞运动：来自简单模式生物的见解。 Nat Rev Cancer 18（5）：296-312。

8. Taylor, L.、Recio, C.、Greaves, DR 和 Iqbal, AJ (2018)。体外迁移测定。 方法 Mol Biol 1784：197-214。

9. Zengel, P.、Nguyen-Hoang, A.、Schildhammer, C.、Zantl, R.、Kahl, V. 和 Horn, E. (2011)。 μ-Slide 趋化性：用于长期趋化性研究的新室。 BMC 细胞生物学12: 21. 7

10. Zicha, D., Dunn, GA 和 Brown, AF (1991)。一种新的直观趋化室。 J 细胞科学99 (Pt 4): 769-775 。