材料和试剂

1. 平底96孔组织培养板（Genesee，目录号： 25-109）

2. 96孔储存板（Thermo Scientific，目录号： AB-1058）

3. 96孔深孔储存板（ThermoFisher Scientific，目录号： 260251）

4. 50 mL锥形离心管，无菌，聚丙烯（Genesee，目录号： 25-108）

5. 15 mL锥形离心管，无菌，聚丙烯（Genesee，目录号： 25-106）

6. 10 mL血清移液管，无菌（Genesee，目录号： 25-104）

7. 25 mL血清移液管，无菌（Genesee，目录号： 25-106）

8. 1.7 mL DNase/RNase-free 管（Genesee，目录号： 25-282）

9. 1,000 µL 移液器吸头，低结合（Genesee，目录号： 24-160R）

10. 200 µL 移液器吸头，低结合（Genesee，目录号： 24-150R）

11. 10 µL 移液器吸头，低结合（Genesee，目录号： 24-121R）

12. 组织培养处理的烧瓶，600 mL，通风口（Genesee，目录号：25-211）

13. 组织培养处理的烧瓶，250 mL，通风口（Genesee，目录号：25-209）

14. 无菌注射器过滤器，0.2 µm（Fisher Scientific，目录号：09-740-100）

15. 6孔细胞培养板（Genesee，目录号：25-105）

16. HCoV-OC43 病毒（BEI Resources，目录号：NR-52725）

17. HCoV-229E 病毒（BEI Resources，目录号：NR-52726）

18. HCoV-NL63 病毒（BEI Resources，目录号：NR-470）

19. 人横纹肌肉瘤细胞系，RD (ATCC ^®CCL-136 ^TM)

20. 人成纤维细胞系，MRC-5 (ATCC ^®CCL-171 ^TM)

21. HEK-293T-hACE2 细胞系（BEI Resources，目录号：NR-52511）

22. A549-hACE2 细胞系（BEI Resources，目录号：NR-53821）

23. Vero E6 细胞系 (ATCC ^®CRL-1586 ^TM)

24. HCT-8 细胞系 (ATCC ^®CCL-244 ^TM)

25. Huh-7 细胞系（Millipore Sigma，目录号：01042712-1VL，匹兹堡大学王天一博士赠送）

26. BHK-21 细胞系 (ATCC ^®CCL-10 ^TM)

27. BSC-1细胞系（ATCC ^®CCL-26 ^TM，田纳西大学健康科学中心Kui Li博士的礼物）

28. Calu-3 细胞系 (ATCC ^®HTB-55 ^TM)

29. Caco-2 细胞系 (ATCC ^®HTB-37 ^TM)

30. 胰蛋白酶-EDTA，0.25% 1x，酚红（Genesee，目录号： 25-510）

31. Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（Genesee，目录号： 25-501）

32. Eagle 最低基本培养基 (EMEM) (ATCC ^®30-2003 ^TM)

33. FBS（Gibco，目录号： 26140-095）

34. 青霉素-链霉素（P/S）100×溶液（Genesee，目录号： 25-512）

35. 冰醋酸（CAMEO 化学品，目录号： UN2789）

36. Na ₂HPO ₄·2H ₂O（Sigma，目录号： 04272-1KG）

37. KH ₂PO ₄（Sigma，目录号： P9791-1KG）

38. NaCl（Fisher Scientific，目录号： BP358-10）

39. KCl（Sigma，目录号： P3911-1KG）

40. 乙醇（ThermoFisher，目录号： A405-20）

41. MgCl ₂·6H ₂O（Sigma，目录号： M2670-1KG）

42. CaCl ₂（Sigma，目录号： C1016-2.5KG）

43. DMEM 粉末（Gibco，目录号： 12-800-017）

44. HEPES，钠盐（Gold Biotechnology，目录号： H-401-2.5）

45. NaHCO ₃（Millipore Sigma，目录号： S5761-5KG）

46. 浓缩 HCl，36.5 至 38%（Fisher Scientific，目录号： A144-212）

47. Avicel 微晶纤维素（FMC BioPolymer，Philadelphia，PA）

48. 结晶紫（Fisher Scientific，目录号： AAB2193236）

49. 纳米纯水或蒸馏水和去离子水

50. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（参见食谱）

51. 中性红（3-氨基-7-二甲氨基-2-甲基-吩嗪盐酸盐）（Sigma，目录号： N4638）

52. 10× PBS 库存（见食谱）

53. 100× MgCl ₂库存（见配方）

54. 100× CaCl ₂原料（见配方）

55. DPBS，不含钙和镁（见食谱）

56. PBS，含钙和镁（见食谱）

57. 中性红原液（见配方）

58. 完全培养基（见食谱）

59. 中性红色工作溶液（见配方）

60. 中性红脱色溶液（见配方）

61. 2× DMEM （见配方）

62. 1.2% avicel （见配方）

63. 0.2% 结晶紫（见配方）

设备

1. 两个细胞培养箱（Eppendorf，Galaxy ^®170 R），加湿，5% CO ₂/95% 空气，温度分别设置为 33°C 和 37°C

2. 倒置显微镜Olympus CKX53（ThermoFisher Scientific，目录号：NC1991101）

3. Multiskan ^TMFC 微孔板光度计（ThermoFisher Scientific，目录号： 51119000）

4. Countess ^TM3 自动细胞计数器（ThermoFisher Scientific，目录号： AMQAX2000）

5. 通风柜（用于危险化学品）

6. 微量滴定板振荡器（Fisher Scientific，目录号： 88-861-023）

7. 热板搅拌器（Fisher Scientific，目录号： 11-520-49SH）

8. PIPETMAN Classic P10（Genesee，目录号： 37-100P10）

9. PIPETMAN Classic P100（Genesee，目录号： 37-100P100）

10. PIPETMAN Classic P1000（Genesee，目录号： 37-100P1K）

11. PIPETMAN Classic P20（Genesee，目录号： 37-100P20）

12. PIPETMAN Classic P200（Genesee，目录号： 37-100P200）

13. 试剂容器，无菌（VWR，目录号： 89094-662）

14. 涡流混合器（Fisher Scientific，目录号： 02-215-414）

15. 离心机（Beckman，目录号： A99465）

16. 瓶顶真空过滤器（Genesee，目录号： 25-235）

17. Sartorius ^TMBiohit ^TMPicus ^TMNxT 电动移液器，50-1,200 µL，12 个通道（Sartorius ^TM，目录号： LH745491）

18. Sartorius ^TMBiohit ^TMPicus ^TMNxT 电动移液器，0.2-10 µL，12 个通道（Sartorius ^TM，目录号： LH745421）

19. HandE-Vac 手持式抽吸系统（Argos Technologies ^TM，目录号： 10-987-042）

软件

1. ImageJ（美国国立卫生研究院，1.50 c 版， https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）

2. 棱镜 GraphPad ( https://www.graphpad.com )

程序

A. 病毒传播

HCoV-OC43 在 HCT-8 或 RD 细胞系中繁殖。 HCoV-229E 在 MRC-5 或 Huh-7 细胞系中繁殖。 HCoV-NL63 最初在 HEK-293T-hACE2 细胞系中繁殖，随后在 Vero E6 或 Huh-7 细胞系中进行额外的 3-4 代。

注意：对于我们尝试过的所有细胞系，只有 HEK-293T-hACE2 细胞系能产生高滴度的 HCoV-NL63，而繁殖的 HCoV-NL63 病毒被容纳在 Vero E6 或 Huh-7 细胞系中以允许 CPE发育和斑块形成。

1. 细胞播种（第 0 天）

注意：所有程序应在无菌条件下和层流柜的无菌环境中进行。

a. 对于 90-95% 融合的 T75 细胞培养瓶，吸出 20 mL 细胞培养基并用 DPBS 缓冲液（10 mL 缓冲液用于 75-cm ²烧瓶）冲洗细胞，轻轻搅拌以去除任何剩余的血清，可能会抑制胰蛋白酶的作用。重复此步骤一次。

b. 将胰蛋白酶-EDTA 溶液（3 mL 用于 75-cm ²烧瓶）加入烧瓶中的细胞单层，轻轻搅拌，然后将烧瓶在 37°C 下孵育 5-10 分钟。

c. 轻轻敲击烧瓶以分离细胞并加入预热（至室温）的完全培养基（10 mL 用于 75-cm ²烧瓶）。用血清移液器在细胞单层表面上移液数次，轻轻分散培养基，以确保 > 95% 的细胞回收率。上下移液几次以确保获得均匀的悬浮液。

d. 将细胞悬液转移到 15 mL 无菌离心管中，以 500 ×离心 g在室温 (20-30°C) 下 10 分钟以使细胞旋转下来。

e. 吸出上清液并加入 10 mL 的完全培养基以重新悬浮细胞。

f. 使用细胞计数器计算步骤 e 中悬浮液的细胞密度。

g. 将大约 1 × 10 ^{6 个}细胞转移到 175-cm ²烧瓶中，用完全培养基使细胞悬液的总体积达到 40 mL。这将使细胞在播种后 18-24 小时达到 70-80% 的融合度。

h. 在细胞培养箱中孵育烧瓶（加湿，5% CO ₂/95% 空气，37°C）。

2. 病毒感染（第 1 天）

a. 使用相差倒置显微镜检查 175-cm ^2烧瓶中的细胞汇合情况；细胞应达到 70-80% 的汇合度。

b. 在 37°C 金属珠浴中加热 DMEM 培养基（替代水浴，以避免水中微生物生长引起的潜在污染）并解冻病毒储备（最初的病毒来自 BEI Resources并储存在 -80°C ）。

c. 通过将 FBS 添加到 DMEM 中至最终浓度为 2% 来制备病毒感染培养基。对于 50 mL 的 DMEM，添加 1 mL 的 FBS。

d. 将 100 μL 的病毒库存（从步骤 b）稀释到 10 mL 的病毒感染培养基中，并通过上下吹打几次来充分混合。

e. 吸出 175-cm ²烧瓶中的培养基并用 PBS、钙和镁缓冲液冲洗细胞（50 mL 缓冲液用于 175-cm ²烧瓶）。

f. 吸出 PBS、钙和镁缓冲液。

g. 通过添加 10 mL 在步骤 d 中制备的病毒稀释液来感染 175-cm ^{2烧瓶中的细胞。}轻轻旋转烧瓶，使病毒稀释液均匀覆盖细胞单层。

h. 在细胞培养箱（加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C；HCoV-NL63 为 37°C）中将感染细胞在 175-cm ^{2烧瓶中孵育 1}-2 小时。每 15 分钟旋转一次烧瓶，使病毒稀释均匀地覆盖细胞单层，以促进病毒附着在受感染的细胞上。

i. 吸出 175 厘米²烧瓶中的病毒稀释液，并在烧瓶中加入 40 mL 的病毒感染培养基。

j. 将 175-cm ²烧瓶在细胞培养箱（加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C；HCoV-NL63 为 37°C）中孵育 3 天。

3. 病毒收集（第 4 天）

a. 将 175-cm ²烧瓶中的上清液收集到 50 mL 无菌离心管中，并以 4,000 ×离心 g在室温 (20-30°C) 下放置 10 分钟。此步骤使上清液中的细胞或细胞碎片旋转下来。

注意：HCoV 在感染后 2-3 天达到最高病毒滴度，这是在观察到显着 CPE 之前，之后滴度开始下降。因此，应在感染后不超过 3 天收集病毒。

b. 使用 10 mL 血清移液器将上清液转移到另一个 50 mL 无菌离心管中。通过无菌 0.2 μm 过滤器过滤上清液，以去除任何剩余的细胞碎片。将病毒分装到无菌 1.5 mL DNase/RNase-free 管中，每管 1 mL。用病毒名称和收集日期标记每个管。快速冷冻试管（推荐但不是必需的）并将所有试管存放在 -80°C 冰箱中以备将来使用。

B. CPE 测定 - 滴定病毒原液

我们在 CPE 和噬斑测定中检测了 HCoV-OC43、HCoV-229E 和 HCoV-NL63 的不同细胞系，结果列于表2。HCoV -OC43 可以在 RD、MRC- 5、BSC-1细胞系。 HCoV-229E 可以在 MRC-5、Huh-7 和 RD 细胞系中形成完整的 CPE。 HCoV-NL63 可以在 Vero E6、Huh-7、MRC-5 和 RD 细胞系中形成完整的 CPE。在本研究中，以下条件作为代表性示例：RD 细胞系中的 HCoV-OC43 CPE 测定、MRC-5 细胞系中的 HCoV-229E CPE 测定和 Vero E6 细胞系中的 HCoV-NL63。

表 2。 在HCoV-OC43、HCoV-229E 和 HCoV-NL63 CPE 和噬菌斑检测和结果中测试的细胞系。

1. 细胞播种（第 0 天）

A. 病毒传播中的相同。

a. 用完全培养基稀释细胞。一个 96 孔板至少需要 12 mL 密度约为 2.5 × 10 ^{4 个细胞/mL 的培养基。}这将使细胞在播种后 18-24 小时达到 80-90% 的融合，并为病毒感染做好准备。

b. 通过上下吹打几次来混合细胞悬浮液，然后将悬浮液转移到无菌水库中。使用多通道移液器将 100 μL 的细胞悬浮液分配到 96 孔板的每个孔中。

注意：混合细胞悬液数次以确保其均匀。定期重复以均匀分布。

c. 用匹配的盖子盖住板，在细胞培养箱（加湿，5% CO ₂/95% 空气，37°C）中孵育细胞 18-24 小时。

2. 病毒感染（第 1 天）

注意：去除和更换孔中的试剂需要轻柔小心地进行，以免干扰细胞单层。如有必要，可以包括一个简短的离心步骤（200 × g 5 分钟）。

a. 使用相差倒置显微镜检查 96 孔板中的细胞汇合情况；细胞应该是 80-90% 汇合。

b. 在 37°C 的珠篮中加热 DMEM 培养基，并从 -80°C 的冰箱中解冻一管 HCoV 病毒原液。

c. 通过将 FBS 添加到 DMEM 中至最终浓度为 2% 来制备病毒感染培养基。对于 30 mL 的 DMEM，添加 0.6 mL 的 FBS。

d. 将传播的 HCoV 病毒从 10 ^{1连续稀释}到 10 ^{4倍：用 10 -1}、10 ^-2、10 ^-3和 10 ^-4标记四个 15 mL 无菌离心管，并在每个管中加入 2.7 mL 病毒感染培养基.在 10 ^-1管中加入 300 μL 传播的 HCoV 病毒原液，中速涡旋 10 s 充分混匀；在10 ^{-2管中，加入300 µL 10 -1管}中的病毒稀释液，中速涡旋10 s，充分混匀；在10 ^{-3管中加入300 µL 10 -2管}中的病毒稀释液，中速涡旋10 s，充分混匀；在 10 ^{-4管中，从 10 -3管}中加入 300 µL 病毒稀释液，中速涡旋 10 s 充分混匀。

e. 使用 HandE-Vac 手持式吸液系统在 96 孔细胞培养板中吸出培养基，并使用多通道移液器在每个孔中加入 200 μL 的 PBS、钙和镁缓冲液来冲洗细胞。

f. 在 96 孔板的盖子上，标记列 1-2 和 11-12（无病毒）、列 3-4 (10 ^-1)、列 5-6 (10 ^-2)、列 7-8 (10图 3A、 ^3F、3G、4A、4F、4G、4H、5A、5F 和 5G 中所示的列 9-10 (10 ^{-4 )。}

图 3。 HCoV-229E 的 CPE 测定。

A. MRC-5 细胞系中 HCoV-229E 的滴定。 B. CPE 测定中 MRC-5 细胞系中 HCoV-229E 滴定的结果。对每种病毒稀释度的信号与背景 (S/B) 比率进行了标记。 * P < 0.05； ** P < 0.01； *** P < 0.001（学生t检验）。 C. 在使用 MRC-5 细胞系的 CPE 测定中，确定 GC-376 和瑞德西韦对抗 HCoV-229E 的 EC ₅₀值。 D.在 GraphPad Prism 8 中获得的瑞德西韦的EC _{50曲线拟合}。 E.在 GraphPad Prism 8 中获得的 GC-376 的EC _{50曲线拟合。}F. Huh-7 细胞系中 HCoV-229E 的滴定。 G. RD 细胞系中 HCoV-229E 的滴定。这些图像是三个独立重复的代表。

图 4。 HCoV-NL63 的 CPE 测定。

A. Vero E6 细胞系中 HCoV-NL63 的滴定。 B. CPE 测定中 Vero E6 细胞系中 HCoV-NL63 滴定的结果。 * P < 0.05； ** P < 0.01； *** P < 0.001（学生t检验）。为每种病毒稀释度标记了 S/B 比率。 C. 在 CPE 测定中测定 GC-376 和瑞德西韦对抗 HCoV-NL63 的 EC ₅₀值。 D.在 GraphPad Prism 8 中获得的瑞德西韦的EC _{50曲线拟合}。 E.在 GraphPad Prism 8 中获得的 GC-376 的EC _{50曲线拟合}。 F. Huh-7 细胞系中 HCoV-NL63 的滴定； G. HCoV-NL63 在 MRC-5 细胞系中的滴定。 H. RD 细胞系中 HCoV-NL63 的滴定。这些图像是三个独立重复的代表。

图 5。 HCoV-OC43 的 CPE 测定。

A. RD 细胞系中 HCoV-OC43 的滴定。 B. CPE 测定中 RD 细胞系中 HCoV-OC43 滴定的结果。 * P < 0.05； ** P < 0.01； *** P < 0.001（学生t检验）。为每种病毒稀释度标记了 S/B 比率。 C. 在 CPE 测定中测定 GC-376 和瑞德西韦对抗 HCoV-OC43 的 EC ₅₀值； D.在 Prism 8 中获得的瑞德西韦的EC _{50曲线拟合}。 E.在 Prism 8 中获得的 GC-376 的EC ₅₀曲线拟合。 F. HCoV-OC43 在 MRC-5 细胞系中的滴定。 G. BSC-1 细胞系中 HCoV-OC43 的滴定。这些图像是三个独立重复的代表。

g. 使用 HandE-Vac 手持式吸液系统吸出 PBS、钙和镁缓冲液。

h. 在步骤 e 准备的 96 孔板中，将 100 μL病毒感染培养基加入第 1-2 列和第 11-12 列（无病毒），从 10 ^-1管中加入 100 μL 病毒稀释液到第 3-4 列（10 ^-1)、100 µL 病毒稀释液从 10 ^-2管进入第 5-6 列 (10 ^-2)、100 µL 病毒稀释液从 10 ^-3管进入第 7-8 列 (10 ^-3) 和 100 µL 病毒稀释液从 10 ^-4管进入第 9-10 列 (10 ^-4)。

注意：使用少量 100 μL 的病毒稀释液进行感染，以促进病毒附着在细胞上。

i. 将板在细胞培养箱中孵育（加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C；HCoV-NL63 为 37°C）1-2 小时，以确保病毒吸附。

j. 在 96 孔板的每个孔中加入 100 μL 的病毒感染培养基，使每个孔的总体积达到 200 μL，适用于 3 天以上的细胞维护。

k. 在细胞培养箱中孵育板（加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C；加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-NL63 为 37°C ) 4-5 天。

3. 显微评估（第 2、3、4 和 5 天）

感染后每天使用相差倒置显微镜检查细胞，并记录细胞形态和 CPE 发展的变化。

4. 中性红吸收测定（第 5 天）

注意：步骤 ak 不需要无菌条件或无菌材料。

a. 将中性红工作溶液（在中性红摄取试验前一天制备并在 37°C 细胞培养箱中孵育过夜）以 4,000 ×离心 g在室温 (20-30°C) 下放置 5 分钟以去除任何沉淀物。

b. 在每口井中加入 200 μL 的 PBS、钙和镁缓冲液，将细胞中的病毒感染培养基吸出并清洗细胞。

c. 将中性红色工作溶液（步骤 a）轻轻转移到试剂容器中。

d. 使用 12 通道电子移液器将 100 μL 中性红色工作溶液添加到每个孔中。

e. 将板在 37°C 培养箱（5% CO ₂）中孵育 2-4 小时。

注意：对于 RD 和 MRC-5 细胞系，最佳孵育时间为 2 小时，较长的孵育时间会导致灵敏度显着下降。对于 Vero E6 和 A549-hACE2 细胞系，孵育时间可长达 4 小时，而不会影响检测灵敏度。

f. 吸出中性红色工作溶液。

g. 通过在每口井中加入 200 μL 的 PBS、钙和镁缓冲液来清洗细胞。

h. 吸出洗涤缓冲液并通过将盘子倒置在纸巾上轻轻敲打或让它风干来去除任何残留的缓冲液。

注意：孔需要完全干燥后才能加入中性红脱色液。

i. 在每口井中加入 100 μL 的中性红脱色溶液。

j. 在微量滴定板振荡器上以 200 rpm 的速度快速摇动板 15 分钟，以使脱色溶液从细胞中完全提取中性红并形成均质溶液。

k. 在分光光度计中测量中性红提取物在 540 nm 处的吸光度，以 .text 格式保存数据以供分析。 .text 格式文件中的数据将被传输到 Excel 中进行数据处理。

l. 将脱色溶液丢弃到适当的废液容器中，并丢弃板。

C. CPE 测定 - 测试抑制剂

1. 细胞播种（第 0 天）

B. CPE 检测 - 滴定病毒中的完全相同。

2. 病毒感染（第 1 天）

a. 使用相差倒置显微镜检查 96 孔板中细胞的汇合情况；细胞应该是 80-90% 汇合。

b. 在珠篮中将 DMEM 培养基加热至 37°C，解冻一管储存在 -80°C 冰箱中的传播 HCoV 病毒。

c. 从每种化合物的最高浓度 1 mM 开始，通过创建八个三倍稀释液（0.5 log 单位），在 DMSO 中制备测试化合物（GC-376 和瑞德西韦）的稀释液。所得储备溶液的浓度为 1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001 和 0.0003 mM。

d. 通过将 FBS 添加到 DMEM 中至最终浓度为 2% 来制作病毒感染培养基。对于 30 mL 的 DMEM，添加 0.6 mL 的 FBS。

e. 稀释 HCoV 原种病毒以进行感染。为了获得大于 5 的 S/B 比，HCoV-229E 的最佳稀释度是原病毒的 10 ²倍稀释度（等于 2 × 10 ³PFU/mL），即 200 µL HCoV-229E 原液19.8 mL 病毒感染培养基中的病毒。 HCoV-NL63 的最佳稀释度是原病毒的 10 ³倍稀释（等于 7.2 × 10 ³PFU/mL），即 20 µL HCoV-NL63 原病毒在 19.98 mL 病毒感染培养基中。 HCoV-OC43 的最佳稀释度是原病毒的 10 ²倍稀释（等于 1.38 × 10 ⁴PFU/mL），即 200 µL HCoV-OC43 原病毒在 19.8 mL 病毒感染培养基中。

f. 使用 HandE-Vac 手持式吸液系统在 96 孔板中吸出培养基，并使用多通道移液器在每个孔中加入 200 μL 的 PBS、钙和镁缓冲液来冲洗细胞。在板盖上，将第 1-2 列和第 11-12 列标记为“无病毒”；第 3-4 列为“病毒”；第 5-7 列为“瑞德西韦”；和列 8-10 为“GC-376”，如图 3B、4B 和 5B 所示。

g. 使用 HandE-Vac 手持式吸液系统吸出 PBS、钙和镁缓冲液。

h. 将 100 μL 的病毒感染培养基添加到 96 孔细胞培养板的 1-2 和 11-12（无病毒）列中，并将 100 μL 的病毒稀释（步骤 e）添加到第 3-10 列中。

i. 在细胞培养箱中孵育 96 孔板（加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C，HCoV-NL63 为 37°C）1-2 小时。

j. 将 4 µL DMSO 或每种浓度的测试化合物 GC-376 和瑞德西韦（步骤 c）加入 400 µL 病毒感染培养基中的 96 孔深井储存板中，上下移液几次以充分混合。

k. 将 100 µL 含有 DMSO、remdesivir 或 GC-376 系列浓度（步骤 j）的病毒感染培养基分别转移到 3-4（病毒）、5-7（remdesivir）或 8-10（GC-376）列中，在 96 孔板中。

l. 将 96 孔板在细胞培养箱（加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C，HCoV-NL63 为 37°C）中孵育 3-5 天。

3. 显微评估（第 2、3、4 和 5 天）

感染后每天使用相差倒置显微镜检查细胞。感染后 4 至 5 天，完整的 CPE 应在第 3-4 列（病毒）中形成。

注意：在测试化合物时，找到 CPE 检测的正确终点至关重要。当病毒组提供约 95% CPE 时，进行中性红摄取测定是理想的

4. 中性红吸收测定（第 5 天）

步骤 ak 与 B. CPE 检测中的步骤 ak 完全相同- 滴定病毒。

D. 斑块测定 - 滴定病毒

1. 细胞播种（第 0 天）

A. 病毒传播中的相同。

a. 用完全培养基稀释细胞。一个 6 孔板至少需要 20 mL 大约 2.5 × 10 ^{4 个细胞/mL 细胞原液。}

b. 混合细胞悬液以确保通过上下移液几次，将 3 mL 的细胞悬浮液分配到 6 孔板的每个孔中，以达到均匀性。

c. 盖上盖子，将细胞在细胞培养箱（加湿，5% CO ₂/95% 空气，37°C）中孵育 24 至 48 小时。

2. 病毒感染（第 1 天）

a. 使用相差倒置显微镜检查 6 孔板中细胞的汇合情况；接种后约 48 小时，细胞应 > 95% 融合。

b. 在 37°C 的珠篮中加热 DMEM 培养基，解冻一管储存在 -80°C 冰箱中的传播 HCoV 病毒。

c. 通过将 FBS 添加到 DMEM 中至最终浓度为 2% 来制备病毒感染培养基。对于 10 mL 的 DMEM，添加 200 μL 的 FBS。

d. ¹到 10 ^6倍的系列稀释：用 10 ^-1、10 ^-2、10 ^-3、10 ^-4标记六个 15 mL 无菌离心管，10 ^-5和10 ^-6.在每管中加入 1.8 mL 的病毒感染培养基。在10 ^-1管中加入200 µL HCoV 病毒原液，中速涡旋10 s 充分混匀；在10 ^{-2管中，从10 -1管}中加入200 µL病毒稀释液，中速涡旋10 s充分混匀；在10 ^{-3管中，从10 -2管}中加入200 µL病毒稀释液，中速涡旋10 s充分混匀；在10 ^{-4管中，从10 -3管}中加入200 µL病毒稀释液，中速涡旋10 s充分混匀；在10 ^{-5管中，从10 -4管}中加入200 µL 病毒稀释液，中速涡旋10 s 充分混匀；在10 ^{-6管中，从10 -5管}中加入200 µL 病毒稀释液，中速涡旋10 s 充分混匀。

e. 在 6 孔板中吸出生长培养基，并在每个孔中用 3 mL 的 PBS、钙和镁缓冲液冲洗细胞。轻轻旋转板以彻底清洗细胞。在板盖上，用' 10 ^-1, 10 ^-2, 10 ^-3, 10 ^-4,10 ^-5和 10 ^-6'，如图 6A、6F、6G、7A、7F、7G、7H、8A、8F 和 8G 所示。

图 6。 HCoV-229E 的斑块减少试验。

A. RD 细胞系中 HCoV-229E 的滴定。 B. 在斑块测定中确定瑞德西韦对抗 HCoV-229E 的 EC ₅₀值。 C.在噬斑测定中测定 GC-376 对 HCoV-229E的 EC _{50值。 D.}在 GraphPad Prism 8 中获得的瑞德西韦的EC _{50曲线拟合}。 E.在 GraphPad Prism 8 中获得的 GC-376 的EC _{50曲线拟合}。 F. Huh-7 细胞系中 HCoV-229E 的滴定。 G. HCoV-229E 在 MRC-5 细胞系中的滴定。这些图像是三个独立重复的代表。

图 7。 HCoV-NL63 的斑块减少测定。

A. RD 细胞系中 HCoV-NL63 的滴定。 B. 在斑块测定中确定瑞德西韦对抗 HCoV-NL63 的 EC ₅₀值。 C.在噬斑测定中测定 GC-376 对 HCoV-NL63的 EC _{50值。 D.}在 GraphPad Prism 8 中获得的瑞德西韦的EC _{50曲线拟合}。 E.在 GraphPad Prism 8 中获得的 GC-376 的EC _{50曲线拟合。}F. Huh-7 细胞系中 HCoV-NL63 的滴定。 G. HCoV-NL63 在 MRC-5 细胞系中的滴定。 H. RD 细胞系中 HCoV-NL63 的滴定。这些图像是三个独立重复的代表。

图 8。 HCoV-OC43 的斑块减少测定。

A. RD 细胞系中 HCoV-OC43 的滴定。 B. 在斑块测定中确定瑞德西韦对抗 HCoV-OC43 的 EC ₅₀值。 C.在噬斑测定中测定 GC-376 对 HCoV-OC43的 EC _{50值。 D.}在 GraphPad Prism 8 中获得的瑞德西韦的EC _{50曲线拟合}。 E.在 GraphPad Prism 8 中获得的 GC-376 的EC _{50曲线拟合。}F. HCoV-OC43 在 MRC-5 细胞系中的滴定。 G. BSC-1 细胞系中 HCoV-OC43 的滴定。这些图像是三个独立重复的代表。

f. 吸出 PBS、钙和镁缓冲液。

g. 添加 500 µL 的 10 ^-1、10 ^-2、10 ^-3、10 ^-4，10 ^-5,和^{来自步骤d的}10 ^-6病毒稀释液到相应的孔中。轻轻旋转平板，让病毒接种物均匀地覆盖细胞单层。

注意：用于感染 6 孔板中细胞的所需病毒接种量为每孔 250 μL 至 1 mL，以完全覆盖细胞单层并有效吸附病毒。

h. ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C，HCoV-NL63 为 37°C）的 6 孔板中孵育受感染的细胞1- 2小时。

i. 在孵化过程中，通过混合等体积的 2× DMEM 和 1.2% Avicel，在 DMEM 中制备含有 0.6% Avicel 和 2% FBS 的覆盖层。对于一个 6 孔板，将 12.5 mL 的 2× DMEM 和 12.5 mL 的 1.2% Avicel 与 500 μL 的 FBS 混合。

j. 从步骤 h 中吸出病毒接种物，并用 3 mL 的 PBS、钙和镁缓冲液清洗每口井中的未结合病毒。轻轻旋转板以彻底清洗细胞。

k. 吸出 PBS、钙和镁缓冲液。

l. 将步骤 i 中的 4 mL 覆盖添加到 6 孔板中的每个孔中。

m. 将 6 孔板在细胞培养箱（加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C，HCoV-NL63 为 37°C）中孵育 4-5 天。

注意：HCoV-OC43 的最佳潜伏期约为 4 天 15 小时。 HCoV-229E 的最佳潜伏期约为 5 天 15 小时。 HCoV-NL63 的最佳潜伏期约为 3 天 15 小时。但是，比最佳时间短或长 6 小时的孵育时间不会显着影响结果。

3. 板染色（第 5 天）

a. 吸出 Avicel 覆盖层。

b. 每口井用 3 mL 的 PBS、钙和镁缓冲液清洗细胞，去除残留的 Avicel。

c. 吸出 PBS、钙和镁缓冲液。

d. 每孔加入 1.5 mL 0.2% 结晶紫，室温孵育 30 min。

e. 将结晶紫丢弃到用于生物危害材料的液体废物容器中，将板浸入自来水中以去除多余的结晶紫染料。

f. 将盘子放在长凳上，让它风干并拍摄盘子的图像。

E. 斑块测定 - 测试化合物的抗病毒活性

1. 细胞播种（第 0 天）

D. Plaque Assay - 滴定病毒中的步骤完全相同，除了将细胞接种在五个 6 孔板中以测试两种化合物以确定 EC ₅₀s。

2. 病毒感染（第 1 天）

D. 斑块测定 - 滴定病毒中相同的程序。

a. 准备用于感染的病毒稀释液。在斑块测定中测试化合物的最佳条件是在 6 孔板的每个孔中有 80-150 个斑块。根据图 6A 中的滴定结果，HCoV-229E 的最佳稀释度是库存病毒的 800 倍稀释度（等于 250 PFU/mL）。也就是说，对于五个 6 孔板，将 25 μL 的库存病毒添加到 20 mL 的病毒感染培养基中，并混合好进行感染。根据图 7A 中的滴定结果，HCoV-NL63 的最佳稀释度是库存病毒的 30,000 倍稀释（等于 240 PFU/mL）。也就是说，对于五个 6 孔板，将 6.7 × 10 ^-4μL 的库存病毒添加到 20 mL 的病毒感染培养基中，并充分混合以进行感染。但是，最好将 HCoV-NL63 原种病毒连续稀释 10 ^-5倍，然后将 67 μL 的 10 ^-5倍稀释液加入 20 mL 的病毒感染培养基中，并充分混合以进行感染。根据图 8A 中的滴定结果，HCoV-OC43 的最佳稀释度是库存病毒的 5,000 倍（等于 276 PFU/mL）稀释度。也就是说，对于五个 6 孔板，将 4 μL 的库存病毒添加到 20 mL 的病毒感染介质中。但是，最好先将 HCoV-OC43 原种病毒稀释 10 ^-1倍，然后将 40 μL 的 10 ^-1倍稀释液加入 20 mL 的病毒感染培养基中，以尽量减少变异。

b. 在 6 孔板中吸出生长培养基，并在每个孔中用 3 mL 的 PBS、钙和镁缓冲液冲洗细胞。轻轻旋转板以彻底清洗细胞。

c. 吸出 PBS、钙和镁缓冲液。

d. 将步骤 c 中的 500 μL 稀释病毒添加到五个 6 孔板的每个孔中。轻轻旋转平板，让病毒接种物均匀地覆盖细胞单层。

e. ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C，HCoV-NL63 为 37°C）的 6 孔板中孵育受感染的细胞1- 2小时。

f. 在孵育过程中，准备覆盖溶液，该溶液由 DMEM 中的 0.6% Avicel、2% FBS 和不同浓度的测试化合物或 DMSO（对照）组成。对于五个 6 孔板，将 65 mL 的 2× DMEM 和 65 mL 的 1.2% Avicel 与 2.6 mL 的 FBS 混合。将 8.5 mL 覆盖层分装到每管中（两个孔一式两份），在每管上标记测试化合物的名称和浓度，并将相应浓度的化合物添加到每个管中的覆盖层中，涡旋管混合化合物，并彻底覆盖。

g. 吸出病毒接种物并用 3 mL 的 PBS、钙和镁缓冲液清洗未结合的病毒。轻轻旋转板以彻底清洗细胞。在板盖上，标记每个孔的测试化合物的名称和浓度。

h. 吸出 PBS、钙和镁缓冲液。

i. 将步骤 g 中含有测试化合物的 4 mL 覆盖层转移到 6 孔板中的相应孔中。

j. 将 6 孔板在细胞培养箱（加湿，5% CO ₂/95% 空气，HCoV-OC43 和 HCoV-229E 为 33°C，HCoV-NL63 为 37°C）中孵育 4-5 天。

3. 板染色（第 5 天）

D. 斑块测定 - 滴定病毒中相同的程序。

注意：斑块测定中三种 CoV 的最佳孵育时间在斑块测定 - 滴定病毒中确定。建议记录板开始孵育的时间，以确定何时准备好进行染色。

数据分析

A. 用于 CPE 检测中的病毒滴定

取每组的平均读数：无病毒、10 ^-1、10 ^-2、10 ^-3和10 ^-4稀释度。在 GraphPad Prism 8 中绘制数据，并通过将无病毒组的平均读数除以每个病毒稀释组的平均读数（图s 3C、4C、 5C)。选择具有最低病毒量的病毒稀释液，使 S/B > 5 进行复合测试。

注意：省略板外孔的读数（A 行和 H 行的孔，第 1 列和第 12 列），只使用内孔中的数据进行数据处理。与内孔相比，外孔中的数据不可靠，因为蒸发率较高，导致细胞生长不一致。另一种方法是仅在细胞播种期间设置板时用 PBS 或培养基填充外孔。

B. 用于测试 CPE 检测中的抑制剂

在 GraphPad Prim 8 中，创建“新表和图表”，选择“XY”，然后在“选项”上，为 Y 输入“3”重复值。在 X 列中输入日志（测试化合物的浓度）和三个重复值540 nm 处的吸光度值对应于 Y 列中测试化合物的每个浓度。单击“分析”按钮，选择“标准化”，输入“病毒”组在 540 nm 处的吸光度平均值为 0%，平均值“无病毒”组在 540 nm 处的吸光度值为 100%。测试化合物的 EC ₅₀s 通过使用 log（抑制剂）与具有可变斜率的响应的非线性回归拟合曲线来确定（图 3D、3E；4D、4E；5D、5E）。

注意：仅使用内孔中的细胞进行数据处理。

C. 用于噬斑测定中的病毒滴定

病毒滴度的计算：病毒滴度将通过取最后两个显示可数噬斑的孔的平均值来计算。对于HCoV-229E的滴定结果（图6A），10 ^-4孔有12个斑块，因此滴度为12×10 ⁴PFU/0.5 mL，对应2.4×10 ⁵PFU/mL； 10 ^-3孔有80个噬菌斑，因此滴度为80×10 ³PFU/0.5 mL，对应1.6×10 ⁵PFU/mL。最终滴度为 (2.4 × 10 ⁵PFU/mL + 1.6 × 10 ⁵PFU/mL)/2 = 2 × 10 ⁵PFU/mL。对于HCoV-NL63的滴定结果（图7A），10 ^-6孔有4个斑块，因此滴度为4×10 ⁶PFU/0.5 mL，对应8×10 ⁶PFU/mL； 10 ^{-5 孔}有32个噬菌斑，因此滴度为32×10 ⁵PFU/0.5 mL，对应6.4×10 ⁶PFU/mL。最终滴度为 (8 × 10 ⁶PFU/mL + 6.4 × 10 ⁶PFU/mL)/2 = 7.2 × 10 ⁶PFU/mL。对于HCoV-OC43的滴定结果（图8A），10 ^-5孔有8个斑块，因此滴度为8×10 ⁵PFU/0.5 mL，对应1.6×10 ⁶PFU/mL； 10 ^{-4 孔}有58个噬菌斑，因此滴度为58×10 ⁴PFU/0.5 mL，对应1.16×10 ⁶PFU/mL。最终滴度为 (1.6 × 10 ⁶PFU/mL + 1.16 × 10 ⁶PFU/mL)/2 = 1.38 × 10 ⁶PFU/mL。 HCoV-229E、HCoV-NL63 和 HCoV-OC43 滴度计算的结果总结在表 3 中。

表 3. HCoV-229E、HCoV-NL63 和 HCoV-OC43 的滴度计算。

D. 用于检测斑块测定中的抑制剂

量化 ImageJ 中 6 孔板的每个孔中的斑块面积（有关如何使用 ImageJ 测量面积百分比的分步详细说明，请参见此网站： https ://cs.appstate.edu/ret/imageJ /PClabs/imlab/measure/pctarea.html ）。在 GraphPad Prim 8 中，创建“新表和图表”，选择“XY”，然后在“选项”上，为 Y 输入“2”重复值。在 X 列中输入日志（测试化合物的浓度）和两个重复值在 ImageJ 中量化的斑块面积对应于 Y 列中测试化合物的每个浓度。单击“分析”按钮，选择“标准化”，输入 0 作为 0%，“DMSO”孔的斑块面积平均值为 100 %。测试化合物的 EC ₅₀s 通过使用 log（抑制剂）与具有可变斜率的响应的非线性回归拟合曲线来确定（图 3D、3E；4D、4E；5D 和 5E）。

注意：斑块区域用于量化，因为它提供了更准确的结果，因为由相同病毒感染形成的斑块不均匀且大小不同。此外，在斑块测定中，一些化合物通过在某些较低浓度下减小斑块的大小并在较高浓度下完全抑制斑块形成而显示出抗病毒活性。

笔记

故障排除

故障排除建议见表 4。

表 4. CPE 和斑块检测的故障排除信息。

食谱

1. 10× PBS 库存

将 17.8 g Na ₂HPO ₄·2H ₂O、2.4 g KH ₂PO ₄、80 g NaCl 和 2 g KCl 溶解在 1 L 纳米纯 H ₂O 中。高压灭菌并在 4°C 下储存长达 2 个月。

2. 100× MgCl2 库存

将 10.165 g MgCl ₂·6H ₂O 溶解在 1 L 纳米纯 H ₂O 中。用 0.2 µm 真空驱动过滤器过滤，并在 4°C 下储存长达 2 个月。

3. 100× CaCl2 库存

将 9.989 g CaCl _2溶解在 1 L 纳米纯 H ₂O 中。用 0.2 µm 真空驱动过滤器过滤并在 4°C 下储存长达 2 个月。

4. DPBS，不含钙和镁

将 100 mL 的 10× PBS 原液加入 900 mL 纳米纯水中，高压灭菌并在室温 (20-30°C) 下储存长达 2 个月。

5. PBS，含钙和镁

对于 1 L，将 100 mL 的 10× PBS 库存、10 mL 的 100× MgCl ₂库存、10 mL 的 100× CaCl ₂库存添加到 880 mL 的纳米纯水中。使用 0.2 µm 真空驱动过滤器进行过滤，并在室温 (20-30°C) 下储存长达 2 个月。

6. 中性红原液 (4 mg/mL)

称重 400 mg 中性红色粉末，搅拌 2 小时溶解在 100 mL DPBS 中，并用 0.2 μm 真空驱动过滤器过滤溶液。用箔纸保护溶液避光并在室温 (20-30°C) 下储存长达 2 个月。

7. 完全培养基（培养基加 10% FBS 和 1%P/S，vol/vol）

对于 500 mL 的 DMEM，添加 50 mL 的 FBS 和 5 mL 的 P/S。充分混合并在 4°C 下储存长达 2 周。

8. 中性红工作溶液 (50 µg/mL)

在无菌条件下，用 DMEM 在离心管中稀释 1:80 的中性红色原液。例如，将 150 μL 的中性红色库存溶液与 11.85 mL 的 DMEM 混合，用于一个 96 孔板。在培养细胞的培养箱中孵育过夜。

注意：中性红工作液应在使用前一天配制，并在 CO2 细胞培养箱中孵育过夜。

9. 中性红脱色溶液（50% 乙醇、49% 去离子水、1% 冰醋酸，vol/vol）

加入 500 mL 乙醇（96%）、490 mL 纳米纯水、10 mL 冰醋酸，搅拌均匀 15 min，室温（20-30°C）保存，最长可达 2 个月.

10. 2× DMEM

将 2 包 DMEM 粉末和 7.4 g NaHCO _3溶解到 1 L 的纳米纯 H ₂O 中，加入 10 mL 1 M 的 HEPES 缓冲液（pH7.2）和 20 mL 的 100× P/S。用浓 HCl 将 pH 值调节至 ~7.2。使用 0.2 µm 真空驱动过滤器进行过滤，并在 4°C 下储存长达 2 周。

11. 1.2% 微晶纤维素 (wt/vol)

称取12 g Avicel 粉末，加入1 L 纳米纯H ₂O 中，室温搅拌1-2 h。高压灭菌并在室温 (20-30°C) 下储存长达 3 个月。

12. 0.2% 结晶紫（重量/体积）

称取 2 g 结晶紫，加入 200 mL 甲醇中混匀，使结晶紫完全溶解。加入 800 mL 纳米纯水，搅拌均匀，室温（20-30°C）保存，最长可保存 6 个月。

致谢

JW 得到了美国国家过敏和传染病健康研究所 (NIH)（赠款 AI147325、AI157046 和 AI158775）和亚利桑那州生物医学研究委员会中心青年研究员赠款 (ADHS18-198859) 的支持。 YH 得到了 NIH 培训补助金 T32 GM008804 的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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