材料和试剂

1. 96孔板（Himedia，目录号：TPP96）

2. 使用的细胞系：A780 和 OAW42 细胞系（第 10-15 代）获自美国斯坦福大学放射学系已故 Sam Gambhir 博士的实验室（细胞的 STR 分析已包含在补充文件中）。

3. DMEM（Gibco/Invitrogen，目录号： 12800017 ）

4. 胎牛血清（FBS）（Himedia，目录号： RM10409 ）

5. 青霉素-链霉素（Himedia，目录号： A002 ）

6. 胰蛋白酶-EDTA（Gibco/Invitrogen，目录号： 25200072）

7. DMSO（Himedia，目录号： TC185）

8. 顺铂（Sigma，目录号： P4394）

9. 紫杉醇（ Sigma，目录号： T1912 ）

10. 二甲双胍（Sigma，目录号： PHR1084）

11. Superfect转染试剂（Qiagen，目录号： 301307）

12. 噻唑蓝四唑溴化物（Sigma，目录号：M2128-1G）

13. 碘化丙啶（Sigma，目录号：P4170）

14. RNase A（ Sigma，目录号：R4875）

15. 药材（见食谱）

设备

1. 台式离心机（ Eppendorf 离心机，型号：5804 R）

2. 培养箱（Thermo Scientific，型号：3121）

3. Esco II 级生物安全柜

程序

概述：

A2780 和 OAW42 细胞分别用紫杉醇和顺铂处理，并与递增剂量联合处理。通过MTT法在不同阶段测量细胞活力，以估计抗性程度。继续开发每个模型直到细胞在IC ₅₀剂量的敏感细胞下达到80-90％的存活率。随着细胞逐渐获得抗性，观察到形态变化（二甲双胍-顺铂-紫杉醇模型的早期和晚期抗性阶段的代表性图像如图 1 所示）（视频 3）。进行 FACS 分析以评估抗性细胞的细胞周期变化，其中 A2780 顺铂抗性和 A2780 紫杉醇抗性模型的代表性数据显示在图 2g 和 2h 中。与A2780敏感细胞相比，晚期抗性细胞在G ₀-G _1阶段表现出显着增加。

图1。 耐药性发展过程中细胞的形态变化。

(a) A2780 敏感细胞； (b) 第 4^个A2780 顺序 Met-Cis-Pac 模型； (c) 第 15^个A2780 顺序 Met-Cis-Pac 模型； (d) 第 4^个A2780 组合 Met-Cis-Pac 模型； (e) 第 15^个Met-Cis-Pac 组合模型。箭头表示在二甲双胍连续和组合双重耐药获得过程中不同阶段观察到的形态变化。同样，在存在和不存在药物的情况下，以视频的形式捕获了敏感、早期和晚期耐药细胞的形态变化。

视频 1. A2780 双重耐药性。

视频 1 显示了 A2780 细胞系中的顺铂和紫杉醇双重耐药模型。它由 A2780 敏感细胞、A2780 Cis-Pac 处理的细胞、早期抗性敏感和 Cis-Pac 处理的细胞（第 9^阶段）和晚期抗性敏感和 Cis-Pac 处理的细胞（第 16^阶段）组成。（UT - 未处理，DT - 药物处理）

视频 2. A2780 顺铂耐药。

视频 2 显示了 A2780 细胞系中的顺铂耐药模型。它包括 A2780 敏感细胞、A2780 顺铂处理的细胞、早期耐药敏感和顺铂处理的细胞（第 9^阶段）和晚期耐药敏感和顺铂处理的细胞（第 16^阶段）。（UT - 未处理，DT - 药物处理）

视频 3. OAW42 二甲双胍双重耐药性。

视频 3 显示了 OAW42 细胞系中的二甲双胍连续耐药模型。它由 OAW42 敏感细胞、OAW42 二甲双胍-顺铂-紫杉醇处理的细胞、早期耐药敏感和二甲双胍-顺铂-紫杉醇处理的细胞（第 9^期）和晚期耐药敏感和二甲双胍-顺铂-紫杉醇处理的细胞（第 13^期）组成. （UT - 未处理，DT - 药物处理）

A. 开发针对单一药物的化学抗性模型

A1。 A2780 或 OAW42 细胞中的紫杉醇抗性模型

1. 根据每个细胞系的增殖率，在 100 mm 培养皿中播种 100 万个 A2780 或 50 万个 OAW42 细胞。

2. 播种 24 小时后，用 60 nM（对于 A2780）或 1.77 μM（对于 OAW42）紫杉醇处理细胞 2 小时，然后用 4 mL 新鲜培养基替换它们。通过为每个细胞系计算 72 小时的个体 IC _50值来确定用于第一次治疗的这些精确药物浓度的选择。

3. 药物治疗后，会观察到大量细胞死亡，最终会在几天内形成个体集落。在我们的案例中，A2780 和 OAW42 细胞都出现了广泛的细胞死亡，几天后单个菌落开始生长。由于 A2780 细胞的体积较小，足够数量的大菌落需要 5-6 天才能达到 60-70% 的汇合度。对于尺寸相对较大的 OAW42 细胞，菌落在三天后开始合并（60-70% 汇合）。

4. 在 100 mm 培养皿中对大约 100 万个细胞进行胰蛋白酶消化并重新接种，以进行第二个治疗周期。为了模拟临床情况，我们避免选择可能具有不同分子特征和抗性指数的单个克隆。

5. 再次应用相同剂量的紫杉醇 2 小时，然后添加新鲜培养基并使其生长 60-70% 汇合。同样，在我们的案例中，我们观察到两种细胞系的细胞死亡和集落形成。

6. 接下来，胰蛋白酶消化并重新接种大约 100 万个细胞，以进行相同剂量的第三个治疗周期，并让它们在新鲜的生长培养基中生长。有趣的是，从第三个处理周期开始，A2780 和 OAW42 细胞都表现出更均匀的生长模式。

7. 一旦细胞达到 60-70% 的汇合，将细胞用胰蛋白酶消化并冷冻 50% 以备将来使用。如表 1 中所述，以增量剂量重新播种剩余细胞以进行下一次治疗。

表 1. A2780 和 OAW42 细胞中每个治疗周期使用的紫杉醇浓度。

8. 在此步骤中，为 MTT 播种一些细胞，以将其药物敏感性与相应的敏感（A2780 或 OAW42）细胞进行比较。

9. 对于 MTT，在 96 孔板中以 3 的密度播种细胞，每孔000 个细胞，总体积不超过 100 μL 。

10. 用一系列药物浓度处理细胞，并在 5% CO ₂培养箱中在 37°C 下孵育板 72 小时。

11. 孵育后，用 20 µL的 5 mg/mL MTT 处理细胞，并在 37°C 的 5% CO ₂培养箱中孵育板 3 小时。

12. 从每个孔中取出介质，每孔加入 100 μL DMSO，以溶解染料。

13. 将盘子放在摇床中孵育 15 分钟，使染料溶解在 DMSO 中。测量染料在两种不同波长（560 nm 和 670 nm）下的吸光度。最后，与各个敏感细胞的 IC _50剂量相比，测量电阻的获得。

注意：从 670 nm 处获得的吸光度中减去 560 nm 处获得的吸光度，以抵消由于 DMSO 的存在而产生的背景吸光度。

14. 对 A2780 和 OAW42 细胞重复类似的紫杉醇治疗周期，增加剂量，如表 1 所述。

15. 此外，对中间阶段进行 MTT 测定，以验证紫杉醇化学抗性的发展。

注意：我们在 A2780 细胞的第 6、12 和 13 个周期以及 OAW42 细胞的第 8、11 和 12 个周期进行了此检测（图 2a 和 2b）。

16. 使用公式计算表示在不同阶段获得的阻力水平的阻力指数：

RI =耐药细胞的 IC 50 值/_对照细胞的IC _50值

图 2. 细胞活力测定和细胞周期分析描述了 A2780 和 OAW42 细胞不同阶段的耐药性增加。

IC ₅₀值处理细胞。 (a) 抗紫杉醇的 A2780 细胞在第 13 抗性阶段显示出 93.1% 的存活率， (b) ^OAW42细胞在第 12 级抗性中显示出 95.3% 的^存活率。类似地，(c) 顺铂处理的 A2780 细胞在第 15 阶段显示出 99.3% 的存活率， (d) 顺铂处理的^OAW42细胞在第 14 阶段显示出 90.49% 的细胞^存活率。 € A2780 在^Cis-Pac 耐药性的第 15 阶段显示大约 100% 的细胞活力。同样，对于 (f) ^{OAW42细胞，第 13}阶段的细胞活力几乎为 92.9% 。 (g) 与 A2780 细胞相比，顺铂和紫杉醇晚期抗性 A2780 细胞在 G ₀-G _1期显示出显着的细胞周期阻断。

A2. A2780 或 OAW42 细胞中的顺铂耐药模型

1. 在 100 毫米培养皿中播种 100 万个 A2780 或 50 万个 OAW42 细胞。

2. 播种 24 小时后，用 3.32 μM （对于 A2780）或 1.66 μM（对于 OAW42）的顺铂处理细胞 2 小时，然后用 4 mL 的新鲜培养基替换。通过计算 72 小时的单个细胞系特异性 IC _{50值确定用于第一次治疗的这些精确药物浓度的选择。}

3. 药物治疗后，会观察到大量细胞死亡，最终会在几天内形成个体集落。在我们的案例中，A2780 和 OAW42 细胞都出现了广泛的细胞死亡，几天后单个菌落开始生长。由于 A2780 细胞的体积较小，足够数量的大菌落需要 5-6 天才能达到 60-70% 的汇合度。对于尺寸相对较大的 OAW42 细胞，菌落在三天后开始合并（60-70% 汇合）。

4. 在 100 mm 培养皿中胰蛋白酶化并重新接种约 100 万个细胞，用于第二个治疗周期。为了模拟临床情况，我们避免选择可能具有不同分子特征和抗性指数的单个克隆。

5. 再次应用相同剂量的顺铂 2 小时，然后加入新鲜培养基，让它们生长 60-70% 汇合。同样，在我们的案例中，我们观察到两种细胞系的细胞死亡和集落形成。

6. 接下来，胰蛋白酶消化并重新接种大约 100 万个细胞，以进行相同剂量的第三个治疗周期，并让它们在新鲜的生长培养基中生长。有趣的是，从这一点开始，A2780 和 OAW42 细胞都显示出更均匀的生长模式。

7. 一旦细胞达到 60-70% 的汇合，将细胞用胰蛋白酶消化并冷冻 50% 以备将来使用。如表 2 中所述，以增量剂量重新播种剩余细胞以进行后续处理。

表 2. A2780 和 OAW42 细胞中每个治疗周期使用的顺铂浓度。

8. 在此步骤中，为 MTT 播种一些细胞，以将其药物敏感性与相应的敏感（A2780 或 OAW42）细胞进行比较。

9. 对于 MTT，在 96 孔板中以每孔 3000 个细胞的密度播种细胞，总体积不超过 100 μL，并按照 A1 节中所述的步骤进行操作。

10. 对其余的 A2780 和 OAW42 细胞重复类似的顺铂治疗周期，增加剂量，如表 2 中所述。

11. 此外，对中间阶段进行 MTT 测定，以检查顺铂化学抗性的发展。

注意：我们在 A2780 细胞的第 9、12 和 15 个周期以及 OAW42 细胞的第 6、9 和 11 个周期进行 MTT（图 2c 和 2d）。

12. 使用公式计算不同阶段的阻力指数：

RI=抗性细胞的IC 50 值/_对照细胞的IC _50值

B. A2780 和 OAW42 细胞中的顺铂和紫杉醇 (Cis-Pac) 组合耐药模型

1. 在 100 毫米培养皿中播种 100 万个 A2780 或 50 万个 OAW42 细胞。

2. 播种 24 小时后，用 3.32 μM 顺铂 + 60 nM 紫杉醇处理 A2780 细胞 2 小时，用 0.332 μM 顺铂 + 0.05 μM 紫杉醇处理 OAW42 细胞 4 小时，并用 4 mL 新鲜培养基替换。为了确定与紫杉醇联合使用的顺铂的 IC _{50剂量，我们围绕每种药物的单个 IC 50值}制备了一系列系列稀释液，并对两种细胞系进行了测试。该组合IC ₅₀剂量的顺铂+紫杉醇用于第一次治疗。

3. 药物治疗后，会观察到大量细胞死亡，最终会在几天内形成个体集落。在我们的案例中，A2780 和 OAW42 细胞都出现了广泛的细胞死亡，几天后单个菌落开始生长。由于 A2780 细胞的体积较小，足够数量的大菌落需要 5-6 天才能达到 60-70% 的汇合度。对于尺寸相对较大的 OAW42 细胞，菌落在三天后开始合并（60-70% 汇合）。

4. 在 100 mm 培养皿中胰蛋白酶化并重新接种约 100 万个细胞，并用于第二个处理周期。为了模拟临床情况，我们避免选择可能具有不同分子特征和抗性指数的单个克隆。

5. 再次应用相同剂量的顺铂和紫杉醇 2 小时，然后加入新鲜培养基，让它们生长 60-70% 汇合。同样，在我们的案例中，我们观察到两种细胞系的细胞死亡和集落形成。

6. 接下来，胰蛋白酶消化并重新接种大约 100 万个细胞，以进行相同剂量的第三个治疗周期，并让它们在新鲜的生长培养基中生长。有趣的是，A2780 和 OAW42 细胞都表现出更均匀的生长模式。

7. 在此步骤中，为 MTT 播种一些细胞，以将它们的药物敏感性与相应的敏感（A2780 或 OAW42）细胞进行比较，并如 A1 节所述进行 MTT 测定。

8. 对于剩余的细胞，一旦它们达到 60-70% 的融合，将它们胰蛋白酶化并冷冻 50% 以备将来使用。如表 2 中所述，以增量剂量重新播种剩余细胞以进行后续处理。

9. 对 A2780 和 OAW42 细胞重复类似的顺铂和紫杉醇治疗周期，增加剂量，如表 1 所述。

10. 此外, 对中间阶段进行 MTT 检测, 以监测 Cis-Pac 组合化学抗性的发展。

注意：我们在 A2780 细胞的第 4、12 和 15 个周期以及 OAW42 细胞的第 6、9 和 13 个周期进行 MTT（图 2e 和 2f）。

11. 使用公式计算不同阶段的阻力指数：

RI = 耐药细胞的 IC50 值/对照细胞的 IC50 值。

表 3. A2780 和 OAW42 细胞中每个处理周期使用的 Cis-Pac 浓度。

C. A2780 或 OAW42 细胞中的二甲双胍-Cis-Pac 耐药模型

已知 2 型糖尿病与多种癌症的风险增加有关，包括卵巢癌。为了更好地了解二甲双胍（2 型糖尿病最常用的处方药）干预在获得化学抗性中的作用，在 A2780 和 OAW42 细胞中开发了两种不同的化学抗性模型。由于缺乏这方面的任何现有研究，因此采用了两种不同的策略：

一世。用二甲双胍连续处理细胞 24 小时，然后进行 2 小时的顺铂-紫杉醇处理，并且，

ii.二甲双胍联合顺铂-紫杉醇治疗两小时。

A2780 和 OAW42 细胞中的序贯二甲双胍双药/组合二甲双胍双药耐药模型

1. 在 100 mm 培养皿中播种 100 万个 A2780 细胞或 50 万个 OAW42 细胞。

二甲双胍序贯治疗

a. _20浓度）处理细胞24 小时（二甲双胍的 IC ₅₀和 IC ₂₀浓度使用 MTT 测定法测定，详见 A1.15 节 - 数据未显示）。

b. 完成二甲双胍预处理后，用表 3 中所述的顺铂和紫杉醇浓度的不同组合处理细胞 2 小时，并用 4 mL 新鲜培养基代替。

二甲双胍联合治疗

用 2 mM 二甲双胍（IC ₂₀浓度）+ Cis-Pac 浓度处理细胞 2 小时。

A2780 和 OAW42 细胞中每个治疗周期使用的二甲双胍顺序/组合药物浓度。

(i) 序贯处理 – 2 mM 二甲双胍预处理 24 小时，然后顺式-Pac 处理 2 小时，如下所述。 (ii) 联合治疗 – 2 mM 二甲双胍 + Cis-Pac 治疗 2 小时。

2. ^次给药前培养细胞，直到它们达到 60-70% 以上的汇合度。对于该模型，在第^一次处理后观察到具有均匀生长的中度细胞死亡。

3. 根据模型重复上述第二个治疗周期，用 4 mL 新鲜培养基替换药物，并孵育细胞直至达到 60-70% 融合。同样，对于两种细胞系都观察到具有中度细胞死亡的均匀生长。

4. 将细胞胰蛋白酶化并冷冻 50% 的细胞以备将来使用，并将剩余的细胞重新播种以在 100 mm 培养皿中进行下一个处理周期。

5. 为 MTT 测定播种一些细胞，并按照 A1 部分所述执行 MTT。

6. 对于连续的治疗周期，重复这些步骤，保持二甲双胍剂量不变，但逐渐增加 Cis-Pac 的浓度，如表 4 中所述。

7. 如表 4 所述，通过保持二甲双胍剂量恒定但逐渐增加顺-Pac 的浓度，重复连续的治疗周期以开发 MSLR 和 MCLR 模型。

8. 此外，对中间阶段进行 MTT 测定，以监测顺序和组合二甲双胍双重耐药模型中耐药性的发展。

注意：我们在 A2780 细胞的第 4、12 和 15 个周期以及 OAW42 细胞的第 6、9 和 13 个周期进行了 MTT 检测（图 3a、3b、3c 和 3d）。

图 3。 细胞活力测定描述了 A2780 和 OAW42 细胞不同阶段的耐药性增加。

₅₀值处理细胞。 (a) 在连续二甲双胍双重耐药的 A2780 细胞的情况下，在第 15 阶段观察到 97.12% 的细胞活力，(b) 在^{第13 阶段， OAW42}细胞显示出 81.5% 的细胞活力。类似地，（c）在二甲双胍-顺铂-紫杉醇抗性A2780细胞的情况下，在第15阶段观察到84.80％的细胞活力^，并且d。 ^OAW42细胞在第13阶段显示出77.6%的细胞活力。

应用：

上述化学抗性模型的发展使我们了解了各种关键分子在化学抗性早期和晚期的差异调节。我们的研究表明，早期耐药（顺铂、紫杉醇或 Cis-Pac）细胞具有上调的胰岛素样生长因子受体 (IGF1R) 表达，其在晚期耐药阶段下降（Singh等人，2014；Dhadve等人。 , 2020)。无论药物的性质如何，晚期耐药模型对两种细胞系都显示出高 AKT 活化。 IGF1R 信号传导的这种脉动性质调节癌症干细胞群的差异水平，以及它们在不同抗性阶段的功能和差异自噬通量（Singh等人，2016；Bishnu等人，2021）。使用这些模型，我们还展示了二甲双胍作为化学增敏剂的能力，通过减少癌症干细胞样群体来阻碍化学抗性（Bishnu等人，2019 年）。我们相信，这些化疗耐药模型在研究复杂的分子特征和评估分子的治疗相关性方面具有广泛的潜力，这些分子可以选择性地靶向化疗耐药的不同阶段，也可以广泛适用于其他癌细胞系。

食谱

药物库存浓度和储存说明：

顺铂：治疗时在 DMSO 中新鲜制备 33.3 mM (10 µg/µL) 储备溶液。

紫杉醇：在 DMSO 中制备 11.71 mM (10 µg/µL) 储备溶液并储存在 -20 °C中。

二甲双胍：在 DMEM 中制备 1 M 原液并储存在 4 °C中。

致谢

PS 和 SC 承认 TMC-ACTREC 的奖学金。 PR 承认 ACTREC-TMC 的资助。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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2. Bishnu, A.、Sakpal, A.、Ghosh, N.、Choudhury, P.、Chaudhury, K. 和 Ray, P. (2019)。二甲双胍的长期治疗通过卵巢癌细胞中牛磺酸的产生来调节癌症干细胞分化，从而阻碍化学抗性的发展。 Int J Biochem Cell Biol 107：116-127。

3. Deng, J.、Bai, X.、Feng, X.、Ni, J.、Beretov, J.、Graham, P. 和 Li, Y. (2019)。抑制 PI3K/Akt/mTOR 信号通路通过逆转上皮间质转化和降低癌症干细胞标志物表达来减轻卵巢癌的化疗耐药性。 BMC 癌症19（1）：618。

4. Dhadve, AC, Hari, K., Rekhi, B., Jolly, MK, De, A. 和 Ray, P. (2020)。解码 RUNX1 和 FOXO3a 之间的分子相互作用，这是获得化学抗性期间脉动 IGF1R 表达的基础。 Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 1866(6): 165754。

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6. Singh, RK, Gaikwad, SM, Jinager, A., Chaudhury, S., Maheshwari, A. 和 Ray, P. (2014)。 IGF-1R 抑制增强了化疗药物在早期化疗耐药卵巢癌细胞的细胞毒作用。 癌症快报354（2）：254-262。

7. Singh, RK, Dhadve, A., Sakpal, A., De, A. 和 Ray, P. (2016)。活跃的 IGF-1R-AKT 信号传导赋予卵巢 CSC 群体功能异质性。 科学代表6：36612。

8. Yan, XD, Li, M., Yuan, Y., Mao, N. 和 Pan, LY (2007)。两种不同给药方式对卵巢癌抗性细胞系与顺铂和紫杉醇的生物学比较。 Oncol 代表17（5）：1163-1169。

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10. 郑慧聪（2017）。癌症化疗耐药的分子机制。 Oncotarget 8（35）：59950-59964。

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