材料和试剂

1. 1-mL注射器（TERMO Co. Ltd.，目录号：SS-01T）

2. 1.5 mL微管（Funakoshi Co. Ltd.，目录号：1210-00）

3. 15 mL Falcon 管（Corning，目录号：352096）

4. 移液器吸头（P20、P100、P1000： Greiner，目录号：771351、770320、770340）

5. 移液器（GILSON，M&S Instruments Inc.，目录号：F144802、F123601、F123602）

6. 巴斯德吸管（Funakoshi Co. Ltd.，目录号：63B92）

7. 10-µL hamilton 微量注射器（GL Science，目录号：4015-63015）

8. EZ-TAXIScan（GE Healthcare Bioscience Co. Ltd.，目录号：EZT-01-4）的尖端厚度为 4 µm

9. 24孔板（BD Falcon，Corning，目录号：353047）

10. 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4；Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：158127）

11. RPMI 1640（pH 7.4，Sigma-Aldrich，目录号：R8758）

12. Dalbecco 改性 Eagle 培养基（DMEM，pH 7.4，Sigma-Aldrich，目录号：D6429）

13. 马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：26050070）

14. 胎牛血清（FBS；Fujifilm Wako Chemicals Co.，Ltd.，目录号：FB-1345）

15. 青霉素（10,000单位）和链霉素（10mg）（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）

16. Venoject II（Terumo Coop.，目录号：VP-AS109K）

17. 植物血凝素（PHA；Fujifilm Wako Chemicals Co.，Ltd.，目录号：161-15251）

18. Lymphoprep（Cosmo Bio Co.Ltd.，目录号：331312）

19. 淋巴细胞-多细胞分离培养基（Cosmo Bio Co. Ltd.，目录号：CL5070）

20. 二甲基亚砜（DMSO；Sigma-Aldrich，目录号：D2650）

21. Mosapride citrate hydrate (Sumitomo Dainipon Pharma Co. Ltd., KEGG drug: D00724)

22. 舒必利（Nichi-iko Pharmaceutical Co. Ltd.，KEGG 药物：D01226）

23. 雷贝拉唑钠（卫材株式会社，KEGG药：D00724）

设备

1. 离心机（ TOMY Co. Ltd.，目录号：NIX-521）

2. 培养箱（37 °C ，5% CO ₂）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：4130TS）

3. 冰箱（NIHON Freezer Co. Ltd.，目录号：KGT-4056HC）

4. 冰箱（NIHON Freezer Co. Ltd.，目录号：VT-208）

5. 倒置显微镜（ Olympus Co. Ltd.，目录号：CKX-53 ）

6. EZ-TAXIScan 系统（GE Healthcare Bioscience Co. Ltd.，目录号：MIC-1001）

软件

1. ImageJ 软件：Java 中的图像处理和分析，“ https://imagej.nih.gov/index.html ”，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，医学博士，美国

2. 趋化性和迁移工具，“ https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html ”，ibidi GmbH, Gräfelfing, Bayern, DE

3. GraphPad Prism 软件：“ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ”，GraphPad 软件，美国加利福尼亚州拉霍亚

程序

A. PBMC分离

1. 外周血单个核细胞 (PBMC) 从受试者的全血样本中提取，使用 Lymphoprep 溶液 (22 °C ) 进行密度梯度离心。

2. 将 Lymphoprep 溶液添加到 15 mL 管中。

3. 用等体积的 PBS 稀释血液。

4. 在 Lymphoprep 上铺一层血液，注意尽量减少血液与 Lymphoprep 的混合。

5. 使用摆动转子在室温下以 800 × g离心 20 分钟。

6. 使用巴斯德移液器将单核细胞层转移到血浆层下，而不会干扰血浆-Lymphoprep 与新管的界面。

7. 用 10 mL 冰冷的 PBS 洗涤两次后，将细胞以 1.25 × 10 ^{6 个}细胞/ mL的浓度重悬于补充有马血清 (5%)、青霉素 (100 U /毫升）和链霉素（100微克/毫升）。

B. 趋化细胞

1. 使用淋巴细胞-多细胞分离培养基 (22 °C ) 从无过敏症状的志愿者血液样本中分离富含粒细胞的细胞层（趋化细胞）。

2. 在 15 mL 管中等体积的 Lypmpholyte-poly 上小心地分层 5 mL 全血。

3. 500 ×离心机 g在室温下在摆动转子中 30 分钟。

4. 收获多形核细胞（趋化细胞）带（下带）并使用巴斯德吸管转移新管。

5. 用 PBS 洗涤细胞，400 ×离心 g在室温下放置 10 分钟。

6. 将趋化细胞悬浮在 DMEM 培养基 (22 °C ) 中，浓度为 1 × 10 ^{7 个}细胞/ mL 。

C. 血清分离

1. 使用 Venoject II 管将受试者的血清与全血样本分开。

2. 采血后，将试管在室温下放置 1 小时以上，然后在 350 ×下离心 10 分钟 g在室温下。

3. 将顶部的血清转移到猎鹰管中，如有必要，将其储存在 -20 °C直至进一步使用。

D. 药物溶液

1. 药物溶液含有试验药物（莫沙必利、舒必利或雷贝拉唑），其在 PBS 中的最终浓度为 Cmax 的二分之一（分别为 15、75 或 200 ng/ mL ），除了舒必利（在 DMSO 中）。

E. PHA溶液

1. mL的最终浓度溶解 PHA 来制备 PHA 溶液。

F. 抗原溶液的制备

1. µL ) 和受试者的血清 (50 µL )制备 sntigen 溶液。

G. 控制解决方案

1. 代替药物溶液，分别使用 50 μL的 PBS 或 PHA 溶液作为阴性和阳性对照。

H. 测试样品的制备（培养上清液）

1. 在 24 孔板中，通过添加 100 μL抗原溶液或对照溶液来刺激 PBMC 的 1.9 mL（2.4 × 10 ^{6 个}细胞）。

2. 在 CO ₂培养箱中，在 37 °C 下培养 PBMC 48-72 小时。

3. 将培养上清液转移至 15 mL 管中，室温下以 400 × g离心 5 分钟，收集在新管中作为测试样品，并储存在 -20 °C下备用。

I. 实时监测细胞迁移

1. et al ., 2003)记录细胞随时间推移对血清或培养上清液的迁移。

2. 将玻璃板安装在支架底部，并用 4 mL 的 RPMI 介质（37 °C ）填充房屋。

3. 将硅基板和晶圆夹具安装在玻璃板上的房屋中，并用机械夹具将它们压下。

4. 由于表面的光学平整度，通过机械压制使蚀刻基板的下表面与玻璃板之间的接触以及与高度抛光的不锈钢夹具的上表面之间的接触不漏水。

5. 组装时，通过用 1 mL 注射器推拉介质，去除观察区域或每个通道的隔间中的气泡（如果有）。

6. 在 EZ-TAXIScan 上的适当位置组装和设置观察单元后，将趋化细胞以 5-10 µL （5-10 × 10 ^{4 个}细胞）/well l 加载到下（前）孔中（图1A）。

7. 用 1 mL注射器通过抽吸移动观察区域附近的趋化细胞。

8. 随后，根据目的，将血清或培养上清液（1.5 μL /孔）添加到带有 10 μL微量注射器的上（后）孔中，从而产生梯度（梯度长度，260 μm）。

9. 对于富含人类粒细胞的细胞，观察阶段的深度为 4 µm。

10. 使用连接到显微镜的计算机，在 240 分钟的实验期间以 2 分钟的间隔记录观察区域中趋化细胞的图像。

11. 根据体液趋化因子的反应性，趋化细胞从下（前）孔向上（后）孔迁移（图2）。

图2. H i SAT中细胞迁移的典型图像。

从非过敏志愿者分离的趋化细胞通过注射器 (A) 抽吸在观察阶段的边缘对齐。通过使受试者的淋巴细胞与药物溶液反应，细胞根据含有趋化因子（AD）的培养上清液的浓度梯度迁移。使用血清代替培养上清液可以获得类似的图像。

数据分析

1. 细胞动力学计算

通过分析随机选择的 10-16 个迁移细胞，使用 ImageJ 软件插件“手动跟踪”（图 1）确定细胞迁移速度和行进距离。选择适当的时间范围来分析 HiSAT 中的细胞动力学（图 1 中的 0 到 18 分钟，2 分钟间隔）。 “趋化性和迁移工具”提供基于实验数据的速度和距离数值数据。从“手动跟踪”导出的 ASCII（强制格式）表直接导入到软件工具中。

2. 统计分析

数值数据表示为平均值±标准误差。使用单向方差分析分析不同治疗组之间的显着差异，然后使用 GraphPad Prism 软件进行 Bonferroni 多重比较检验或学生t检验。 P值<0.05被认为具有统计学意义。

致谢

这项研究得到了柿原科学技术研究基金会的基金 [赠款编号 27-8-3] 和福冈大学中央研究所的资金（赠款编号 116005、146003 和 187003）的部分支持。这项研究也得到了 JSPS KAKENHI（授权号 17K15534）的部分支持。

利益争夺

没有需要声明的利益冲突。

伦理

疑似有隐源性过敏样症状的患者于2011年4月至2017年12月在福冈大学医院（Fukuoka. Fukuoka, Japan）住院，志愿者被纳入本研究。志愿者为福冈大学附属医院无过敏症状的住院患者，并签署了使用定期采血废血的同意书。这项研究得到了福冈大学医院机构审查委员会的批准（批准号 IRB11-4-16）。此外，每位患者在入组前都获得了书面知情同意书。

参考

1. Kanegasaki, S.、Nomura, Y.、Nitta, N.、Akiyama, S.、Tamatani, T.、Goshoh, Y.、Yoshida, T.、Sato, T. 和 Kikuchi, Y. (2003)。一种用于定量测量趋化性的新型光学测定系统。 J 免疫方法282（1-2）：1-11。

2. Shibaguchi, H.、Yasutaka, Y. 和 Futagami, K. (2021)。用于快速诊断和确定过敏病原体的细胞动力学分析新方法。公共科学图书馆一号16(2)：e0246125。

3. Srinoulprasert, Y. (2021)。淋巴细胞转化试验和细胞因子检测试验：确定延迟型药物超敏反应的读出参数。 J 免疫方法496：113098。

4. Warrington, R.、Silviu-Dan, F. 和 Wong, T. (2018)。药物过敏。过敏哮喘临床免疫14（增刊 2）：60。