材料和试剂

1. 干净的纸巾

2. 入侵者（实验性）成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠

3. 居民（攻击者）成年雄性退休饲养员 Long-Evans 大鼠

4. 评分表（表 1）

5. 70% 乙醇

6. 用于设备的消毒湿巾（例如，Caviwipes 表面消毒湿巾，Metrex item# 13-1100）

表 1. 评分表。这是一个标准的计分表，对社交失败程序很有用。提交后，或者如果满足任何标准 (ac)，则第 1 阶段会话结束，入侵大鼠被放置在金属丝网罩中。第 2 阶段会话（由金属丝网罩隔开）在 15 分钟后结束。有关详细信息，请参阅下面的完整表格（表 2）。

设备

1. 居民鼠笼：消毒木片床上用品，21” × 11.5” × 8” 高，透明聚碳酸酯，金属丝顶

2. 大鼠运输笼：消毒木片床上用品，12” × 6.5” × 5” 高，透明聚碳酸酯，微型隔离器顶部

3. 较小的金属丝网外壳（图 3）：大约 6” × 7” × 8” 高，3/4” 方形网格，PVC 涂层

4. 带时间的数字秒表

程序

1. 居民入侵者范式的 RSDS 是啮齿动物慢性心理压力的稳健模型（Rygula等人，2005；Berton等人，2006；Liu等人，2017）。在我们的研究中，老鼠的笼子被随机分配到压力组和对照组。

注意：大多数 Long-Evans 退休饲养员在我们的条件下都具有侵略性，但有些不是。您可以在实验之前筛选这些老鼠，使用下面描述的相同的常驻入侵者方法，根据您的需要选择或多或少具有攻击性的老鼠。如果需要更积极的居民行为，预筛选标准可能包括攻击的短延迟和会话第一分钟内的多次攻击。在我们的实验中，退休的饲养员在几周和几个月的时间里表现出减少的攻击。如果退休的饲养员没有表现出攻击，它可能会从激进的居民轮换中移除。

2. 在实验当天早上，将常驻攻击者 Long-Evans 大鼠的笼子（每个笼子包含一只 Long-Evans 大鼠）运送到动物设施内光线昏暗且没有噪音的手术室。让它们不受干扰地在环境中适应 15-30 分钟。

注意：根据我们的经验，单个实验者可以同时执行此程序，最多可与 3 个常驻入侵者交互（即程序室中的 3 个常驻笼子）。一个人很难观察到更多。

3. 实验性 Sprague-Dawley 大鼠每天在其饲养室中称重，并记录它们的体重。还注意到动物状况，注意眼睛、鼻子或皮毛周围的卟啉。

4. 称重后，将 Sprague-Dawley 大鼠置于干净的运输笼中。

a. 对照大鼠（饲养在一起）在运输笼中停留 30 分钟，然后将它们放回其家笼中。

b. 应激组的大鼠被运送到与对照组分开的干净运输笼中的手术室。

5. 阶段 1（直接身体接触）：将个体 Sprague-Dawley 大鼠转移到手术室中常驻 Long-Evans 大鼠的笼子中，并紧紧固定笼子的盖子。这使得入侵者大鼠与常驻大鼠保持直接的身体接触（图 1）。记录了这一事件的时间。在整个交互过程中连续观察大鼠。

一组大鼠的所有评分均由一名训练有素的实验者进行。实验者被定位在允许清晰观察大鼠和快速干预的距离处，但足够远以至于大鼠不会将注意力指向实验者（约1-2米）。这些措施可以由一名实验者可靠地获得，因此我们没有定期进行视频会议。

图 1. 设置常驻入侵者程序。

A.带有金属丝网罩（绿色）的居民笼子的照片（左）。还显示了居民在场（右）的比例。 B.压力程序的第一阶段，当居民和入侵者可以有直接的身体接触时。 C.应力程序的第 2 阶段，当居民和入侵者被金属丝网罩隔开时。

6. 在直接身体接触期间，攻击者对入侵者的每次攻击均由训练有素的观察员手动评分，包括记下第一次攻击的时间（表 2）。当入侵者大鼠通过躺下并暴露腹面（腹部；图 2C）来屈服于攻击者的攻击时，就获得了失败。

7. 这种直接的身体接触每次最多允许 15 分钟。如果满足以下任一标准，则实验大鼠在 15 分钟前用金属丝网罩隔开： (i) 入侵者提交； (ii) 十次没有屈服的攻击； (iii) 5 分钟无攻击； (iv) 任何严重伤害实验大鼠的攻击。因此，有可能在没有每天表现出提交的情况下将老鼠移走。如果实验设计要求每日失败，则可以修改参数。

8. 第 2 阶段（物理分离）：入侵者在常驻大鼠笼内使用较小的金属丝网罩隔开15 分钟（图 1C，图 2C）。记录物理分离的时间。

注意：用于物理分离的金属丝网罩足够宽敞，不会对网罩内的入侵大鼠或网罩外的常驻大鼠的运动造成任何形式的物理限制。这样做是为了在第 2 阶段仅消除社会压力的物理成分，而不影响与压力源（攻击性大鼠）相关的感觉（视觉、听觉和嗅觉）成分。

9. 在实验之间用 70% 乙醇彻底清洁所有表面，包括金属丝网罩。

10. 连续五天重复相同的程序，每只入侵大鼠每天一次。居民-入侵者配对是循环的，这样每个入侵者每天都会经历一个新的居民。

笔记：

a. 常驻大鼠仅限于每天 3 次。在每天三个会话后，或经过较长时间（数周至数月）后，居民退休的饲养鼠往往表现出较少的攻击性。还注意到，在更换干净的笼子的当天，常驻老鼠的攻击性往往较小。

b.如果一只老鼠在一次攻击中受了重伤（眼睛受损，大伤口），它将被移除并人道地实施安乐死。在某些情况下，大鼠可能会受到不严重的伤口（例如，侧面小于 2 厘米，没有明显的肌肉损伤）。如果发生这种情况，应该用无菌盐水冲洗伤口，然后使用抗生素+镇痛药膏（例如新孢霉素双效药膏）。应每天监测大鼠。如果伤口在两天内没有闭合或以其他方式显示出显着改善，则应对大鼠实施安乐死。

c. 如果您的终点包括免疫学措施，您可能会考虑移除任何被划伤的老鼠，并对那些不会造成任何伤口的老鼠进行预筛选。

图 2. 攻击和失败期间的姿势。

A.社交互动的例子，然后是一个常见的姿势，表明即将发动攻击：常驻大鼠旋转，使其与入侵者侧翼并列，然后抬起靠近入侵者的后腿，以在它进入之前保持位置下一步。 B.升级为最常见攻击的后续步骤。常驻老鼠在保持后腿靠近入侵者的同时扭转身体，然后在入侵者下方转身。这将入侵者翻转过来，居民在上面。在其他不太常见的情况下，常驻大鼠可能会从顶部位置开始并继续攻击，例如当两只大鼠都处于直立拳击姿势时（未显示）。攻击后，入侵者可能会避开常驻老鼠。 C.体验后，入侵鼠表现出典型的失败姿势。在协议的这一点上，老鼠被一个金属丝网罩隔开。

表 2.三只入侵大鼠 (大鼠 1-3) 的五天重复社会失败协议的完整评分表示例，这些入侵大鼠 (大鼠 1-3) 暴露于常驻大鼠 (大鼠 1-3 和 6-9) 的轮换中。

制作金属丝网罩的说明

有市售的宠物围栏可能是合适的。我们从未尝试过这些选项，而是使用大多数五金店提供的耗材制造我们的外壳。制作金属丝网罩的材料有多种合适的选择。我们选择了 PVC 涂层钢网，因为它易于切割、弯曲成所需的形状，并且易于清洁。 0.5 - 1 英寸的网孔适合我们的目的，因为这对于常驻老鼠来说太小而无法有效攻击。由于其耐用性和重量，我们选择了 16 号网眼。最终尺寸约为 6 × 7 × 8 英寸。

材料

重型钢丝钳

钳

涂层金属丝网（例如，McMaster-Carr 的产品 9259T11；www.mcmaster.com）

拉链（例如，来自 McMaster-Carr 的 6705K35 项； www.mcmaster.com ）

脚步：

1. 将金属丝网切割成图案（图 3）。

2. 在指示处弯曲以形成一个开放的立方体。

3. 用拉链系紧边角。修剪拉链的末端。

图 3.完成的金属丝网罩的照片。

这个外壳已经使用了八年，并且损坏最小。此处显示了模板和说明。

数据分析

排除标准：重复压力体验的强度可以根据实验需要而变化。在我们的研究中，老鼠必须表现出至少一次失败，表现为被动失败姿势（见图 2）。如果实验大鼠受到严重伤害，则被排除在外（参见“程序”部分下的步骤 10 注释）。如果常驻大鼠表现出两次没有攻击的情况，或者如果它们持续以产生伤害的严重程度攻击，则将它们排除在外。

入侵者的每次攻击都由训练有素的观察者手动评分，包括记下第一次攻击的时间和物理分离的时间（表 2）。分析了以下参数：攻击者对入侵大鼠的攻击次数，大鼠是否提交，如果是，入侵者大鼠提交的时间（即，延迟提交，这将与“时间”相同分开”在我们的评分表中），以及每天提交的老鼠数量。

结论

在本文中，我们讨论了我们在研究中使用的大鼠 RSDS 诱导方案，表明 RSDS 能够诱导大鼠强烈的免疫和行为变化（Munshi等人，2020）。这是建立在许多先前的研究基础上的，这些研究已经成功地在大鼠和小鼠身上实现了社交失败。

致谢

作者非常感谢罗莎琳德富兰克林医科大学生物资源设施的 Matthew Anagnostopoulos 和他的团队照顾研究中使用的动物。该研究得到了美国国立卫生研究院 MH084970 和 MH109484 的资助。资助机构在研究设计、数据收集和分析或发表决定中没有任何作用。该协议基于 Munshi等人的原始研究文章。 (2020) 发表在《大脑、行为和免疫》上。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有实验均经罗莎琳德富兰克林医科大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准，并按照《实验动物护理和使用指南》（国家研究委员会，2011 年）进行。

参考

1. Berton, O., McClung, CA, Dileone, RJ, Krishnan, V., Renthal, W., Russo, SJ, Graham, D., Tsankova, NM, Bolanos, CA, Rios, M., Monteggia, LM, Self , DW 和 Nestler, EJ (2006)。 BDNF 在社会挫败压力中的中脑边缘多巴胺通路中的重要作用。科学311（5762）：864-868。

2. Bailey, MT, Kinsey, SG, Padgett, DA, Sheridan, JF 和 Leblebicioglu, B. (2009)。社会压力增强了牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激的 CD11b ⁺细胞产生的 IL-1beta 和 TNF-alpha 。生理行为 98（3）：351-358 。

3. Chaudhury, D., Walsh, JJ, Friedman, AK, Juarez, B., Ku, SM, Koo, JW, Ferguson, D., Tsai, HC, Pomeranz, L., Christoffel, DJ等。（2013）。通过控制中脑多巴胺神经元快速调节抑郁相关行为。自然493（7433）：532-536。

4. Colyn, L.、Venzala, E.、Marco, S.、Perez-Otano, I. 和 Tordera, RM (2019)。慢性社交失败压力会导致前额叶皮层和杏仁核持续的突触结构变化。行为大脑研究373：112079。

5. Golden, SA, Covington, HE, 3rd, Berton, O. 和 Russo, SJ (2011)。小鼠反复社交失败压力的标准化协议。国家协议6（8）：1183-1191 。

6. Jaisinghani, S. 和 Rosenkranz, JA (2015)。反复的社会挫败压力增强了强光对大鼠操作性寻求奖励行为的焦虑作用。行为大脑研究290：172-179。

7. Koolhaas, JM, De Boer, SF, De Rutter, AJ, Meerlo, P. 和 Sgoifo, A. (1997)。大鼠和小鼠的社会压力。 Acta Physiol Scand Suppl 640：69-72。

8. Liu, YY, Zhou, XY, Yang, LN, Wang, HY, Zhang, YQ, Pu, JC, Liu, LX, Gui, SW, Zeng, L., Chen, JJ, et al . （2017）。社交失败压力会导致大鼠前额叶皮层代谢物发生变化的抑郁样行为。公共科学图书馆一号12(4)：e0176725。

9. Munshi, S.、Loh, MK、Ferrara, N.、DeJoseph, MR、Ritger, A.、Padival, M.、Record, MJ、Urban, JH 和 Rosenkranz, JA (2020)。反复的压力会诱导促炎状态，增加杏仁核神经元和小胶质细胞的激活，并导致成年雄性大鼠焦虑。脑行为免疫84：180-199。

10. Powell, ND, Bailey, MT, Mays, JW, Stiner-Jones, LM, Hanke, ML, Padgett, DA 和 Sheridan, JF (2009)。反复的社交失败会激活树突状细胞并增强 Toll 样受体依赖性细胞因子分泌。脑行为免疫23（2）：225-231。

11. Patel, D., Anilkumar, S., Chattarji, S. 和 Buwalda, B. (2018)。反复的社会压力导致杏仁核和海马体结构可塑性的对比模式。 行为大脑研究347：314-324。

12. Riga, D., Theijs, JT, De Vries, TJ, Smit, AB 和 Spijker, S. (2015)。社会失败引起的快感缺乏：对操作性寻求蔗糖行为的影响。 前行为神经科学9：195。

13. Rygula, R.、Abumaria, N.、Flugge, G.、Fuchs, E.、Ruther, E. 和 Havemann-Reinecke, U. (2005)。大鼠的快感缺失和动机缺陷：慢性社会压力的影响。行为大脑研究162（1）：127-134。

14. Rygula, R.、Abumaria, N.、Domenici, E.、Hiemke, C. 和 Fuchs, E. (2006)。氟西汀对大鼠慢性社会压力引起的行为缺陷的影响。行为大脑研究174（1）：188-192。

15. Stark, JL, Avitsur, R., Hunzeker, J., Padgett, DA 和 Sheridan, JF (2002)。白细胞介素 6 和社会混乱诱导的糖皮质激素抵抗的发展。 神经免疫杂志124（1-2）：9-15。

16. Tallerova AV、Kovalenko LP、Tsorin IB、Durney AD和Seredenin SB (2014)。新型抗虚弱药物 Ladasten 对抑郁症社会失败动物模型中行为和 T 细胞亚群改变的影响。 Pharmacol 制药 5（1）：4-10。

17. Tornatzky, W. 和 Miczek, KA (1993)。短暂的间歇性社会压力后自主昼夜节律的长期损害。生理学行为 53（5）：983-993 。

18. Tidey, JW 和 Miczek, KA (1997)。社会压力后可卡因自我管理的获得：伏隔核多巴胺的作用。精神药理学 (Berl) 130(3): 203-212。

19. Tsankova, NM, Berton, O., Renthal, W., Kumar, A., Neve, RL 和 Nestler, EJ (2006)。在抑郁症和抗抑郁作用的小鼠模型中持续的海马染色质调节。 Nat Neurosci 9（4）：519-525。

20. Volkmann, P.、Stephan, M.、Krackow, S.、Jensen, N. 和 Rossner, MJ (2020)。 PsyCoP - 系统半自动行为和认知分析平台揭示了 Tcf4 转基因小鼠遭受社会失败的基因和环境依赖性损伤。 前行为神经科学14：618180。

21. Wohleb, ES, Hanke, ML, Corona, AW, Powell, ND, Stiner, LM, Bailey, MT, Nelson, RJ, Godbout, JP 和 Sheridan, JF (2011)。 β-肾上腺素受体拮抗作用可防止反复社交失败引起的焦虑样行为和小胶质细胞反应。神经科学杂志 31（17）：6277-6288。

22. Wohleb, ES, Powell, ND, Godbout, JP 和 Sheridan, JF (2013)。压力诱导的骨髓来源的单核细胞向大脑的募集促进了焦虑样行为。神经科学杂志 33（34）：13820-13833。

Yoshida, K.、Drew, MR、Kono, A.、Mimura, M.、Takata, N. 和 Tanaka, KF (2021)。慢性社交失败压力通过雄性小鼠腹侧海马活动的失调损害目标导向行为。 神经精神药理学46（9）：1606-1616。