材料和试剂

1. 针（针工业）

2. 载玻片（Blue Star，1 毫米和 0.1 毫米厚）

3. 锥形烧瓶和试管（塔森）

4. 96孔板（Falcon，目录号：353072）

5. 微型离心管和 Falcons (Eppendorf)

6. 封口膜 (Bemis Parafilm M)

7. 感受态大肠杆菌菌株 (DH5-α) (Nishimura et al ., 1990)

8. LB肉汤（Him edia ，目录号：M1245）

9. 氯霉素（Sigma，目录号：C0378）

10. GeneJET Plasmid Miniprep Kit（Thermo Scientific ，目录号：K0502）

11. 限制酶（NEB，目录号：R0195S [EcoR1]；R0146S [Xho1]）

12. 苯酚：氯仿：异戊醇（Sigma ，目录号： P2069 ）

13. 乙醇，ACS 级（Merck，目录号：1.00983.0511）

14. 糖原（ Invitrogen ，目录号：R0551）

15. Roche DIG RNA 标记试剂盒（SP6/T7）（ Roche ，目录号： 11175025910 ）

16. 8 M LiCl（Sigma ，目录号： L7026 ）

17. 抗地高辛-POD缀合物（ Roche ，目录号：11207733910 ）

18. tRNA，来自 BAKER'S YEAST（ Sigma ，目录号：10109495001 ）

19. DTT（ Sigma ，目录号：43816 ）

20. RNase 抑制剂（Roche，与 DIG RNA 标记试剂盒一起获得）

21. 16％甲醛（W / V）不含甲醇（Invitrogen ，目录号：28908 ）

22. 牛血清白蛋白（BSA ）（ Sigma ，目录号：A9418 ）

23. Vecta 防护罩（Vector Labs，目录号：H1000）

24. 焦碳酸二乙酯/DEPC（ Sigma ，目录号：D5758）

25. 津津乐道克隆（DGRC，克隆 id：GH01881）

26. 酪胺信号放大（TSA）试剂盒（Thermo Fisher，目录号： B40957）

27. 鲑鱼精子DNA（Sigma，目录号：D7656）

28. Tween-20（Sigma，目录号：P-7949）

29. 抗 GFP（兔多克隆）（Cell Signaling Technologies，目录号：2555）

30. 超纯水（Millipore Elix）

31. 带正电荷的尼龙膜（GE Healthcare，目录号：RPN119B）

32. 50 × Denhardt 溶液（Invitrogen，目录号：750018）

33. NBT（氯化硝基蓝四唑）和 BCIP（5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸对甲苯胺盐）溶液（Sigma，目录号：11681451001）

34. 20 × SSC缓冲液（Sigma，目录号：SRE0068）

35. 1 × PBS （见配方）

36. 杂交缓冲液（HB）（见配方s ）

37. 洗涤缓冲液（参见配方s ）

38. 检测缓冲液（见配方s ）

39. 中 A（见配方s ）

40. 中 B（见配方s ）

41. 苍蝇食物（见食谱）

设备

1. 加热块（Eppendorf，ThermoStat Plus）

2. 培养箱摇床 (New Brunswick Innova 42)

3. 离心机（ Eppendorf，型号：5424R）

4. 层流罩

5. UVP HL-2000 HybriLinker（UV交联剂）

6. 微密封（Bio-Rad，目录号：MSB1001）

7. 37 °C培养箱，带振动平台

8. pH计（万通pH lab-827）

9. 显微镜（蔡司Stemi 2000-C）

10. 型腔块

11. Nanodrop (Thermo Scientific, NanoDrop ONE ^C)

12. 共聚焦显微镜（蔡司 LSM-900）

13. 刷子（新奇 Taklon 131）

14. 解剖针架（Himedia，目录号：LA040）

软件

1. 斐济（斐济只是 ImageJ，版本 2.0.0-rc-49/1.51d）， RRID:SCR_002285

2. Photoshop CC 2019， RRID：SCR_014199

程序

A. 感受态细胞制备

1. 一夜之间培养细菌培养物。

2. 在 50 mL 的培养基 A 中接种 500 μL 的培养物（参见食谱）。

3. 将培养物培养至 0.6 OD ₆₀₀。

4. 将培养物在冰上保持 10 分钟。

5. ×离心细胞 g 10 分钟在 4 ℃。

6. 丢弃上清液并将颗粒重新悬浮在500 μL 的培养基 A 中。

7. 添加 2.5 mL 的培养基 B（参见食谱）并在微量离心管中制作 100 μL 等分试样，然后立即用液氮快速冷冻细胞。储存在-80 °C。

B. DGRC 克隆的扩增（ https://dgrc.bio.indiana.edu/clones/Catalog ）

1. 克隆可以从果蝇基因组学资源中心 (DGRC) 以 FTA 光盘格式获得。

2. 将圆盘转移到100 μL 的高压灭菌蒸馏水中，并在 25 °C下孵育60 分钟。这会将克隆 DNA 注入水中。

3. 将 20 μL 的 DNA 溶液添加到新制备的化学感受态 DH5-α 中（将尖端正确浸入感受态细胞中并通过敲击确保正确混合，不要涡旋）。

4. 在冰上孵育混合物 30 分钟，并将加热块预设在 42 °C。

5. 将管子转移到设置在 42 °C的加热块上并孵育 1 分钟。立即将管转移回冰上。

6. 在 DNA 感受态细胞混合物中加入 9 卷 LB 肉汤，在 37 °C下孵育60 分钟，以 180 rpm 的速度摇动。

7. 以 10,000 ×离心细胞 g 1 分钟，然后将颗粒重新悬浮在 100 μL 的 LB 肉汤中。

8. 使用克隆结构中指定的适当抗生素将重新悬浮的混合物传播到 LB 琼脂板上。在孵化器中在 37 °C 下孵育板 12-16 小时。

注意：对于在“氨苄青霉素”等抑菌抗生素中生长的菌落，过度培养会产生卫星菌落。

9. 通过划线进入第二个抗生素板来收获菌落。

C. 质粒分离

1. 将含有 DGRC 克隆的 DH5-α 初级接种物放入含有 LB 肉汤和适当抗生素的 5 mL 试管中，并在 37 °C的培养箱摇床中孵育过夜，旋转速度为 180 rpm。

2. 在含有 30 mL LB 肉汤和适当抗生素的 100 mL 锥形瓶中加入 10 μL 这种过夜培养物。将细胞培养至 0.6 OD ₆₀₀并将培养物转移到冰上以减缓培养物的生长。

3. 以 10,000 ×离心培养物 g 10 分钟 4 °C以获得颗粒。

4. 以下程序使用 GeneJET Plasmid Miniprep Kit 进行，并进行了一些修改。

5. 将高压灭菌的 I 型水保持在 65 °C的加热块中。

6. 将上述步骤中获得的细菌沉淀彻底排干 LB 肉汤并重悬于 500 试剂盒中的μL “重悬缓冲液”，根据制造商的方案包含 RNase。该颗粒分为两个 1.5 mL MCT，每个包含250 μL重悬的细菌颗粒。

7. 将 250 μL 的“裂解缓冲液”加入每个试管中并通过敲击和倒置试管数次彻底混合。（不要涡旋）

8. 然后加入 350 μL 的“中和缓冲液”，颠倒试管数次，充分混匀。

9. ×离心混合物 g在室温 (RT) 下 10 分钟。将上清液转移到试剂盒提供的柱子中。

10. ×离心柱 g在室温下 1 分钟。丢弃离心后的流通。

11. 向柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液并以 12,000 ×离心 g在室温下 1 分钟。离心后丢弃流出液。

12. 以 12,000 ×再次干转色谱柱 g 1 分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。

13. 将色谱柱转移到新的 1.5 mL 管中，将 50 μL保持在 65 °C的高压灭菌超纯水加入色谱柱中心，并以 15,000 ×旋转 g两分钟。

14. 现在可以使用 Nanodrop 分光光度计对获得的质粒进行定量。

注意：到目前为止获得的 DNA 可用于在体外转录 (IVT) 之前进行限制性消化。然而，如果它直接进行 IVT，那么 DNA 的质量对于 IVT 来说是次优的，并且反应可能不会适当地发生。

D. DGRC克隆的限制性消化

克隆需要消化离子以避免转录物延伸到载体序列中，这样只有感兴趣的基因才会被转化为探针 RNA。

1. 取 5 μg质粒 DNA 并使用适当的限制酶进行限制性消化（表 1）。

表 1 。扩增克隆的限制性消化。

2. 在 37 °C 下孵育混合物至少 4 小时。

3. 如图 1 所示，使用特定酶执行两次消化，以生成所需的 DNA 片段以进行体外转录。

4. Xho1 消化：将产生与感兴趣基因的 mRNA 相似的 RNA，称为“有义探针”（这将用作对照探针）。

5. EcoRV 消化：将产生称为“反义探针”的反义 mRNA（这将与用作实验探针的 mRNA 互补）（图 1）。

6. 完全消化后，对消化的 DNA 产物进行苯酚：氯仿异戊基纯化，以便在体外转录过程中获得更好的产量。

图 1. DGRC 克隆的限制性消化。

A.从 DGRC 获得的克隆的描述。 B.从克隆构建体获得两种消化模式： ( i ) 用“EcoRV”消化后，产生一个 4.1 kb 片段，可用于从 SP6 启动子位点制备反义探针。 ( ii ) “Xho1”消化将产生一个 3.5 kb 的 DNA 条带，然后可用于从 T7 启动子位点制作有义探针。

E. 苯酚氯仿异戊基的纯化

1. 使用高压灭菌的超纯水将消化体积稀释至 100 μL。

2. 向溶液中加入 100 μL 的 25:24:1 苯酚：氯仿：异戊醇，并通过颠倒试管数次充分混合。

3. ×离心溶液 g 10 分钟。

4. 溶液将分为两相：上相是含有 DNA 的水相，下相是含有蛋白质的有机相。

5. 小心地将上层水相吸到新管中，加入 0.5 μL 糖原。

6. 在溶液中加入两卷无水乙醇，在-20 °C下孵育混合物2 小时。

7. ×离心溶液 g 10 分钟并倒出上清液。

8. 用 70% 乙醇清洗沉淀：向沉淀中加入 100 μL 70% 乙醇并轻轻旋转。

9. 再次以 7,500 ×离心 g 10 分钟。重复洗涤步骤以去除 DNA 中的残留盐。

10. 离心后，倒出上清液，然后将沉淀风干至半透明。

11. 将颗粒重新悬浮在约 50 μL 的高压灭菌超纯水中。

12. 执行 Nanodrop 分光光度分析以快速定量 DNA，和/或检查凝胶中纯化的 DNA 产物，以进行定性和定量分析。

F. 体外转录（Roche-DIG 标记试剂盒）

1. 准备 DIG 标记的 RNA 探针

a. 取1 µg消化和纯化的 DNA（用于有义和反义探针），并从罗氏 DIG 标记试剂盒中提供的试剂中设置以下反应（表 2）。

表 2. DIG 标记反应。

b. 在 37 °C 下孵育混合物 2-4 小时（如果正确合成 RNA 探针，溶液的粘度将急剧增加）。

c. 孵育后，在每个混合物中加入 2 μL 无 RNase 的 DNase，孵育 30 分钟。

d. °C 下孵育 5 分钟以灭活 DNase ，然后立即将其冷却至 4 °C 。

注意：此步骤将使 DNase 失活，并有助于线性化 RNA 探针链。

注意：在此之后，对 DIG 标记的 RNA 进行基于 LiCl 的沉淀，以获得纯化的探针并去除蛋白质以及未消化和消化的 DNA。

2. 使用 LiCl 沉淀 RNA 探针

a. 通过添加超纯水将合成探针的体积补至 50 μL。

b. 添加 0.5 体积的 7.5 M LiCl (25 μL) 并在 -20 °C下孵育2-4 小时。

RNA 探针的最终产量不足，请添加糖原。

c. ×旋转溶液 g在 4 °C下 20 分钟。弃去上清液。

d. ×离心 g 15 分钟。

e. 风干颗粒并将颗粒重新悬浮在约 30 μL 的超纯水中。

f. 检查凝胶中的探针并执行基于 NBT/BCIP 的斑点印迹以分析探针上 DIG 标记的效率（图 2）。

图 2 。探针效率的估计。

斑点印迹显示 DIG 标记在试剂盒提供的对照探针上的效率，较低的印迹（连续稀释）显示 DIG 标记在合成的 SP6 和 T7 探针中的效率。通过将探针的点强度与已知浓度的对照点的强度进行比较来进行定量。

G. 基于 NBT/BCIP 的斑点印迹

1. 将尼龙膜切割成所需尺寸。

2. 在膜上发现连续稀释的 RNA 探针（对照和实验）。

3. 将膜在 1,500 μ J/cm ^{2的紫外交联剂中孵育}10 分钟，使探针与膜交联。

4. 中将膜在 55 °C 下干燥10 分钟。

注意：确保使用封口膜将膜粘在培养皿的壁上。

5. × SSC（参见配方）清洗膜10 分钟。

6. 加入 1 × Denhardt 溶液（封闭溶液）并孵育 30 min-1 h。

7. 加入在封闭溶液中制备的抗 DIGOXIGENIN-AP 偶联物（一抗）并孵育 1-2 小时。

8. 去除一抗（可重复使用）并使用洗涤缓冲液洗涤两次，每次 15 分钟（参见配方）。

9. 使用检测缓冲液平衡膜 2 分钟（参见配方）。

10. 添加在检测缓冲液中制备的 NBT/BCIP 溶液，在 37 °C 的湿室中孵育膜，并检查颜色形成。（NBT 和 BCIP 与碱性磷酸酶反应时会产生强烈的不溶性黑紫色沉淀，碱性磷酸酶是抗体探针常用的酶结合物。）

11. 在凝胶/印迹成像平台 (UVP Gel-Doc) 中可视化印迹图像。

12. 通过将合成探针的几种稀释液的点强度与 DIG 标记试剂盒提供的已知浓度的探针的对照点的强度进行比较来评估探针效率。

注意：第10步对光敏感，应在黑暗中进行。

H. FISH – 由Toledano等人修改。 (2012)

1. 样品制备和免疫荧光

a. 在开始协议之前，用 DEPC 处理所有材料，包括磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，以避免任何 RNase 污染。

b. 收集三龄 (L3) 游走幼虫，并在含有 1× PBS 的空腔块中清洗它们。正确清洗它们以去除任何食物颗粒。

c. 解剖幼虫并将其转移到含有 1× PBS 的空腔块中。该块应保持在冰上（图 3，另请参阅视频1）。

d. 用 4% 甲醛固定剂在 RT 中固定 30 分钟，轻轻摇晃。不要过度固定样本，因为过度固定通常会导致低信号。

e. mL中洗涤三次，每次 5 分钟 0.1% PBTween-20 与 tRNA (250 μ g/ mL )混合（铅酸）轻轻摇晃。

f. 在 PBTH 中制备的 5% BSA 中阻断 30 分钟。

g. 尽可能多地去除最后一次洗涤，但不要让纸巾完全干燥。在与 RNase 抑制剂 (1:200) 和 DTT (1 mM) (PBTHR) 混合的 PBTH 中制备推荐浓度的一抗。

h. 在 4°C 下用一抗孵育组织至少 16 小时。

：还原剂 DTT 和 RNase 抑制剂酶对于灭活抗体溶液中常见的 RNase 是必不可少的。

图 3. 解剖设置。

视频 1. 幼虫解剖。

2. 原位杂交

a. 取出空腔块，用 PBTH 清洗组织三次，每次 5 分钟。

b. 在 PBTHR 中用荧光标记的二抗孵育样品 4 小时（光敏感）。

c. 用 PBTH 清洗组织三次，每次 5 分钟，轻轻摇晃。

d. 去除最后一次洗涤并使用 10% 甲醛（在 1 × PBS 中）在摇床上在室温下固定样品 30-35 分钟。

注意：第二次固定是为了交联和防止一抗和二抗复合物变性。

e. 在 PBTH 中清洗组织三次，每次 5 分钟。

HB ) 加热至 65°C 。保持组织室湿润，以防止腔块中的溶液蒸发。

i. 在 65°C 的杂交室中用预热的 HB 孵育组织 10 分钟。

ii. 将杂交缓冲液与 5% BSA 混合制成封闭液。

注意：确保 BSA 完全溶解。

iii. 去除 HB 并在 65°C 中用封闭溶液封闭 1 小时。

iv. 在完成上述孵育之前，准备 RNA 探针混合物。

v. 要制备 RNA 探针混合物，请将 DIG 标记的探针添加到封闭溶液中，并使溶液的最终浓度达到 ±2 μ g/ mL 。将混合物加热至 80°C 10 分钟，短暂旋转，然后冷却至 ~65°C。

注意：加热是必不可少的，因为它可以防止形成二级结构。

vi. 将 RNA 探针混合物添加到 96 孔板中，并将样品转移到孔中。

vii. 使用微密封密封 96 孔板。将板放在湿气室中。将组织在 65°C 下孵育至少 18 小时。

viii. 制备三种 PBT 稀释液 HB (vol/vol) 如下：1:4（溶液 A ）、1:1（溶液 B ）和 4:1（溶液 C ）（每个样品两次洗涤）。在 65°C 下预热溶液。

ix. 从板中取出组织并将它们转移到含有溶液 A 的空腔块中。快速冲洗一次，然后在 65°C 下用相同的方法清洗组织两次，每次 20 分钟。

x. 除去溶液 A，用溶液 B 冲洗一次，然后在 65°C 下洗涤两次，每次 20 分钟。

xi. 除去溶液 B，在溶液 C 中快速冲洗一次，然后在 65°C 下洗涤两次，每次 20 分钟。

xii. 取出溶液 C 的最后一次洗涤，并将组织带回 RT。使用 PBT 清洗组织，每次 15 分钟两次，轻轻摇晃。

xiii. 用 10% 正常山羊血清（ NGS，随 TSA 试剂盒提供）在 RT 处制备 PBT 缓冲液 30 分钟，将组织封闭。

xiv. 取出块缓冲液，将样品与在块 (1:500) 中制备的 DIG-POD 特异性抗体在 4°C 下孵育过夜。

3. 信号检测（TSA 放大）

一旦过氧化物酶 (POD) 标记的抗体与探针结合，我们使用基于酪胺的信号强度放大，其中使用标记有酪胺（无活性）的荧光团。在存在 H ₂O _{2的情况下，抗体中的过氧化物酶活性会}激活这种无活性的酪胺，它会将自身附着在抗体的蛋白质酪氨酸侧链上，从而放大信号。基于 TSA 的扩增变得必要，因为与正常 FISH 相比，它提供了更高的灵敏度和高特异性，这提供了低到中等的信号强度，并且对于检测低表达转录物也是低效的。

a. 使用 PBT 清洗样品两次，每次 10 分钟。

b. 用 PBS 冲洗样品。在此期间，准备 TSA 标签解决方案。

c. ₂O的储备溶液中新鲜制备 H ₂O ₂溶液（工作浓度）。

d. 使用提供的组件和套件中提到的组件准备标签组合，并将其保存在 RT（表 3）。

表 3. TSA标记混合物（ 200 μL）。

e. 取出 PBS，将标记溶液添加到组织中，并在 RT 中保持 8-10 分钟。确保样品完全浸入溶液中。在此期间，从储备溶液中制备终止试剂。

注意：孵育时间必须根据获得的信号进行标准化。

f. 添加停止试剂并将样品在 RT 中保存 30 秒- 1 分钟。

注意：此步骤的持续时间必须根据获得的信号进行标准化。

g. 从组织中取出溶液，用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟，在摇床上在 RT 上。

h. 将样品安装在 Vectashield 中并在显微镜下观察（图4 ）。

：安装样品时应格外小心，因为淋巴腺会因原位处理而变得脆弱。如果第一次使用 RNA 探针，请仅安装少量样品并使用显微镜检查背景。如果荧光背景太高而无法观察到特定信号，请在 65°C 下在 PBT 中洗涤 10 分钟，然后在室温下在 PBT 中再洗涤 5 分钟，然后将组织安装在 Vectashield 中。

图 4. RNA 转录本在组织中的表达。

A.描绘不同细胞类型的淋巴腺图像。 B. IF-FISH 显示 RNA 转录物（特异于Relish基因）在生态位内的表达，其被生态位特异性一抗（绿色）阳性标记。乙'。使用火工具 (ImageJ) 进行强度分析，显示淋巴腺细胞中的Relish转录物富集。 C. _唾液腺在细胞核中表现出强烈的Relish转录物表达（阳性对照）。 D. Sense 探针显示唾液腺中的非特异性背景表达（阴性对照）。白点标记了淋巴腺、生态位和唾液腺的边界。比例尺：20 μ m。

4. 成像

a. 始终与实验组织一起保留阳性和阴性对照（感应探针）。

b. 将幻灯片放在 4 °C 安装后的幻灯片盒中。

c. 建议在同一天完成样品载玻片的成像，以获得最大信号强度以进行无误差量化。

d. 图像分析是使用斐济完成的。荧光强度可以通过使用 ImageJ 中的火工具（图像 > 查找表 > 火）定性表示，该工具可以区分图像中的高强度和低强度区域。出于定量目的，为了比较对照和实验图像，我们遵循了https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html中提到的步骤 HYPERLINK "https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html" 。在 GraphPad Prism 中绘制小生境细胞（绿色）中 RNA 探针表达（红色）的平均荧光强度进行统计分析。

注意：确保从平均强度中减去背景强度（细胞旁边没有荧光的区域），以获得可以进一步绘制的绝对值。

食谱

1. 杂交缓冲液 (HB) (15 mL )

去离子甲酰胺， 7.5 mL

20 × SSC ， 3.75毫升

10% Tween-20, 0.15毫升

鲑鱼精子 DNA (10 mg/ mL )，0.15 mL（用作强封闭试剂）

使用 HCl 将 pH 值调节至 5.0，并使用 DEPC 处理的 H ₂O将体积补至 15 mL 。

2. 1 × PBS（1 升）

氯化钠，8 克

氯化钾，0.2 克

Na ₂HPO ₄, 1.44 克

KH ₂PO ₄, 0.24 克

使用 DEPC 处理的 dH ₂O 制备 PBS。

使用前将pH调节至7.2并高压灭菌。

3. 洗涤缓冲液

0.1 M Tris-HCl，pH 9.5 (20°C)

0.1 M 氯化钠

0.05 M MgCl ₂

4. 检测缓冲液

0.1 M Tris-HCl，pH 9.5 (20°C)

0.1 M 氯化钠

5. 培养基 A（50 毫升）

10% 葡萄糖，1 毫升

0.5 M MgSO ₄, 1 mL

LB 培养基，48 毫升

6. 培养基 B (5 毫升)

87% 甘油，2 毫升

聚乙二醇 (PEG)，0.6 克

0.5 M MgSO ₄, 0.12 mL

LB 培养基，2.6 毫升

使用前对介质进行过滤消毒。

7. 苍蝇食品（1升）

致谢

本文的工作得到了威康信托 DBT 印度联盟 (IA/S/17/503100) 对 LM 的支持。该协议已被证明可用于在 eLife (DOI: 10.7554/eLife.67158)上发表的果蝇第三龄幼虫(Ramesh等人, 2021)淋巴腺干细胞生态位中的 mRNA 和蛋白质的双重标记。图 1 是在 Biorender ( https://app.biorender.com/ ) 的帮助下生成的。

竞争利益

作者声明没有竞争利益。

参考

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2. Banerjee, U., Girard, JR, Goins, LM 和 Spratford, CM (2019)。果蝇作为遗传造血模型。 遗传学211（2）：367-417。

3. Evans, CJ, Hartenstein, V. 和 Banerjee, U. (2003)。比血液厚：果蝇和脊椎动物造血的保守机制。开发单元5(5)：673-690。

4. Jung, SH, Evans, CJ, Uemura, C. 和 Banerjee, U. (2005)。果蝇淋巴腺作为造血的发育模型。发展132（11）：2521-2533。

5. Krzemień , J.、Dubois, L.、Makki, R.、Meister, M.、Vincent, A. 和 Crozatier, M. (2007)。后信号中心对果蝇幼虫血细胞稳态的控制。自然446（7133）：325-328。

6. Lanot, R.、Zachary, D.、Holder, F. 和 Meister, M. (2001)。果蝇的胚后造血。 开发生物学230（2）：243-257。

7. Mandal, L.、Banerjee, U. 和 Hartenstein, V. (2004)。果蝇成血成血管细胞的证据以及果蝇淋巴腺造血与哺乳动物主动脉-性腺-中肾中胚层的相似性。 Nat Genet 36（9）：1019-1023。

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11. Ramesh, P.、Dey, NS、Kanwal, A.、Mandal, S. 和 Mandal, L. (2021)。津津乐道在调节果蝇血祖细胞发育和感染过程中的生态位中发挥着动态作用。生命 10：e67158 。

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