材料和试剂

1. 无菌牙签

2. 培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：P5606-400EA）

3. 玻璃烧杯（Sigma-Aldrich，目录号：BR90648）

4. Nalgene ^TM聚碳酸酯 Fernbach 培养瓶（Thermo Scientific ^TM，目录号：4105-2800）

5. 分光光度计比色皿（Merck，目录号：C5291）

6. Nalgene ^®500 mL 离心瓶，宽口，带 3141 型密封盖（Sigma-Aldrich，目录号：Z353744-4EA）

7. 聚碳酸酯管，50 mL，29 × 102 mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：03268）

8. 3.5 mL的石英吸收比色皿（Merck，目录号：Z803669）

9. Hamilton注射器（Hamilton，Gastight注射器，目录号： 1702N）

10. 圆点尖软画笔 8 至 12 号（DUGATO-亚马逊）

11. 蒸馏水

12. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S5016）

13. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）

14. 山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）

15. 选择酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：y1625）

16. 细菌蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：PO556）

17. 琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）

18. 哈茨木霉的裂解酶（Sigma-Aldrich，目录号：L1412）

19. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）

20. （NH ₄） ₂SO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：A4915）

21. KH ₂PO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：PO662）

22. HCl （Sigma-Aldrich，目录号：H1758）

23. NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：795429）

24. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）

25. 氰化钾（KCN）（Sigma-Aldrich，目录号：60178）

26. Trizma ^®底座（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）

27. 乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）

28. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）

29. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：PMSF-RO）

30. 完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（Roche，目录号：04906837001）

31. 羰基氰化物4-（三氟甲氧基苯基）苯腙（FCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2920）

32. HEPES（4-（2-羟乙基）-1哌嗪乙磺酸）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）

33. 番红（Sigma-Aldrich，目录号：S2255）

34. NADH（Sigma-Aldrich，目录号：N8129）

35. 琥珀酸二钠六水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S2378）

36. N,N,N',N'-四甲基-对苯二胺（TMPD）（Sigma-Aldrich，目录号：T7394）

37. L-抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：A7631）

38. 解决方案 A（见配方）

39. 解决方案 B（见配方）

40. 解决方案 C（见配方）

41. PMSF（见食谱）

42. 解决方案 D（见配方）

43. 解决方案 E （见配方）

44. YPD 培养基（见食谱）

45. 解决方案 F （见配方）

46. FCCP 解决方案（见配方）

47. 番红溶液（见配方）

48. 琥珀酸盐溶液（见食谱）

设备

1. 特氟龙搅拌棒（Fisherbrand ^TM，目录号：14-513-85）

2. Glass/Teflon Potter Elvehjem 均质器（Thomas ^®，目录号：C917）

3. 紫外可见分光光度计（ Thermo Scientific ^TM，GENESYS 20 ）

4. DW-2a-TM 紫外/可见分光光度计（Aminco ^TM，由 OLIS, Inc. 现代化）

5. 水浴（PolyScience、恒温、基本控制器）

6. 电钻（Black+Decker）

7. Thermo Scientific 转子 A27-8 × 50

8. Thermo Scientific 转子 Fiberlite ^TMF12-6 × 500 LEX

9. Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000离心机（Thermo Fisher Scientific）

10. 高速冷冻微量离心机（SCILOGEX，型号：D3024R-SCILOGEX）

11. 磁力搅拌器（Thermolyne Cimarec 1）

12. 涡流混合器（Thermo Scientific ，型号：M16710-33Q）

13. 可变自耦变压器（Staco Energy Products Co. 型号 3PN10108，输入 120V 50/60 Hz，输出 0-140V，AMP 1.4 KVA）

14. 用于液体培养中酵母生长的恒温摇床（SEVMEXICO，PRENDO-INO 650V-7）

15. 生物氧监测仪，配备 Clark 型极谱电极 (COLE-PARMER ^®, YSI5300A-1)

16. 超低温冰箱（Revco ^TM，型号：ULT1340-3-A36）

17. Beckman Phi 32 pH 计

程序

A. 原生质体制备

1. 琼脂（酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖；参见配方 7）上从 25% 甘油原液（保持在 -70 °C ）中划线U. maydis菌株，在 28°C 下孵育 1-2 天，然后将盘子存放在 4 °C 。

2. 用无菌牙签选择一个菌落。

3. 在 100 mL YPD 培养基中以 28°C 和 180 rpm 的速度培养细胞 18-24 小时。

4. 在 1 L 的 YPD 液体培养基中接种细胞（初始光密度为 600 nm = 0.04 = 9 × 10 ^{5 个}细胞/ mL），并在 28 °C /180 rpm下孵育 24 小时。孵育时间和培养基应根据您的具体需求进行调整。

5. 使用预先称重的 500 mL 离心瓶收集细胞。 3,800 ×离心 5 分钟在 Fiberlite ^TMF1 2-6 × 500 LEX中， g和 4 °C 。去除上清液，将细胞悬浮在蒸馏水中，然后重复离心步骤。倒出上清液。

6. 测量颗粒的湿重，每克湿重加入 12.5 mL 溶液 A。使用玻璃或聚四氟乙烯棒悬浮细胞。在这个阶段，细胞可以涡旋以分散细胞聚集体。将细胞悬浮液转移到玻璃烧杯中。每克湿重添加 0.016 克T. harzianum裂解酶。用聚四氟乙烯或玻璃棒轻轻混合，并在 30 °C的水浴中孵育 30-60 分钟。

7. 要检查原生质体的形成，每 10 分钟摇动一次细胞悬液，取出 20 μL 的悬液，并与 980 μL 的蒸馏水混合。测量 600 nm 的光密度（图 1A）。由于渗透压休克，没有细胞壁的细胞破裂，它们的内容物被释放到培养基中。这导致悬浮液的光密度降低。当光密度达到其最小值时，原生质体的形成就完成了。

注意：从这一步开始，所有程序都应在 4 °C 下进行。

8. ×离心悬浮液 g在 4 °C下 5 分钟以回收原生质体。倒出上清液。

9. 每克初始湿重加入 12.5 mL 冷溶液 B，以清洗裂解酶。用铁氟龙或玻璃棒小心地悬挂原生质体。不要使用涡流来分散原生质体。然后，将悬浮液以 3,800 ×离心 10 分钟 g和 4 °C 。新颗粒应该是紧凑的。

B. 线粒体分离

1. 将原生质体颗粒转移到聚四氟乙烯杵均质器中，加入含有蛋白酶抑制剂和 PMSF（1 mM 最终浓度）的完整混合物的冷溶液 C（40 mL/25-30 g 的细胞初始湿重）。

2. 将铁氟龙杵连接到电钻上。将钻头连接到可变自耦变压器（变阻器），选择 40 的输出强度，并均匀化 20 个周期。避免形成泡沫和气泡。

3. 匀浆后，用冷溶液 C（含蛋白酶抑制剂）定容至 130 mL，将悬浮液转移到 50 mL 聚碳酸酯管中，通过 3,800 ×离心去除细胞碎片和细胞核 g和 4 °C 10 分钟。

4. 从聚碳酸酯管中回收上清液并以 17,000 ×离心 g和 4 °C 10 分钟。小心倒出上清液。然后，将缓冲液留在试管中，并在软画笔（8 号或 12 号，根据生物量）的帮助下，悬浮线粒体颗粒。将线粒体保持在 4 °C进行当天实验，或保持在 -70 °C以供以后使用。

5. 使用 Lowry 方法确定样品中的蛋白质浓度（Lowry等人，1951 年）。制备 1 mg/mL BSA 的储备溶液，并构建 5 至 100 μg 蛋白质范围内的标准曲线。使用 0.4% 脱氧胆酸钠溶液将样品稀释 10 倍，并使用 5-10 µl 稀释后的样品进行蛋白质测定。

C. 耗氧量

要测量带磁力搅拌的恒温室中分离线粒体的呼吸活动，请使用与 YSI5300A 生物氧监测仪耦合的克拉克型氧电极。

1. 将恒温室、溶液 D 和 E 以及蒸馏水加热至 30 °C 。

2. 将 1.135 mL 的蒸馏水、65 μL 的溶液 D（最终浓度 50 mM）和 100 μL 的溶液 E（最终浓度 20 mM）倒入腔室中，并进行磁力搅拌。将信号调整为 100%，这对应于溶解氧。

3. 添加 5-10 μL 的分离线粒体；等到信号稳定，然后通过添加 10 mM 琥珀酸盐（13 µL 来自 1 M 原液）或 0.15 mM NADH（9.8 µl 来自 20 mM 原液）来刺激氧气消耗。

4. 要抑制呼吸复合物 IV，请添加 0.5 mM KCN（从 0.25 M 原液中提取 2.6 µL）或 2 µM 没食子酸正辛酯（从 2 mM 原液中添加 1.3 µL）以抑制替代氧化酶

5. 在添加新介质之前，用蒸馏水清洗腔室。

6. 通过将耗氧斜率除以蛋白质量 (mg) 或干重 (g) 来计算比活性。

D. 线粒体膜电位测定

1. 打开 Olis Modernized Aminco ^TMDW-2 分光光度计，让灯预热 30 分钟。选择双光束选项，将单色仪 1 (MONO1) 的波长调整为 511 nm，将 MONO2 的波长调整为 533 nm。在双光束模式下，样品被两种不同的波长照射，一种对应于参考波长，另一种对应于测量波长。输出对应于 511 nm 吸光度减去 533 nm 吸光度的电子减法。

2. 将 2.7 mL 溶液 F 转移到含有磁力搅拌器的 3.7 ml 玻璃试管中。开始磁力搅拌。加入 2 μM 番红（从 1 mM 库存溶液中加入 5.4 μL），然后加入线粒体样品（0.5-1.0 mg 蛋白质）。将比色皿放入分光光度计并关闭盖子。

3. 调整基线并通过腔室盖上的小孔添加您感兴趣的底物（例如，10 mM 琥珀酸盐，或 0.15 mM NADH），使用 Hamilton 注射器。

4. 要破坏由琥珀酸盐或任何其他呼吸底物产生的膜电位，请添加 2-10 μ M FCCP。

数据分析

1. 原生质体形成

_{nm )}处的光密度降低。如图 1A 所示，在裂解酶存在下孵育 60 分钟后，细胞向原生质体的转化完成。此外，图 1B 表明原生质体的形成与细胞絮凝有关。接下来，测定呼吸活动和膜电位的产生以评估线粒体的质量。

图1。 黑粉虱原生质体的形成。

在与裂解酶一起孵育期间，由于酵母细胞壁的损失， OD _{600nm会降低。}(A) 在孵化的前 30 分钟内，50% 的细胞转化为原生质体。 (B) 由于细胞壁的退化，细胞开始形成团块。

2. 线粒体呼吸活动

U. maydis线粒体含有四种经典的呼吸复合物 (I-IV)、一种 3-磷酸甘油脱氢酶、一种抗氰化物替代氧化酶 (AOX) 以及外部和内部 2 型 NADH 脱氢酶（Matuz-Mares等人，2018 年；Reyes-Galindo等人，2019 年）。为了确定复合物 I (CI) 的活性，添加了丙酮酸-苹果酸 (Pyr-Mal)；对于复合物 II (CII)，使用琥珀酸盐；并使用 TMPD-抗坏血酸复合物 IV (CIV)。可以通过添加鱼藤酮 (CI)、抗霉素 A (CIII) 或氰化物 (CIV) 来抑制不同复合物的活性(Juárez et al ., 2004) 。

中添加琥珀酸或 NADH 会刺激耗氧量（图 2）。 NADH 的呼吸活性高于琥珀酸，表明外部 NADH 脱氢酶比琥珀酸脱氢酶更活跃。由于 AOX 的存在，氰化物对呼吸的抑制作用并不完全。然而，在存在琥珀酸盐的情况下，AOX 会出现时间依赖性失活（Sierra-Campos等人，2009），这可能是由于在这种条件下某些配合物产生的 H ₂O _2增加。最近报道了 H ₂O ₂对 AOX 的抑制作用（Yamasaki等人，2021）。

图 2。 U. maydis线粒体的耗氧量。

细胞在 YPD 液体培养基中于 28 °C生长 24 小时并通过离心收集。然后按照协议中的描述分离线粒体。添加 A) 琥珀酸盐 (10 mM) 或 B) NADH (0.15 mM) 可刺激耗氧量，而 KCN (1 mM) 或没食子酸正辛酯 (2 µM) 可抑制呼吸活动。

3. 线粒体膜电位

线粒体膜电位 ( ΔΨ ) 是呼吸复合物 I、III 和 IV 产生的质子动力的主要成分（Figueira等，2012）。阳离子亲脂染料番红已被用于测量线粒体中的膜电位。通过添加呼吸底物产生膜电位后，线粒体基质内会积累番红，这会导致染料堆积和光谱偏移（Akerman 和 Wikström，1976）。 511-533 nm 吸光度差异的增加与膜电位的产生有关，而由质子载体羰基氰对三氟甲氧基苯腙 (FCCP) 引起的这种差异的减少与 ΔΨ 的耗散有关。

玉米原生质体获得的线粒体中不同呼吸底物产生的 ΔΨ 。复合物 I (Pyr-Mal)、复合物 II (琥珀酸盐) 或外部 NADH 脱氢酶水平的电子入口诱导快速形成 ΔΨ，这与番红信号的增加有关 (图 3)。在所有情况下，膜电位都被解耦器 FCCP 破坏（图 3）。定性地，膜电位与三种底物相同。

图 3。 线粒体通电引起的番红光谱变化。

(A) 10 mM 琥珀酸 (Succ)、(B) 5 mM 丙酮酸-苹果酸或 (C) 250 µM NADH，线粒体被激活。然后用 10 μM FCCP 消除电位。该系统包含：300 mM 山梨糖醇、10 mM Hepes pH 7.0、0.33 EGTA、0.5 mg（蛋白质）线粒体、0.2% BSA 和2 μM 番红。

笔记

1. 我们建议在水浴中孵育细胞以形成原生质体。

2. 为了获得高质量的线粒体制剂，我们建议从至少 20 g 湿重的细胞开始，并在原生质体形成后将温度保持在 4 °C 。

3. 我们建议使用新鲜的线粒体制剂进行耗氧实验。

4. 为了抑制丝氨酸蛋白酶，应在使用前制备 PMSF。切勿使用储存的 PMSF。

食谱

1. 解决方案 A

(NH ₄) ₂SO ₄0.6 M (79.26 g/L)

KH ₂PO ₄20 毫米 (2.72 克/升)

2. 解决方案 B

蔗糖 0.8 M (273.84 g/L)

Trizma 碱-HCl (pH 7.0) 10 mM (1.21 g/L)

EDTA 2 毫米 (0.74 克/升)

KH ₂PO ₄20 毫米 (2.72 克/升)

BSA 0.3% (3.0 克/升)

在室温下将 pH 值调节至 7.0。

3. 解决方案 C

蔗糖 0.4 M (137 g/L)

Trizma 碱-HCl (pH 7.0) 10 mM (1.21 g/L)

EDTA 2 毫米 (0.74 克/升)

KH ₂PO ₄20 毫米 (2.72 克/升)

BSA 0.3% (3.0 克/升)

在室温下将 pH 值调节至 7.0。

4. PMSF

PMSF 1 M（0.0871 g/0.5 mL DMSO）

5. 解决方案 D

葡萄糖 1 M (1.80 g/10 mL)

6. 解决方案 E

Tris-HCl (pH 7.0) 250 mM (1.51 g/50 mL)

7. YPD培养基

葡萄糖 0.5% (5 g/L)

选择酵母提取物 0.5% (5 g/L)

细菌蛋白胨 0.25% (2.5 g/L)

120 °C灭菌15 分钟。

对于固体 YPD，添加 2% 琼脂 (20 g/L)。

8. 解决方案 F

山梨糖醇 300 毫米 (54.65 克/升)

Hepes 20 毫米，pH 7.0 (4.76 g/L)

EGTA 0.33 毫米 (125.51 毫克/升)

BSA 0.2% (2克/升)

9. FCCP 解决方案

FCCP 1 毫米 (1.27 毫克/5 毫升)

10. 番红溶液

番红 1 毫米 (3.51 毫克/10 毫升)

11. 琥珀酸盐溶液

琥珀酸盐 1 M (1.3507 g/5 mL)

12. NADH溶液

NADH 20 毫米（0.07094 克/5 毫升）

13. KCN解决方案

氯化钾（0.0815 克/5 毫升）

14. 没食子酸正辛酯溶液

n 没食子酸辛酯 (0.0028 g/5 mL)

致谢

作者感谢墨西哥国立自治大学-研究和技术创新项目支持计划 (PAPIIT IV200519和 IA200321) 和国家科学技术委员会 (CONACYT-254904)。此外，我们感谢 Oscar Iván Luqueño Bocardo 在数据编制方面的协助，以及 Mercedes Esparza Perusquía 的技术协助。

利益争夺

作者声明没有与这项工作相关的竞争利益。

参考

1. Akerman, KE 和 Wikstrom, MK (1976)。番红作为线粒体膜电位的探针。 FEBS Lett 68（2）：191-197。

2. Brefort, T.、Doehlemann, G.、Mendoza-Mendoza, A.、Reissmann, S.、Djamei, A. 和 Kahmann, R. (2009)。黑粉菌作为病原体。 Annu Rev Phytopathol 47：423-445。

3. Figueira, TR, Melo, DR, Vercesi, AE 和 Castilho, RF (2012)。番红作为荧光探针，用于评估分离的细胞器和透化细胞中的线粒体膜电位。 方法 Mol Biol 810：103-117。

4. Juárez, O.、Guerra, G.、Martínez, F. 和 Pardo, JP（2004 年）。黑粉虱的线粒体呼吸链。 Biochim Biophys Acta 1658（3）：244-251。

5. 俄亥俄州洛瑞、新泽西州罗斯伯勒、阿拉巴马州法尔和 RJ 兰德尔 (1951)。使用 Folin 苯酚试剂测量蛋白质。生物化学杂志 193（1）：265-275 。

6. Matuz-Mares, D., Matus-Ortega, G., Cárdenas-Monroy, C., Romero-Aguilar, L., Villalobos-Rocha, JC, Vázquez-Meza, H., Guerra-Sánchez, G., Peña- Díaz, A. 和 Pardo, JP (2018)。替代 NADH 脱氢酶 (NDH-2) 在植物病原真菌Ustilago maydis中的表达。 FEBS 公开生物8（8）：1267-1279。

7. Reyes-Galindo, M.、Suarez, R.、Esparza-Perusquía, M.、de Lira-Sánchez, J.、Pardo, JP、Martínez, F. 和 Flores-Herrera, O.（2019 年）。线粒体呼吸小体作为一个单元起作用，复合物 I、III _{2和 IV}之间的串扰刺激 NADH 脱氢酶活性。 Biochim Biophys Acta Bioenerg 1860（8）：618-627。

8. Sierra-Campos, E.、Velázquez, I.、Matuz-Mares, D.、Villavicencio-Queijeiro, A. 和 Pardo, JP (2009)。黑粉虱在氧化应激条件下的功能特性。 线粒体9（2）：96-102。

9. Sousa, JS, D'Imprima, E. 和 Vonck, J. (2018)。线粒体呼吸链复合物。亚细胞生物化学87：167-227。

10. Yamasaki, S., Shoji, M., Kayanuma, M., Sladek, V., Inaoka, DK, Matsuo, Y., Shiba, T., Young, L., Moore, AL, Kita, K., et al . （2021 年）。锥虫交替氧化酶的非血红素二铁中心的弱 O ₂结合和强 H ₂O _2结合。 Biochim Biophys Acta Bioenerg 1862(4): 148356。