材料和试剂

1. 100毫米培养皿（ HiMedia，目录号： PW1305-1x100NO ）

2. 50 mL 烧杯 ( Borosil )

3. 200 mL 锥形瓶 (Borosil)

4. 2000 mL 培养瓶 (Borosil)

5. 50 mL 离心管 (Eppendorf)

6. 15 mL 离心管 (Eppendorf)

7. 1.5 mL 馏分管 (Eppendorf)

8. 0.5 mL 馏分管 (Eppendorf)

9. SnakeSkin ^TM透析管10000 MWCO（ThermoFisher，目录号： 68100）

10. 0.2 µm 注射器过滤器（Whatman ^TM，目录号：9914-2502）

11. 0.2 µm 滤膜（Millipore，目录号：GVWP04700）

12. Whatman滤纸（1号）（过滤实验室，目录号： T-06648-13）

13. 溶原肉汤（LB）（HiMedia，目录号：M1245-1KG ）

14. Luria-Bertani（LB）琼脂（HiMedia，目录号： M1151-1KG ）

15. 氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9518-25G）

16. 阿拉伯糖（SRL，目录号：52392）

17. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号： S9888-1KG）

18. 三（羟甲基）氨基甲烷（ Tris-Base）（Sigma-Aldrich，目录号： 252859-500G)

19. 用于分子生物学的盐酸（HCl）（Qualigen，目录号：Q29505）

20. 咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399-500G）

21. 氯化镁（MgCl ₂）（Sigma-Aldrich，目录号： M8266-100G)

22. 3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基铵]-1-丙磺酸盐（CHAPS）（Sigma-Aldrich，目录号：226947-5G）

23. 用于分子生物学的甘油（Sigma-Aldrich，目录号：356352-1L-M）

24. 乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：ED-500G）

25. 1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号： 10708984001)

26. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898-1KG）

27. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-100G）

28. 过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号： A3678-25G)

29. 四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281-25ML）

30. 丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A8887-500G）

31. 双丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：146072-500G）

32. Bio-Rad Precision Plus Protein ^TM标准品（Bio-Rad，目录号：1610374）

33. 2 × Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610737EDU）

34. 考马斯亮蓝（R-250）（Sigma-Aldrich，目录号：1125530025）

35. 用于分子生物学的乙醇

36. 用于分子生物学的冰醋酸（Qualigens，目录号：Q21055）

37. 液氮

38. 储备溶液（见配方）

20% (w/v) 阿拉伯糖

5 M 氯化钠

2 M Tris-HCl (pH = 8)

2M咪唑

4% (w/v) CHAPS

2 M 氯化镁₂

0.5 M EDTA (pH = 8)

1 M DTT

39. 用于纯化的缓冲液（参见配方）

裂解缓冲液

用于亲和 (Ni-NTA) 色谱的缓冲液（缓冲液 A 和缓冲液 B）

透析缓冲液（缓冲液 B ₀）

阴离子交换层析缓冲液（缓冲液 B ₅₀和缓冲液 B ₁₀₀₀）

尺寸排阻色谱缓冲液（缓冲液 B ₁₀₀）

40. SDS-PAGE （见配方）

10 ×库存的 TGS（Tris 碱基、甘氨酸和 SDS）运行缓冲液

考马斯染色溶液

考马斯脱色液

凝胶混合物所需的解决方案

10% 分离胶

5% 浓缩凝胶

设备

1. Thermoblock（Eppendorf ThermoMixer C，目录号：5382000015）

2. 摇床培养箱（ThermoScientific，型号：MXQ 6000）

3. Avanti J26S-XP 离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J26S-XP ，转子：JLA-9.1000）

4. Optima-L-100K 超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-100K ，转子：45 Ti 型）

5. GE AKTAprime plus FPLC 系统（ GMI，目录号： 8149-30-0004）

6. Bio-Rad NGC ^TM色谱系统（ Bio-Rad，目录号： 788001)

7. 真空过滤器组件（Millipore，型号：XX1014720）

8. Sonicator（Sonics-Vibra 细胞）（ Sonics，型号：VCX 130）

9. HisTrap ^TMHP 5 mL Ni-NTA 柱（GE，目录号：17524802）

10. MonoQ ^TM10/100 GL 色谱柱（GE，目录号：17516701）

11. Superloop ^TM（50 mL）（GE，目录号：18111382）

12. Superdex 200 ^TM16/600 pg 柱（GE，目录号：GE28-9893-35）

13. SDS-PAGE装置（Bio-Rad，目录号：1658001FC）

14. Vivaspin ^R10000 MWCO 离心浓缩器（Sartorius，目录号：Z614602-12EA）

软件

1. 微软Excel

2. GraphPad 棱镜

3. 图像J

程序

A. 细菌细胞转化

1. 在冰上解冻 BL21 (AI) 感受态细胞。

2. 在无菌条件下，将 100 ng 质粒加入 50 μL 感受态细胞中，并置于冰上 12-15 分钟。

3. 将细胞转移到 37 °C的热块（热休克）中 3 分钟，或在 42°C下 1.5 分钟。

4. 将细胞转移回冰上 2 分钟。

5. 中加入 100 μL 的 1 × LB，在 37 °C 下放置 10 分钟，并将所有细胞放在含有 0.1 mg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂板上。

6. 在 37 °C 下孵育板过夜。

B. 文化成长

1. 原代文化

将转化细胞的拭子（约 15-20 个菌落）接种到 40 mL 的 1 × LB 中，其中含有 0.1 mg/mL 氨苄青霉素，并在 37 °C的摇床培养箱（180 RPM）中生长 5-6 小时。

2. 二次培养

a. × LB 中接种 1% 的原代培养物，在摇床培养箱 (180 RPM) 中在 37 °C 下生长，并监测二次培养物的光密度 (OD)。

b. 一旦 OD 达到 0.4-0.5，将摇床培养箱 (180 RPM) 的温度更改为 16 °C。

c. 一旦 600 nm 的 OD 达到 0.6，用 0.2%（w/v）阿拉伯糖诱导培养，并在 16 °C 下过夜（12-14 小时）生长。

C. 细胞沉淀、裂解和裂解液澄清

1. 细胞造粒

a. 使用Avanti J26X-SP 离心机以 5180（~4,000-5,000 RPM）的 RCF 将细胞沉淀 20 分钟，将温度保持在 4 °C，然后丢弃上清液。

b. 颗粒储存在-80 °C ，或立即处理以进行裂解。

2. 细菌细胞裂解

a. 称量细胞沉淀并将其重新悬浮在裂解缓冲液中（要添加的裂解缓冲液的体积是细胞沉淀重量的 5 倍，即每 1 g细胞沉淀加入5 mL 裂解缓冲液）。

b. 使用设置为 60% 振幅、脉冲为 1 秒、恢复时间为 3 秒的超声波仪在冰上裂解细胞 3 分钟。发布此消息，让裂解液在冰上静置 5 分钟。然后，继续超声处理协议 2 分钟。

3. 裂解物澄清

a. Optima-L-100K 超速离心机以 100 , 000 ×离心裂解物50 分钟 g ，将温度保持在 4 °C。

b. 将裂解物转移到预冷管或锥形瓶中，以加载到 Ni-NTA 柱上。

D. Ni-NTA 柱色谱（在 4 °C 下进行，使用 GE AKTAprime plus FPLC 系统）

1. 用 3 柱体积 (CV) 的缓冲液 A平衡 GE HisTrap ^{TM HP 5 mL Ni-NTA 柱。}

2. 以缓慢的流速 ~ 1 mL/min 将上清液加载到柱子上。

3. 加载上清液后，用 20 CV 缓冲液 A 以 2 mL/min 的流速清洗色谱柱。

4. 使用缓冲液 B 的阶梯梯度（5%、10%、20%、30%、50% 和 100%）洗脱样品。缓冲液 B 的梯度由缓冲液 A 和缓冲液 B 混合而成。洗脱两份每个步骤各 5 mL。

5. 使用适当的蛋白质阶梯（ Bio-Rad Precision Plus Protein ^TM标准品）在 10% SDS-PAGE 凝胶上加载备用级分（图 2）。蛋白质通常以 5% 至 30% 的 Buffer B 梯度洗脱。随后，基于 SDS-PAGE 凝胶，将蛋白质最多的级分合并，通常是对应于 10%、20% 和 30% 的级分缓冲区 B (图 2)。

图2 。 Ni-NTA 色谱后的代表性 10% SDS-PAGE。

加载 10 μL 的样品（5 μL 的蛋白质组分与 5 μL 的2 × Laemmli 样品缓冲液）在 10% SDS-PAGE 凝胶上。将含有最多蛋白质的部分合并并透析。 SDS-PAGE 凝胶用Coomassie R-250 染色。

E. 透析（在 4 °C 下进行，使用 SnakeSkin ^TM透析管 10000 MWCO）

使用 10,000 MWCO 透析管对 2 L 缓冲液 B ₀进行 3 小时透析，以去除多余的盐和咪唑。

F. 阴离子交换色谱（在 4 °C 下进行，使用 Bio-Rad NGC ^TM色谱系统）

1. 用 3 CV 的缓冲液 B ₅₀平衡 GE MonoQ ^{TM 10/100 GL 色谱柱}。

2. 使用 50 mL GE Superloop ^TM，将透析后的样品加载到色谱柱上，并用 10 CV 的 Buffer B _{50清洗色谱柱}。

3. 20 CV的缓冲液 B ₁₀₀₀的线性梯度 (0-50%) 以 1 mL 级分洗脱样品。监测 280 nM (UV _{280 )}的吸光度和电导率测量。当电导率达到 ~ 38 mS/cm (图 3A) 时, 蛋白质开始洗脱。

4. 根据色谱仪，在 10% SDS-PAGE 凝胶上加载蛋白质峰的交替部分，并使用适当的蛋白质阶梯（ Bio-Rad Precision Plus Protein ^TM标准品）（图 3B）。一旦确认蛋白质的存在，将分数合并。

图3 。阴离子交换色谱后的代表性色谱图和 10% SDS-PAGE。

^TM10/100 GL 柱进行阴离子交换色谱后 SauUSI 的洗脱曲线。随着电导率接近~38 mS/cm ，蛋白质开始洗脱。 B.阴离子交换层析后的代表性 10% SDS-PAGE（用考马斯 R-250 染色）图像。 10 µL 样品（5 µL 蛋白质组分与 5 µL 2 × Laemmli 样品缓冲液）上样到凝胶上。使用 Vivaspin Turbo 10000 MWCO 离心浓缩器汇集和浓缩蛋白质最多的部分。

G. 合并馏分的浓缩（在 4 °C 下进行，使用 Vivaspin Turbo 10,000 MWCO 离心浓缩器）

1. ₁₀₀平衡离心浓缩器。

2. 将汇集的分数添加到浓缩器中，并以 3180（约 4,000-5,000 RPM）的 RCF 旋转，直到样品浓缩至约 600 μL，这大约需要 1 小时。

H. 尺寸排阻色谱（在 4 °C 下进行，使用 Bio-Rad NGC ^TM色谱系统）

1. ₁₀₀平衡 GE Superdex 200 ^TM16/600 pg 色谱柱。

2. 使用 1 mL 循环将浓缩蛋白加载到柱上。

3. ₁₀₀中以 1 mL 分数洗脱样品。此洗脱位置代表约 200 kDa 的分子量，这与 SauUSI 的二聚体状态（约 219 kDa）一致（图 4A）。

使用适当的蛋白质阶梯（ Bio-Rad Precision Plus 蛋白质^TM标准）将相关分数加载到 10% SDS-PAGE 凝胶上（图 4B）。一旦确认蛋白质的存在，将级分合并（因为样品在加载到 SDS-PAGE 之前已变性，蛋白质将以约 109 kDa 的单体分子量运行）。

图4 。尺寸排阻色谱后的代表性色谱图和 10% SDS-PAGE。

^TM16/600 GL 柱进行阴离子交换层析后 SauUSI 的洗脱曲线。蛋白质在 ~0.45 CV 开始洗脱。 B.尺寸排阻色谱后的代表性 10% SDS-PAGE（用考马斯 R-250 染色）图像。 10 µL 样品（5 µL 蛋白质组分与 5 µL 2 × Laemmli 样品缓冲液）上样到凝胶上。尺寸排阻色谱有助于根据分子量将感兴趣的蛋白质与其他污染蛋白质分离，最终使蛋白质纯度≥ 95% ，并在适当的缓冲液中洗脱蛋白质以进行进一步的实验。使用 Vivaspin Turbo 10,000 MWCO 离心浓缩器汇集和浓缩含有蛋白质的级分。

I. 合并馏分的浓缩（在 4 °C 下进行，使用 Vivaspin Turbo 10,000 MWCO 离心浓缩器）

1. ₁₀₀平衡离心浓缩器，将汇集的馏分添加到浓缩器中，并以3,180 RCF (~4,000-5,000 RPM) 旋转。

2. 将浓缩蛋白 (~10 mg/mL) 分成合适的等分试样 (~ 5 µL) ，在液氮中冷冻，并储存在 -80 °C。

J. 运行 10% SDS-PAGE（使用 Bio-Rad SDS-PAGE 仪器）

1. 将 5 µL 样品添加到 5 µL 的 2 × Laemmli 样品缓冲液，并在 99 °C 下加热10 分钟。

2. 将样品加载到浸入含有 1 × TGS 运行缓冲液的运行罐中的 10% SDS-PAGE 上。让凝胶在 200 V 的恒定电压下运行 45 分钟。

3. 运行后，让凝胶在考马斯 (R-250) 染色溶液中轻轻加热，使用商用微波炉直到溶液沸腾。

4. 使用商用微波炉对考马斯脱色溶液中的凝胶进行温和加热，直至溶液沸腾。

数据分析

上述纯化方案的原始研究论文发表在Tumuluri 等人。 (2021), https://doi.org/10.1093/nar/gkab042 。

食谱

A. 需要高压灭菌的材料

1. 50 mL 1 × Lysogeny 肉汤

在 200 mL 锥形瓶中使用高达 50 mL 的反渗透 (RO) 水溶解 1.25克LB 肉汤。用棉塞堵住嘴巴。

2. 1,000 mL 1 × Lysogeny 肉汤

在 2,000 mL 锥形瓶中使用高达 1、000 mL 的 RO 水溶解25 g LB 肉汤。用棉塞堵住嘴巴。 HiMedia LB（每升）的成分为 10 g NaCl、10 g 蛋白胨和 5 g 酵母提取物。

B. 库存解决方案

1. 20% (w/v) 阿拉伯糖

在高达 25 mL 的 RO 水中溶解 5 g阿拉伯糖。溶解后，使用无菌 0.2 μm 注射器过滤器将溶液过滤到无菌 50 mL 离心管中。

2. 5 M 氯化钠

将 146.1 g NaCl 溶解在高达 500 mL 的 RO 水中。

3. 2 M Tris-HCl (pH = 8)

将 121.14 克 Tris 碱溶解在 300 mL 的 RO 水中。使用浓 HCl 调节 pH 值。调整 pH 后使体积达到 500 mL。

4. 2M咪唑

将 68.07 g 咪唑溶解在 RO 水中并补足至 500 mL。

5. 4% (w/v) CHAPS

将 1 g CHAPS 溶解在 RO 水中并补足至 25 mL。

6. 2 M 氯化镁₂

将 1.90 g MgCl _2溶解在 RO 水中并补足至 10 mL。

7. 0.5 M EDTA (pH = 8)

在 RO 水中溶解 3.362 克 EDTA 二钠盐（使用 NaOH 颗粒调节 pH 值），补足 20 mL，并通过高压灭菌。

8. 1 M DTT

3.09克DTT 溶解在 0.01 M 醋酸钠（pH = 5.2）中并补足至 20 mL。使用 0.2 μm注射器过滤器过滤溶液。

C. 纯化缓冲液

注意：根据下面给出的成分制备缓冲液，并在使用前在 4 °C下预冷。

1. 裂解缓冲液 (500 mL)

50 mM Tris-HCl (pH = 8) (12.5 mL, 2 M)

500 毫米氯化钠（50 毫升，5 M）

25 mM 咪唑（6.25 mL，2 M）

5 mM MgCl ₂(1.25 mL, 2 M)

10% 甘油（50 毫升，100%）

0.2% CHAPS（25 毫升，4%）

使用连接到 0.2 μm 过滤器的真空过滤器组件，使 RO 水和过滤器的体积达到 500 mL。

2. 用于亲和 (Ni-NTA) 色谱的缓冲液（缓冲液 A 和缓冲液 B）（各 500 mL）

50 mM Tris-HCl (pH = 8)（缓冲液 A 12.5 mL，缓冲液 B 12.5 mL，2 M）

500 mM NaCl（缓冲液 A 50 mL、缓冲液 B 50 mL、5 M）

25 mM 咪唑（缓冲液 A 6.25 mL，2 M）

500 mM 咪唑（缓冲液 B 125 mL，2 M）

使用连接到 0.2 μm 过滤器的真空过滤器组件，使 RO 水和过滤器的体积达到 500 mL。使用相同的组件让缓冲器脱气 20 分钟。

3. 透析缓冲液 (Buffer B ₀) (2 L)

50 mM Tris-HCl (pH = 8) (50 mL, 2 M)

1 mM EDTA（4 毫升，0.5 M）

1 毫米 DTT（2 毫升，1 M）

4. 阴离子交换层析缓冲液（缓冲液 B ₅₀和缓冲液 B ₁₀₀₀）（各 500 mL）

50 mM Tris-HCl (pH = 8)（缓冲液 B ₅₀12.5 mL，缓冲液 B ₁₀₀₀12.5 mL，2 M）

50 mM NaCl（缓冲液 B ₅₀5 mL，5 M）

1000 mM NaCl（缓冲液 B ₁₀₀₀100 mL，5 M）

1 mM EDTA（缓冲液 B ₅₀1 mL，缓冲液 B ₁₀₀₀1 mL，0.5 M）

1 mM DTT（缓冲液 B ₅₀0.5 mL，缓冲液 B ₁₀₀₀0.5 mL，1 M）

使用连接到 0.2 μm 过滤器的真空过滤器组件，使 RO 水和过滤器的体积达到 500 mL。使用相同的组件让缓冲器脱气 20 分钟。

5. 体积排阻色谱缓冲液（缓冲液 B ₁₀₀）（500 mL）

50 mM Tris-HCl (pH = 8) (12.5 mL, 2 M)

100 毫米氯化钠（1 0 毫升，5 M）

1 毫米 DTT（0.5 毫升，1 M）

使用连接到 0.2 μm 过滤器的真空过滤器组件，使 RO 水和过滤器的体积达到 500 mL。使用相同的组件让缓冲器脱气 20 分钟。

D. SDS-PAGE

1. 10 ×库存的 TGS（Tris 碱基、甘氨酸和 SDS）运行缓冲液

将 30 克 Tris 碱、144 克甘氨酸和 10 克 SDS 溶解在 1 000 毫升的RO 水中。工作浓度：1 × 。

2. 考马斯染色溶液

将 2.5 克考马斯亮蓝 (R-250) 溶解在含有 500 毫升乙醇、100 毫升冰醋酸和 100 毫升 RO 水的溶液中。完全溶解后，通过 Whatman 滤纸（1 号）过滤溶液。

3. 考马斯脱色液

在 700 mL 的 RO 水中加入 200 mL 乙醇和 100 mL 冰醋酸。

4. 凝胶混合物所需的溶液

a. 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (AB) 混合物

将 58 克丙烯酰胺和 2 克双丙烯酰胺溶解在 200 毫升的 RO 水中。

b. 1.5 M Tris-HCl (pH = 8.8)

将 90.85 克 Tris 碱溶解在 300 mL 的 RO 水中。使用浓 HCl 调节 pH 值。调整 pH 后使体积达到 500 mL。

c. 1.5 M Tris-HCl (pH = 6.8)

将 90.85 克 Tris 碱溶解在 300 mL 的 RO 水中。使用浓 HCl 调节 pH 值。调整 pH 后使体积达到 500 mL。

d. 10% SDS

将 1 g SDS 溶解在高达10 mL 的 RO 水中。

e. 10% APS

将 1 g APS 溶解在高达10 mL 的 RO 水中。

5. 10% 分离胶

水 (RO) (4 毫升)

AB-混合（3.3 毫升，30%）

Tris-HCl (pH = 8.8) (2.5 mL, 1.5 M)

SDS（0.1 毫升，10%）

APS（0.1 毫升，10%）

TEMED (0.004 毫升)

6. 5% 浓缩凝胶

水 (RO) (1.4 毫升)

AB-混合（0.33 毫升，30%）

Tris-HCl (pH = 6.8) (0.25 mL, 1.5 M)

SDS（0.02 毫升，10%）

APS（0.02 毫升，10%）

TEMED (0.002 毫升)

致谢

我们感谢 Vrunda Rajgor、Shuang Yong Xu 和 Om Prakash Chouhan 对 SauUSI 研究的贡献。最后，我们感谢 IISER Pune 提供进行实验的基础设施。资金：VST 承认 IISER Pune 的研究生奖学金； KS 承认生物技术部 (DBT) 获得了 S. Ramachandran 国家生物科学奖。 SauUSI 的生化和结构特征发表在Tumuluri 等人。 (2021), https://doi.org/10.1093/nar/gkab042

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

1. Corvaglia, AR、François, P.、Hernandez, D.、Perron, K.、Linder, P. 和 Schrenzel, J. (2010)。 III 型限制性内切酶在临床金黄色葡萄球菌菌株中是水平基因转移的主要障碍。 Proc Natl Acad Sci USA 107(26): 11954-11958。

2. Kunzelmann, S. 和 Webb, MR (2009)。一种具有高时间分辨率的用于荧光测定 ADP 的生物传感器。生物化学杂志 284（48）：33130-33138 。

3. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA, Wilson, GG 和 Murray, NE (2014)。 DNA 切割器的亮点：限制性内切酶的简史。 核酸研究42（1）：3-19。

4. Monk, IR, Shah, IM, Xu, M., Tan, MW 和 Foster, TJ (2012)。转化不可转化：应用直接转化来操纵遗传葡萄球菌 金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。 mBio 3(2)： e00277-11。

5. Tumuluri, VS, Rajgor, V., Xu, SY, Chouhan, OP 和 Saikrishnan, K. (2021)。核酸内切酶 SauUSI 切割 DNA 的机制：金黄色葡萄球菌水平基因转移和抗生素耐药性的主要障碍。 核酸研究49（4）：2161-2178。

6. van den Ent, F. 和 Löwe, J. (2006)。 RF 克隆：一种将目标基因插入质粒的无限制方法。 J Biochem Biophys Methods 67（1）：67-74。

7. Xu, SY, Corvaglia, AR, Chan, SH, Zheng, Y. 和 Linder, P. (2011)。来自金黄色葡萄球菌亚种的 IV 型修饰依赖性限制酶 SauUSI 。金黄色葡萄球菌USA300。 核酸研究39(13)：5597-5610。