材料和试剂

1. 12 孔细胞培养板（Corning，12-565-321）

2. 0.22 μm 无菌过滤器

3. 9B 前脂肪细胞：这些细胞是从Dicer ^lox/lox的肩胛间棕色脂肪中分离出来的；aP2-Cre-ERT2小鼠并使用 SV-40-大 T 抗原永生化，如前所述（Mori等人，2012 和 2014）。除非在培养基中加入 4-羟基三苯氧胺，否则它们的行为就像野生型细胞

4. 9W 前脂肪细胞：这些细胞是从用于分离 9B 细胞的同一只小鼠的皮下白色脂肪中分离出来的。这些细胞使用 SV-40-大 T 抗原永生化，除非在培养基中添加 4-羟基三苯氧胺，否则它们的行为也与野生型细胞相似

5. 20 nM 胰岛素*（Sigma-Aldrich，目录号：I6634，粉末储存温度 -20°C。稀释后储存在 4°C）

6. 1 nM 三碘甲状腺原氨酸（T3）*（Sigma-Aldrich，目录号：T2877，储存温度-20°C）

7. 0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）*（Sigma-Aldrich，目录号：I5879，储存温度-20°C）

8. 1 μM地塞米松*（Sigma-Aldrich，目录号：D4902，储存温度-20°C）

9. 0.125 mM 吲哚美辛*（Sigma-Aldrich，目录号：I7378，储存温度-20°C）

10. 2.8 μM 罗格列酮*（Sigma-Aldrich，目录号：R2408，储存温度-20°C）

11. 胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12657-029，储存温度-20°C）

12. 青霉素-链霉素（Pen/Strep）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122，储存温度-20°C）

13. Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），高葡萄糖（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11965，储存温度 4°C）

14. 1 mM 胰岛素原液（见配方）

15. 10 μM T3 库存溶液（参见配方）

16. 0.25 M IBMX 原液（见配方）

17. 1 mM 地塞米松原液（见配方）

18. 0.125 M 吲哚美辛原液（见配方）

19. 2.8 mM 罗格列酮原液（见配方）

20. 维护介质（见配方）

21. 分化培养基第2天（见食谱）

22. 分化培养基第 4 天（见食谱）

23. 分化培养基第 6 天（见食谱）

*最终浓度

设备

1. 加热块

2. 组织培养箱（37°C，5% CO ₂，Sheldon Manufacturing, Inc.）

3. 水浴（Fisher Scientific，FS-205）

软件

1. 的GraphPad Prism 9 ^®软件

程序

注意：在操作前将培养基（参见食谱）预热至 37°C 10 分钟。

A. 种子细胞

1. 在 12 孔板中每孔接种 1 × 10 ⁵前脂肪细胞，并在 1 ml“维持培养基”中培养（参见食谱：B1 用于促褐变诱导，或 C1 用于促白）。

2. 每 2 天更换一次培养基，直到 90% 汇合。

B. 脂肪细胞分化

第 0 天：一旦细胞达到 90% 汇合，更换培养基并用“维护培养基”培养 2 天。

第 2 天：用 1 毫升“第 2 天分化培养基”更换培养基（参见食谱：B2 促进褐变，或 C2 促进美白）并培养 2 天。

第 4 天：取出培养基并替换为 1 毫升“第 4 天分化培养基”（参见食谱：B3 促进褐变，或 C3 促进美白）。

第 6 天：2 天后，用 1 毫升“第 6 天分化培养基”更换培养基（参见食谱：B4 用于促进褐变，或 C4 用于促进美白）。

第 8 天：细胞完全分化并可以使用。

数据分析

验证

在这里，我们描述了一种从小鼠前脂肪细胞体外诱导脂肪细胞分化的方法。我们描述了两种类型的分化方案：一种诱导棕色/米色脂肪形成谱（“Pro-Browning Cocktail Recipe”），另一种导致白色脂肪细胞分化（“Pro-Whitening Cocktail Recipe”）。除了此处描述的细胞外，我们还在广泛的鼠前脂肪细胞系中应用了这些协议，包括 3T3-F442A、C3H10T1/2 等（数据未显示，Rocha等人，2020 年）。该方案导致 50-90% 的细胞在其细胞质中表现出脂滴，尽管分化细胞的比例和脂滴的大小在很大程度上取决于许多因素，包括 FBS 的数量、类型、传代，承诺和融合的前脂肪细胞。为了说明该协议的效率，我们使用了从同一只小鼠的皮下白色脂肪组织（9W 细胞）和棕色脂肪组织（9B 细胞）中分离出来的永生化前脂肪细胞，并使用 Pro-Browning Cocktail Recipe 或 Pro-Whitening Cocktail Recipe 对它们进行了分化. Pro-Browning Cocktail Recipe在两种细胞系中都诱导了Ucp1的表达，尽管 9B 细胞中的诱导水平高了几个数量级（图 1A）。此外，与 Pro-Whitening Cocktail Recipe 相比，它还进一步诱导了泛脂肪细胞标记物Cebpa （图 1B）、Pparg （图 1C）和aP2 （图 1D）。这些结果表明，不仅 9B 前脂肪细胞更致力于脂肪生成，而且 Pro-Browning Cocktail 比 Pro-Whitening Cocktail 更有效地诱导脂肪细胞分化。

使用此处描述的程序分化的脂肪细胞可用于几种不同的应用。在我们应用 Pro-Browning Cocktail 协议的原始研究论文中（Rocha等人，2020 年），我们使用分化的脂肪细胞进行了多项实验程序，包括基因表达分析、耗氧量测量以及共聚焦和荧光寿命成像显微镜。在使用 Pro-Browning Cocktail 方案分化的 9W 细胞中观察到棕色/米色脂肪细胞样特征。这些特征包括产热基因谱的表达、线粒体含量增加、多房脂质积累、高非耦合呼吸的耗氧率升高以及 NADH 和 FAD 寿命缩短。有关数据处理和分析的所有数据和信息，包括重复的统计数据和详细信息，都包含在原始研究论文中（Rocha等，2020）。

图 1. 使用小鼠永生化白色 (9W) 或棕色 (9B) 前脂肪细胞诱导脂肪细胞分化的促褐变 (B) 和促增白 (W) 鸡尾酒之间的比较。

使用促白化（9W + W 和 9B + W）或促褐化（9W + B 和 9B + B）鸡尾酒分化白色 (9W) 和棕色 (9B) 前脂肪细胞。(A) Ucp1 、(B) Cebpa、(C) aP2和(D) Pparg mRNA 的表达通过实时 qPCR 评估（每组n = 3 个独立的细胞池）。36B4 mRNA 表达用于标准化。值是平均值 ± SEM。* P < 0.05 与增白鸡尾酒 (W)（使用 Tukey 多重比较测试的单向方差分析）相比。可根据要求提供引物序列。

统计分析

结果表示为平均值±平均值的标准误差（SEM），并通过单向方差分析和 Tukey 多重比较检验进行统计分析，在 Graphpad Prism 7 ^®软件中采用P < 0.05的最小显着性极限。

食谱

A. 库存溶液的制备

1. 1 mM 胰岛素原液在 1 ml 蒸馏水中（加入 0.5 µl HCl 16 N 以获得更好的溶解度）。通过 0.22 μm 无菌过滤器过滤库存溶液。

2. 10 μM T3 乙醇储备液

3. 0.5 M KOH 中的 0.25 M IBMX 储备溶液。通过 0.22 μm 无菌过滤器过滤库存溶液

4. 1 mM 地塞米松乙醇储备液

5. 0.125 M 吲哚美辛乙醇原液

6. 2.8 mM 罗格列酮乙醇原液

笔记：

a. 库存可在 -20°C 下储存数月，但胰岛素除外，需要在 4 ℃.

b. 为了帮助溶解，可以使用加热块将 (3) 和 (5) 加热到 75°C 1 分钟。

B. Pro-Browning 鸡尾酒配方

1. 维护介质

补充有 10% FBS 和 1% Pen/Strep 的 DMEM 高葡萄糖

2. 分化培养基第 2 天

DMEM 高葡萄糖补充有 20 nM 胰岛素、1 μM 地塞米松、0.5 mM IBMX、1 nM T3、0.125 mM 吲哚美辛和 2.8 μM 罗格列酮。

3. 分化培养基第 4 天

补充有 20 nM 胰岛素、1 nM T3 和 2.8 μM 罗格列酮的 DMEM 高葡萄糖。

4. 分化培养基第 6 天

补充有 20 nM 胰岛素和 2.8 μM 罗格列酮的 DMEM 高葡萄糖。

C. 美白鸡尾酒配方

1. 维护介质

补充有 10% FBS 和 1% Pen/Strep 的 DMEM 高葡萄糖。

2. 分化培养基第 2 天

补充有 20 nM 胰岛素、1 μM 地塞米松和 0.5 mM IBMX 的 DMEM 高葡萄糖。

3. 分化培养基第 4 天

DMEM 高葡萄糖补充 20 nM 胰岛素。

4. 分化培养基第 6 天

DMEM 高葡萄糖补充 20 nM 胰岛素。

致谢

我们得到了 FAPESP（2017/01184-9、2016/12294-7、2012 /07259-7和2015/03292-8 ）、CNPq（474397/2011-4 和 305069-201）和 305069-201 (1431744/2014-2016)。该协议已被描述并与 Rocha等人相关联。（2020 年；DOI：10.1126/sciadv.abc6250）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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