材料和试剂

笔记：

a. 丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有高度的神经毒性。苯酚、月桂基肌氨酸钠、SDS、过硫酸铵、TEMED、溴酚蓝、β-巯基乙醇和冰醋酸对眼睛、皮肤或呼吸道有刺激性。避免眼睛/皮肤接触和吸入。在穿戴个人防护装备的同时处理这些化合物。

b. 乙醇、冰醋酸和 TEMED 是高度易燃的。苯酚可燃。在化学通风橱中使用这些化学品。

1. 微量离心管（1.5-2-ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：50-751-5024 或 07-200-210）

2. 锥形离心管（15 毫升或 50 毫升）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-959-49B，06-443-21）

3. 超离心管（开顶，薄壁，超透明）和适配器（直径 16 毫米）（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC9570324，NC1532017）

4. 玻璃小瓶（1-fluid dram 或更小尺寸）（Thermo Fisher Scientific，DWK Life Sciences Wheaton ^TM，目录号：06-408B ）

5. 一毫升注射器（Thermo Fisher Scientific，Air-Tite ^TM，目录号：14-817-173）

6. 针（18、20 和 22 号）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-826-5G、14-826-5C、14-826-5A）

7. 塑料管（1/32" ID × 3/32" OD × 1/32" 壁；Thermo Fisher Scientific，目录号：14-387-347）

8. 酸洗玻璃板（18 cm × 16 cm；Thermo Fisher Scientific，Hoefer ^TM，目录号：03-500-204）

9. Columbia 肉汤（Thermo Fisher Scientific，BD Difco ^TM，目录号：DF0944-17-0），或任何适合待使用细菌生长的培养基

10. 哥伦比亚血琼脂，5% 羊，15 × 100 mm 平板（Hardy Diagnostics，目录号：A16），或任何适合待使用细菌生长的琼脂平板

11. 高档蒸馏水，例如来自Milli-Q Integral 净水系统

12. HPLC 级水（VWR，目录号：87003-652）

13. 氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，JT Baker ^TM，目录号：02-004-045）

14. 磷酸二氢钠（NaH ₂PO ₄）（Sigma-Aldrich，目录号：S3139-250G）

15. 七水磷酸氢二钠（Na ₂HPO ₄·7H ₂O）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S373-500）

16. 氯化镁（MgCl ₂）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266-100G）

17. Trizma ^®碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503-1KG）

18. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-250G）

19. 液体苯酚（90％）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A931I-4）

20. 乙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP2818500）

21. 蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Pierce ^TM，目录号：PIA32955）

22. DNase I（10,000-25,000 单位/mg）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18-047-019）

23. RNase A（≥5000 U/mg 蛋白质）（Thermo Fisher Scientific，目录号：FEREN0531）

24. 月桂基肌氨酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：L5777-100G）

25. BCA（二辛可宁酸）蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Pierce ^TM，目录号：PI23227）

26. 丙烯酰胺（VWR，目录号：VWRV0341-500G）

27. N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（VWR，目录号：VWRV0172-100G）

28. 尿素（VWR 化学品 BDH，目录号：BDH4602-500G）

29. 四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281-25ML）

30. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-1KG）

31. 甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7403-1KG）

32. 过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678-25G）

33. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）

34. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516-500ML）

35. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148-100ML）

36. 溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B8026-5G）

37. 4-12% Bis-Tris 凝胶（Thermo Fisher Scientific，目录号：NP0336BOX）

38. 蛋白质染色溶液（Thermo Fisher Scientific，PageBlue ^TM，目录号：PI24620）

39. 冰醋酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：A38-212）

40. 高碘酸（Sigma-Aldrich，目录号：P0430-25G）

41. 硝酸银（Sigma-Aldrich，目录号：209139）

42. 二水氯化钙（CaCl ₂·2H ₂O）（Thermo Fisher Scientific，目录号：C79-500）

43. 氢氧化铵溶液（NH ₄OH）（Sigma-Aldrich，目录号：338818-100ML）

44. 氢氧化钠（NaOH）（Thermo Fisher Scientific，目录号：S318-1）

45. 柠檬酸一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C1909-500G）

46. 福尔马林（37% 甲醛）（Sigma-Aldrich，目录号：252549）

47. 磷酸盐缓冲盐水（PBS，见配方）

48. 5 M NaCl（见配方）

49. 2 M MgCl ₂（见配方）

50. Tris 缓冲液（见配方）

51. HEPES 缓冲液（见配方）

52. 丙烯酰胺 (30%) 库存（见配方）

53. 9 M尿素溶液（见配方）

54. SDS 溶液（10%，见配方）

55. 10×Tris/甘氨酸运行缓冲液（见配方）

56. 1 × SDS Tris/甘氨酸运行缓冲液（见配方）

57. 5% 过硫酸铵溶液（见配方）

58. 2×增溶缓冲液（见配方）

59. 固定剂（见配方）

60. 氧化溶液（见配方）

61. 硝酸银溶液（20%，见配方）

62. 银染试剂（见配方）

63. 开发人员解决方案（见食谱）

设备

1. Milli-Q Integral水净化系统（MilliporeSigma，目录号：ZIQ7010T0）

2. 色度计 CO7000（VWR，目录号：WAPR80-3000-42）

3. 培养箱摇床（Thermo Fisher Scientific，Hoefer ^TM，目录号：SHKE5000 S）

4. 轨道/摇摆摇床（Thermo Fisher Scientific，目录号：11-676-681）

5. 具有磁力搅拌能力的热板（Thermo Fisher Scientific，目录号：SP88850200）

6. Sonicator（Qsonica，目录号：Q500-110）

7. 通风柜（Labconco，目录号：100600040）

8. 用于处理 0.5-50-ml 耐苯酚离心管或瓶的离心机和转子[例如，Beckman Avanti JE 离心机（Beckman Coulter，目录号：A20699）与 JA-20（Beckman Coulter，目录号：334831）和 JLA- 10.500 个转子（Beckman Coulter，目录号：369681）；Sorvall Legend XTR 离心机（Thermo Scientific，目录号：75210061），带有 TX-750 转子（Thermo Scientific，目录号：75003180），F13-14x50cy 转子（Thermo Scientific，目录号：75003661），圆桶（Thermo Scientific，目录号）：75003608）和锥形适配器（Thermo Scientific，目录号：75003639）]

9. 带有温度控制系统的微量离心机（Eppendorf，目录号：5401000137）

10. 超速离心机和转子（例如，带有 70.1 型 Ti 转子的 Optima XE-90，Beckman Coulter，目录号：A94471, 342184）

Beckman Avanti JE 离心机的瓶子（250 毫升）和适配器（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC9304619 和 NC1476800）
Nephelo 培养瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：50-194-5583（用于 300-ml）和 50-194-5576（用于 500-ml））
带侧臂的过滤瓶（真空瓶）（Thermo Fisher Scientific，KIMAX ^TM，目录号：10-181B）
Erlenmeyer Flasks （Thermo Fisher Scientific，PYREX ^TM，目录号：10-090C）
微型搅拌棒（1/16 × 5/16 英寸）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-512-150）

16. 垫片（0.75 毫米厚，16 厘米长，2 厘米宽；Thermo Fisher Scientific，Hoefer ^TM，目录号：03-500-209 ）

17. 凝胶浇铸台（Thermo Fisher Scientific，Hoefer ^TM，目录号：03-500-247）

18. 凝胶浇铸框架（Thermo Fisher Scientific，Hoefer ^TM，目录号：03-500-241）

19. 凝胶梳（15 孔，0.75 毫米厚；Thermo Fisher Scientific，Hoefer ^TM，目录号：03-500-188）

20. 聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳系统（对于 LOS/LPS：Hoefer，Hoefer ^TMSE 600，目录号：SE600-15-1.5）（对于 PEOM：Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：EI0002）

21. 能够承受 5 mA 负载并以 1 mA 步进可调的电源（Bio-Rad，PowerPac ^TM，目录号：1645056）

22. 酸洗玻璃盘或托盘（20.1 × 20.1 × 5.5 cm；Thermo Fisher Scientific，目录号：15-242B）

23. 凝胶成像系统（Bio-Rad，ChemiDoc ^TM，目录号：17001402）

程序

A. 细菌培养

注意：培养程序应针对研究中使用的细菌进行优化。LPS 和 PEOM 提取的最终生长期应根据研究目的确定。一般来说，生长到至少对数中期的细菌更适合用于 LPS 和 PEOM 的提取。

1. 通过将从琼脂平板中新鲜分离的细菌接种到用于 LPS 提取的Nephelo 培养瓶中的5 ml 合适肉汤或用于提取 PEOM 的 25 ml 肉汤中，制备 OD ₆₀₀为 0.8的起始培养物。

2. 将发酵剂按 1:20 稀释到 5 ml 或 200 ml 新鲜肉汤中，分别用于 LPS 提取或 PEOM 提取。

3. 在 37°C 下以 180 rpm 的速度在孵化摇床中孵育 3 至 4 小时，或直至细菌达到对数中期（对于Histophilus somni和一些巴斯德氏菌科细菌，大约为 10 ⁹CFU/ml ）。

4. 将 2 ml 培养物转移到微量离心管中，然后进入 B 部分进行 LPS 提取，或利用 200 ml 培养物进行 PEOM 提取（C 部分）。

B. 使用热酚水微萃取法萃取 LPS/LOS (Inzana, 1983)

1. 离心机2毫升在微量离心管以10,000rpm以上的细菌悬浮液×克为5分钟，在4℃。

2. 弃去上清液，用 1 ml PBS 洗涤沉淀一次。

3. 用 300 μl 蒸馏水重悬洗涤过的细胞，并将悬浮液转移到含有微型搅拌棒（1/16 × 5/16 英寸）的 1 液 dram 玻璃小瓶（或类似物）中。

4. 将等体积的 90% 苯酚（预热至 65-70°C 是优选的，但不是必需的）添加到细菌悬浮液中。

5. 将小瓶置于加热板/搅拌板上的烧杯中，温度设置为 65-70°C。水不应高于小瓶长度的一半，可以用橡皮筋将多个小瓶固定在一起以防止倾翻。

6. 在 65-70°C 下剧烈搅拌混合物 15 分钟。

7. 将小瓶中的混合物在冰上冷却至约 15°C，然后将混合物转移到 1.5 毫升的微量离心管中。

8. 在 15°C 下以 10,000 × g离心10 分钟。

9. 小心地将上清液转移到 15 ml 锥形离心管中，并将管子放在一边。

10. 将苯酚相转移回玻璃瓶中。

11. 加入 300 μl 水重新提取苯酚相并重复步骤 B5 至 B9。

12. 将水相汇集在 15 毫升锥形离心管中。

13. 通过添加十分之一体积的 5 M NaCl，将收集到的水相的钠浓度调整到 ~ 0.5 M。

14. 添加 5-10 体积的冷 (-20°C) 95% 乙醇以沉淀 LPS 并彻底混合溶液。

15. 将混合物在 -20°C 下保持至少 6 小时或过夜。

16. 将混合物在4°C 下以 2,000 × g离心10 分钟。

17. 用巴斯德吸管在真空下吸出乙醇，直到管子变干。将管子倾斜到颗粒朝上的一侧，这样您就不必将移液器吸头离颗粒太近。

18. 将不透明颗粒悬浮在 100 μl 蒸馏水中。

19. 将 100 μl 悬浮液转移到 1.5 ml 微量离心管中。

20. 重复步骤 B14 到 B18，用乙醇进行第二轮沉淀。

21. 用 50 μl 蒸馏水悬浮沉淀。

22. 将样品储存在 -20°C。样品可以等分保存以避免反复冻融。

C. 提取富含蛋白质的外膜 (PEOM)

注意：提取 PEOM 的所有步骤都应在 4°C 下使用蛋白酶抑制剂进行。

1. 将 250 毫升瓶中的 200 毫升细菌悬浮液在4°C 下以 10,000 × g离心15 分钟。

2. 洗在含有 2 mM MgCl ₂_的30 ml 0.05 M Tris 缓冲液（pH 7.8）中将沉淀两次（如果在这里停止，则在 -20°C 冷冻沉淀）。

3. 将沉淀重悬在 25 ml 10 mM HEPES 缓冲液中，pH 7.4，含有蛋白酶抑制剂（按照制造商的工作浓度说明），以及 DNase I 和 RNase A 各 20 μg/ml。

4. 将悬浮液在 50 毫升的冰烧杯中超声处理 12 次，每次 15 秒，每次爆发之间至少在冰上孵育一分钟（保持在 10°C 以下）。或者，通过法式压滤器两次可用于裂解细胞 (8,000 lbs/in ²)。

5. 将所得样品转移到 50 毫升锥形管中。

6. 以 12,000 × g离心5 分钟以去除未破碎的细胞。

7. 将上清液转移到超离心管中。

8. 将上清液以 255,000 × g离心60 分钟（这将产生包括 IM、肽聚糖和 OM 在内的总膜制备物）。

9. 将沉淀重悬在 1 ml 10 mM HEPES 缓冲液中。

10. 使用 18-G，然后是 20-G，然后是 22-G 针头，用 1 毫升注射器将颗粒悬浮液均匀化，直到完全重新悬浮。用管子覆盖每根针的末端将防止划伤管子（如图形摘要所示）。注意避免起泡。

11. 将 0.1 ml 悬浮液置于 1.5 ml 微量离心管中并在 -20°C 下冷冻（仅执行一次）。

12. 将剩余的均质悬浮液转移到超速离心管中（约 10 毫升大小）。

13. 用含有2% 月桂基肌氨酸钠的10 mM HEPES 缓冲液填充到管的顶部。密封管子并轻轻地来回倾斜以彻底混合。

14. 将管子在室温下保持 30 分钟，不要摇晃。

15. 以 255,000 × g离心60 分钟以获得 PEOM。

16. 去除上清液并用 1 ml 10 mM HEPES 缓冲液覆盖沉淀。

17. 重复步骤 C9 到 C14，但不要再次取出 0.1 毫升悬浮液。

18. 在大约 100-200 μl 的蒸馏水中重悬最终的沉淀。

19. 根据按照制造商说明进行的BCA 蛋白质测定结果，将步骤 C18 中的样品稀释至蛋白质浓度为 0.5-3 毫克/毫升。

20. 将样品分装并储存在 -20°C 以备将来使用。

D. LPS/LOS 的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)

注意：为了获得 LOS/LPS 的最佳分辨率，请在整个过程中使用高质量的试剂，并在需要时准备新鲜的试剂。

1. 14% 分离胶的制备（18 cm × 16 cm 凝胶 20 ml，间隔 0.75 mm）

a. 在真空瓶中混合 9.3 ml 30% 丙烯酰胺原液、6.4 ml 9 M 尿素、4 ml 1.88 M Tris 缓冲液（pH 8.8）和 0.2 ml 10% SDS，轻轻混合并脱气 10 分钟。

b. 添加 0.15 ml 过硫酸铵溶液 (5%) 和 5 μl TEMED。

c. 轻轻混合溶液，并立即使用注射器或移液器将玻璃板之间的分离凝胶溶液分配到板顶部下方 4 厘米处。

d. 用 0.1% SDS 将凝胶覆盖到几毫米的深度。

e. 让凝胶聚合至少 1 小时。

f. 聚合后用滤纸冲洗并吸干凝胶顶部。

2. 制备 3% 浓缩凝胶 A（10 ml 用于 18 × 16 cm 凝胶，0.75 mm 垫片）

a. 在真空瓶中混合 1 ml 30% 丙烯酰胺原液、1 ml 1.25 M Tris 缓冲液（pH 6.8）、0.1 ml 10% SDS 和 7.8 ml HPLC 级水，然后脱气 10 分钟。

b. 添加 0.1 ml 过硫酸铵溶液 (5%) 和 5 μl TEMED。

c. 轻轻混合溶液，并立即将浓缩凝胶溶液分配到玻璃板之间的孔梳底部。聚合后，孔梳齿的底部应刚好接触凝胶的顶部。

d. 允许堆积凝胶聚合约 2 小时。

3. 制备 3% 浓缩凝胶 B（10 ml 用于 18 × 16 cm 凝胶，0.75 mm 垫片）

a. 混合 1 ml 30% 丙烯酰胺原液、1 ml 10 × Tris/甘氨酸运行缓冲液（不含 SDS）、0.1 ml 10% SDS 和 7.8 ml HPLC 级水。

b. 将溶液放入真空瓶中并脱气 10 分钟。

c. 将选择的梳子插入玻璃板之间大约一半的位置。

d. 脱气后，向丙烯酰胺溶液中加入 0.1 ml 过硫酸铵溶液 (5%) 和 5 μl TEMED。

e. 轻轻混合溶液并立即在玻璃板之间分配浓缩凝胶溶液。

f. 完全插入时，梳子的齿应刚好接触到浓缩凝胶 A 的顶部。

g. 允许堆积凝胶聚合约 2 小时。

h. 可以取下梳子，在孔中填充 1× 电泳缓冲液，将凝胶包裹在保鲜膜中后在 4°C 下储存过夜。

i. 或者，只能使用浓缩胶 A，但条带的分辨率会降低。

4. LPS/LOS 样品的制备

a. 添加 1 - 10 µg（取决于条带数量）纯化的 LPS/LOS 样品或 5 µl 微提取物（如上制备），并用 HPLC 级水稀释至 10 µl。

注意：如果 LPS/LOS 凝胶过载或显影时间过长，条带将被遮住，并会形成污点。通常，每孔 10-12 μg LPS 或2-3 μg LOS 是理想的。如果 5 μl 提取的样品过多或过少，应调整每个样品的体积以进行第二次凝胶运行。通过添加 5% 的醋酸，可以在一定程度上防止或逆转过度显影，但这也会使条带变黄。

b. 加入等体积的 2× 增溶缓冲液。

c. 使用浮动垫将样品煮沸 5 分钟，以固定样品并将其放入设置为 100°C 的热板上的烧杯中。

5. 电泳

a. 取下梳子，用 1× SDS Tris/甘氨酸运行缓冲液冲洗样品孔，然后填充相同的缓冲液。

b. 小心地添加样品，让它们沉到底部，而不是溢出到其他孔中。

c. 将凝胶放入电泳室。

d. 用冷 (4°C) 1× SDS Tris/甘氨酸运行缓冲液填充上部（首先）然后下部储液器。最少 2 升，最好是 4 升。

e. 以 9 mAmp/凝胶恒定电流运行凝胶通过堆积凝胶，然后以 12 mAmp/凝胶通过分离凝胶。总运行时间约为 5 小时。

f. 当染料前沿到达分离胶底部时，停止电泳。

E. PEOM 的 SDS-PAGE

1. 蛋白质样品的制备

a. 将 PEOM 样品添加至所需浓度（1-10 µg，具体取决于条带数量）并用 HPLC 级水稀释至最大体积 7.5 µl（5 µl 为首选）。

b. 加入等体积的 2× 增溶缓冲液。

d. 使用浮动垫固定样品并将样品放入装有水的烧杯中，并置于设置为 100°C 的热板上，将样品煮沸 10 分钟。

2. 电泳

a. 从商用 4-12% Bis-Tris 凝胶中取出梳子，并用蒸馏水冲洗样品孔。

b. 将凝胶放入电泳室。

c. 用 1× SDS-Tris/甘氨酸运行缓冲液填充上缓冲液室和孔。

d. 添加样品，让它们沉到底部。

e. 用 1× SDS-Tris/甘氨酸运行缓冲液填充下部缓冲液室。

f. 在 180 V 恒定电压下运行凝胶。

g. 当染料前沿到达凝胶底部时，停止电泳。

F. LPS/LOS 凝胶的银染

1. 从玻璃板之间取出凝胶。

2. 用 200 毫升固定剂在玻璃盘中固定凝胶，室温下盖上保鲜膜过夜；不需要摇晃。

3. 丢弃固定剂。

4. 在黑暗中用 200 毫升的氧化溶液（新鲜的）氧化凝胶，用铝箔覆盖培养皿以尽量减少光照。

5. 快速旋转盘子 (~70 rpm) 5 分钟。

6. 弃去氧化溶液，用 1 L 蒸馏水缓慢旋转清洗凝胶 3 次，每次 15 分钟。

7. 在最后一次洗涤时准备银染试剂。

a. 将 1 g 硝酸银溶解到 5 ml 蒸馏水中。

b. 在单独的 500 毫升烧瓶中，将 2 毫升 NH ₄OH 添加到 28 毫升 0.1 M NaOH 中，制成 NaOH/NH ₄OH 溶液。

c. 在轻轻摇动的同时，将所有硝酸银溶液缓慢滴加到NaOH/NH ₄OH 溶液中。形成棕色沉淀，然后变得清澈。

d. 加入 115 毫升蒸馏水。（此时，试剂应该是完全透明的。如果溶液仍然是棕色的，不要使用它，并用新鲜的 NH ₄OH重新补充。）

8. 弃去最后一次洗液，将银染试剂加入凝胶中，快速摇动（~70 rpm）10 分钟。

9. 将银染试剂倒入烧瓶中，并在处理前用少量（大捏）CaCl ₂沉淀。

10. 用 1 L 蒸馏水清洗凝胶 3 次，每次 10 分钟。

11. 丢弃最后一次洗涤并加入 200 毫升显影液。

12. 在最佳发展之前通过在冷水中冲洗凝胶来停止反应。如果发生过度显影，凝胶可以用 5% 醋酸脱色，但条带可能会变黄。

13. 冷藏保存，但请尽快拍照或扫描。

G. 蛋白质凝胶的考马斯蓝染色

1. 从盒中取出凝胶并放入干净的托盘中。

2. 用蒸馏水轻轻搅拌清洗凝胶 3 次，每次 5 分钟。

3. 丢弃最后一次洗涤。

4. 添加足够体积的 Page Blue 蛋白染色溶液以覆盖凝胶。

5. 在室温下温和搅拌孵育 60 分钟。

6. 弃去染色液，用蒸馏水冲洗凝胶两次。

7. 用蒸馏水轻轻搅拌清洗凝胶 3 次，每次 5 分钟（或多次清洗，直到背景变得清晰）。

8. 冷藏直到准备拍照。

数据分析

A. 各种属的 LOS（1-4 道）和 LPS（5-8 道）的概况（Inzana 和 Apicella，1999）。

1. “使用单个浓缩凝胶描述的试剂，获得了可接受的 LPS 和 LOS 曲线（图 1A）。然而，当使用包含与上层缓冲液相同的缓冲液的单独梳状凝胶（堆积凝胶 B）时，轮廓更加清晰，尤其是较低分子量的 LOS 带（图 1B）”。© 1999 WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Fed。德国众议员。

2. “在通过双层堆积凝胶进行电泳后，可以更准确地辨别嗜血杆菌和奈瑟菌属物种可以分辨的条带数量（图 1B，泳道 1-4）”。© 1999 WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Fed。德国众议员。

图 1. 使用 (A) 单个浓缩凝胶或 (B) 两个浓缩凝胶进行常规 SDS-PAGE 后，各种属的 LOS（第 1-4 道）和 LPS（第 5-8 道）的电泳图谱。

泳道、分离出 LOS/LPS 样品的细菌和样品浓度： (1) b 型流感嗜血杆菌，1.5 μg；(2)嗜睡嗜血杆菌，2.2 μg；(3)淋病奈瑟菌，1.0 μg；(4)多杀巴氏杆菌，1.5 μg；(5)胸膜肺炎放线杆菌7型，7.5 μg；(6)流产布鲁氏菌，12 μg；(7)大肠杆菌，12 μg；(8)鼠伤寒沙门氏菌，8 μg。经许可（Inzana 和 Apicella，1999 年）复制 © 1999 WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Fed。德国众议员。

B. 来自Histophilus somni菌株的OMP 的电泳图谱（图 2）。

图 2.使用 Triton-X-100 (T-X100) 或十二烷基肌氨酸钠 (SLS) 进行细胞裂解和提取后，来自Histophilus somni菌株 2336 的外膜蛋白 (OMP) 电泳图谱。

T-X100 提取物包含许多与内膜相关的蛋白质，SLS 提取物富含众所周知的主要 OMP，例如 ~40 kDa 蛋白质。然而，使用 SLS 无法很好地解析较低分子大小的蛋白质 (<15 kDa)。分子大小标记 (MW) 位于左侧。每条泳道添加了 4 μg 蛋白质，表明有大约 10 ng 蛋白质/条带。

食谱

1. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)

8.5 克氯化钠 (150 毫米)

0.23 克 NaH ₂PO ₄(1.9 mM)

2.17 克 Na ₂HPO ₄·7H ₂O (8.1 mM)

加入蒸馏水至 1 L，调节 pH 至 7.4。

2. 5 M 氯化钠

29.22 克氯化钠

加入蒸馏水至 100 毫升。

3. 2 M 氯化镁₂

19.04 克氯化镁₂

加入蒸馏水至 100 毫升。

4. 含有 2 mM MgCl ₂_的Tris 缓冲液（0.05 M，pH 7.8）

0.61 克 Trizma ^®基料

100 μl 2 M MgCl ₂（使用前添加）

加蒸馏水至 100 ml，调节 pH 至 7.8，4°C 保存。

5. Tris 缓冲液（1.25 M，pH 6.8）

15.14 克 Trizma ^®基料

加蒸馏水至 100 ml，调节 pH 至 6.8，4°C 保存。

6. Tris 缓冲液（1.88 M，pH 8.8）

22.77 克 Trizma ^®基料

加蒸馏水至 100 ml，调节 pH 至 8.8，4°C 保存。

7. HEPES 缓冲液（10 mM，pH 7.4）

0.24 克 HEPES

加入蒸馏水至 100 ml，调节 pH 至 7.4。

8. 丙烯酰胺原液（30% T，0.8% C）

29.2 克丙烯酰胺

0.8 克双丙烯酰胺（C，交联剂）

加入蒸馏水至 100 毫升。过滤原液，用铝箔包裹，并在 4°C 下储存。

9. 尿素溶液 (9 M)

54.05 克尿素

加入蒸馏水至 100 毫升，并在室温下储存。

10. 10% SDS 溶液

10 克 SDS

加入蒸馏水至 100 毫升，并在室温下储存。

11. 10×Tris/甘氨酸运行缓冲液

30.29 克 Trizma ^®碱 (0.25 M)

144.13 克甘氨酸 (1.92 M)

加蒸馏水至 1 L，室温保存。

12. 1× SDS-Tris/甘氨酸运行缓冲液（4 L）

400 ml 10×Tris/甘氨酸电泳缓冲液

40 毫升 10% SDS 溶液

加入蒸馏水至 4 L，4°C 保存。

13. 5% 过硫酸铵溶液

50 毫克过硫酸铵

添加蒸馏水至 1 毫升（为每个实验准备新鲜水）。

14. 2×增溶缓冲液（100毫升）

对于 LPS/LOS 凝胶：

10 ml 1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 6.8 (0.1 M)

2 克 SDS (2%)

20 克蔗糖 (20%)

0.5 毫升 1% 溴酚蓝 (0.005%)

加入蒸馏水至 100 毫升。

在使用前，将 10 μl 2-巯基乙醇加入 990 μl 2×增溶缓冲液中。

对于 OMP 凝胶：

12.5 ml 1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 6.8 (0.125 M)

4 克 SDS (4%)

20 毫升甘油 (20%)

0.5 毫升 1% 溴酚蓝 (0.005%)

加入蒸馏水至 100 毫升。

在使用前，将 100 μl 2-巯基乙醇加入 0.9 ml 2×增溶缓冲液中。

15. 固定剂（200 毫升）

10毫升冰醋酸（终浓度5%）

80 毫升乙醇（终浓度 40%）

110毫升蒸馏水

16. 氧化溶液

1.4 克高碘酸（终浓度 0.7%）

固定液200ml

17. 20%硝酸银溶液

1克硝酸银

加入蒸馏水至 5 毫升。

18. 银染试剂（有关制备的详细信息，请参阅程序部分 E）

28 毫升 0.1 N NaOH

2 毫升 NH ₄OH 溶液

5毫升20%硝酸银（滴加硝酸银）

115毫升蒸馏水

19. 开发者解决方案

50 毫克柠檬酸

37%甲醛(福尔马林)0.5ml

加入蒸馏水至 1 L。

致谢

作者实验室的工作经费由 USDA-NIFA、NIH、弗吉尼亚理工学院和州立大学兽医学院提供。LPS/LOS 协议的原始工作源自 Tsai 和 Frasch（1982）、Inzana 和 Apicella（1999）。

PEOM 协议的准备和分析的原始工作源自 Loeb 和 Smith (1980)、Barenkamp等人。(1981) 和 Loeb等人。(1981)。

利益争夺

作者没有财务或非财务竞争利益。

参考

1. Barenkamp, SJ, Munson, RS, Jr. 和 Granoff, DM (1981)。通过外膜蛋白谱对 b 型 流感嗜血杆菌进行亚型分离。J Infect Dis 143(5): 668-676。

2. Bos, MP, Robert, V. 和 Tommassen, J. (2007)。革兰氏阴性细菌外膜的生物发生。Annu Rev Microbiol 61：191-214。

3. Cloeckaert, A.、Verger, JM、Grayon, M. 和 Vizcaíno, N. (1996)。布鲁氏菌主要外膜蛋白的分子和免疫学特征。 FEMS Microbiol Lett 145(1)：1-8。

4. Darveau, RP 和 Hancock, RE (1983)。从光滑和粗糙的铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌菌株中分离细菌脂多糖的程序。 J Bacteriol 155(2): 831-838。

5. Diezel, W., Kopperschläger, G. 和 Hofmann, E. (1972)。一种使用新型考马斯亮蓝在聚丙烯酰胺凝胶中进行蛋白质染色的改进程序。肛门生物化学48（2）：617-620。

6. Filip, C.、Fletcher, G.、Wulff, JL 和 Earhart, CF (1973)。离子洗涤剂月桂基肌氨酸钠对大肠杆菌细胞质膜的增溶作用。J Bacteriol 115(3): 717-722。

7. Galanos, C.、Lüderitz, O. 和 Westphal, O. (1969)。一种提取R脂多糖的新方法。Eur J Biochem 9(2): 245-249。

8. Giordano, NP, Cian, MB 和 Dalebroux, ZD (2020)。外膜脂质分泌和对革兰氏阴性细菌的先天免疫反应。感染免疫88(7)。

9. Goebel, WF, Binkley, F. 和 Perlman, E., (1945)。痢疾杆菌flexner群的研究：一、副痢疾志贺氏菌(Flexner)的特异性抗原。J Exp Med 81(4): 315-330。

10. Hancock, RE 和 Carey, AM (1979)。铜绿假单胞菌的外膜：热-2-巯基乙醇-可修饰蛋白。 J Bacteriol 140(3): 902-910。

11. Hitchcock, PJ 和 Brown, TM (1983)。银染聚丙烯酰胺凝胶中沙门氏菌脂多糖化学型之间的形态异质性。 J Bacteriol 154（1）：269-277。

12. Hobb, RI, Fields, JA, Burns, CM 和 Thompson, SA (2009)。评价从空肠弯曲杆菌中分离外膜的程序。 微生物学（阅读）155（第 3 篇）：979-988。

13. Inzana, TJ (1983)。流感嗜血杆菌脂多糖的电泳异质性和菌株间变异。 J Infect Dis 148(3): 492-499。

14. Inzana, TJ 和 Apicella, MA (1999)。使用双层堆积凝胶提高聚丙烯酰胺凝胶中脂多糖和脂多糖的分辨率。电泳20（3）：462-465。

15. Inzana, TJ, Hensley, J., McQuiston, J., Lesse, AJ, Campagnari, AA, Boyle, SM 和 Apicella, MA (1997)。嗜血嗜血杆菌脂多糖表位的相变和保守性。感染免疫65(11)：4675-4681。

16. Johnson, KG, Perry, MB 和 McDonald, IJ (1976)。研究犬奈瑟菌和亚黄花孢子菌的细胞脂多糖和游离脂多糖。Can J Microbiol 22(2): 189-196。

17. Leive, L. (1965)。通过 EDTA 处理大肠杆菌释放脂多糖。 Biochem Biophys Res Commun 21(4): 290-296。

18. Loeb, MR 和 Smith, DH (1980)。流感嗜血杆菌疾病分离株的外膜蛋白组成：致病和流行病学意义。感染免疫30(3): 709-717。

19. Loeb, MR, Zachary, AL 和 Smith, DH (1981)。来自封装的b 型流感嗜血杆菌的外膜和内膜的分离和部分表征。J Bacteriol 145（1）：596-604。

20. Lesse, AJ, Campagnari, AA, Bittner, WE 和 Apicella, MA (1990)。利用tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳提高脂多糖和脂多糖的分辨率。 免疫学杂志126(1): 109-117。

21. Merril, CR、Goldman, D.、Sedman, SA 和 Ebert, MH (1981)。聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的超灵敏染色显示脑脊液蛋白质的区域变化。科学211(4489)：1437-1438。

22. Miura, T. 和 Mizushima, S. (1968)。通过密度梯度离心将两种类型的膜与大肠杆菌K12 的原生质体膜分离。Biochim Biophys Acta 150(1): 159-161。

23. Morrison, DC 和 Leive, L. (1975)。通过两种提取程序制备的来自大肠杆菌O111:B4 的脂多糖组分。J Biol Chem 250(8): 2911-2919。

24. Murakami, Y.、Imai, M.、Nakamura, H. 和 Yoshimura, F. (2002)。牙龈卟啉单胞菌外膜的分离和主要外膜蛋白的鉴定。Eur J Oral Sci 110(2): 157-162。

25. Nikaido, H. (2003)。重新审视细菌外膜通透性的分子基础。Microbiol Mol Biol Rev 67(4): 593-656。

26. Nurminen, M. 和 Vaara, M. (1996)。甲醇从深层粗细菌中提取 LPS。 Biochem Biophys Res Commun 219(2): 441-444。

27. Osborn, MJ、Gander, JE、Parisi, E. 和 Carson, J. (1972)。鼠伤寒沙门氏菌外膜的组装机制。细胞质和外膜的分离和表征。 J Biol Chem 247(12): 3962-3972。

28. Preston, A., Mandrell, RE, Gibson, BW 和 Apicella, MA (1996)。致病性革兰氏阴性菌的脂多糖。 Crit Rev Microbiol 22(3): 139-180。

29. Raetz, CR, Purcell, S., Meyer, MV, Qureshi, N. 和 Takayama, K. (1985)。从鼠伤寒沙门氏菌的 3-脱氧-D-甘露糖-辛糖酸缺陷突变体中分离和表征八种脂质 A 前体。 J Biol Chem 260(30)：16080-16088。

30. Ribi, E.、Haskins, WT、Landy, M. 和 Milner, KC (1961)。低氮低脂内毒素的制备及宿主反应特性[J]. J Exp Med 114(5): 647-663。

31. 罗伯茨，NA，格雷，GW 和威尔金森，SG (1967)。铜绿假单胞菌细胞壁制备过程中脂多糖的释放。 Biochim Biophys Acta 135(5): 1068-1071。

32. 加利福尼亚州施奈特曼 (1971)。Triton X-100 溶解大肠杆菌细胞质膜。 J Bacteriol 108（1）：545-552。

33. Silhavy, TJ、Kahne, D. 和 Walker, S. (2010)。细菌细胞包膜。Cold Spring Harb Perspect Biol 2(5)：a000414。

34. 蔡, CM (2001)。脑膜炎奈瑟菌脂寡糖对宿主结构的分子模拟：使用单克隆抗体和特定凝集素表征脂寡糖中的唾液酸化和非唾液酸化乳糖-N-新四糖（Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）结构。 Adv Exp Med Biol 491：525-542。

35. Tsai, CM 和 Frasch, CE (1982)。一种灵敏的银染剂，用于检测聚丙烯酰胺凝胶中的脂多糖。 肛门生物化学119（1）：115-119。

36. Westphal, O. 和 Jann, K. (1965)。苯酚-水提取细菌脂多糖及其进一步应用。方法碳水化合物化学5：83-91。