材料和试剂

1. 抗体 (HSPC)：

CD34（克隆：581；APC-Cy7）

CD38（克隆：HB-7；FITC）

CD90（克隆：5E10，PE）

CD123（克隆：6H6；PE-Cy7）

CD45RA（克隆：HI100，太平洋蓝）

2. 抗体（谱系）（均与相同的荧光染料结合，例如PE-Cy5）：

CD2（克隆：RPA-2.10）

CD3（克隆：S4.1）

CD4（克隆：S3.5）

CD7（克隆：CD7-6B7）

CD8（克隆：3B5）

CD10（克隆：MEM-78）

CD11b（克隆：ICRF44）

CD14（克隆：HCD14）

CD19（克隆：HIB19）

CD20（克隆：2H7）

CD56（克隆：B159）

CD235a（克隆：GA-R2）

3. CD34 MicroBead Kit UltraPure（Miltenyi Biotec，目录号：130-100-453）

4. Cell Strainer 40 μm（Greiner Bio-One，目录号：542040）

5. Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（Gibco，目录号：41966-029）

6. 胎牛血清（FBS）（Sigma，目录号：F7524）

7. Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare，目录号：17-1440-03）

8. 新鲜脐带血或成人 BM

9. Gag/pol 质粒（Addgene，质粒编号：14887）

10. HEK293T细胞（ATCC，目录号：CRL-11268573）

11. 人体细胞因子：

人 IL-6，优质级（Miltenyi Biotec，目录号：130-093-932）；

人 IL-3 优质级（Miltenyi Biotec，目录号：130-095-069）；

人 SCF，优质级（Miltenyi Biotec，目录号：130-096-695）；

Human Flt3-Ligand，优质级（Miltenyi Biotec，目录号：130-096-479）；

人类 TPO，优质级（Miltenyi Biotec，目录号：130-108-339）；

在无菌过滤的 PBS + 0.1% FBS 中制备 10 μg/ml 原液。

12. Isocove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM）（Gibco，目录号：31980-022）

13. LS 色谱柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）

14. Minisart 过滤器 unt 0.45 μm（Sartorius，目录号：16555-K）

15. MSCV 质粒（TaKaRa，目录号：634401）

16. 针：27G（BD，目录号：300635），29G（BD，目录号：324824）

17. NSG 小鼠（杰克逊实验室，目录号：05557）

18. OneComp eBeads 补偿珠（Thermo Scientific，目录号：01-1111-41）

19. 青霉素/链霉素（P/S）（Sigma，目录号：P4333）

20. pMSCV-MLL-AF6、pMSCV-MLL-ENL（请求至：eric.so@kcl.ac.uk）

21. 聚凝胺感染/转染试剂（10 mg/ml）（默克，目录号：TR-1003-G）

22. 聚乙烯亚胺 (PEI) 25kD 线性；Polysciences，编号：23966-2)

23. 碘化丙啶

24. Rely+On ^TMVirkon ^®片剂（VWR，目录号：115-0020）

25. 注射器：1 ml（Terumo，目录号：SS+01T1）；10 ml（Terumo，目录号：SS+10ES1）

26. 组织培养塑料：

10 cm培养皿（Thermo Scientific，目录号：150350）

96 孔 U 型底板（Falcon，目录号：353077）

48 孔板（Sarstedt，目录号：83.3923.500）

24孔板（Greiner，目录号：662160）

12孔板（Greiner，目录号：665180）

27. 管：

50毫升管（Greiner Bio-One，目录号：227261）

15毫升管（Greiner Bio-One，目录号：188261）

1.5 ml Eppendorf 管（Starlab，目录号：S1615-5550）

28. 超速离心管（Thermo Scientific，目录号：3117-0380）

29. VSVG质粒（Addgene，质粒编号：14888）

30. 培养基（见食谱）

31. D10（见食谱）

32. 扩展介质（见配方）

33. FACS 缓冲液（见配方）

34. MACS 缓冲区（见食谱）

35. 聚乙烯亚胺（PEI）（见配方）

36. 红细胞裂解缓冲液（见配方）

设备

1. 移液器

2. 吸气器

3. 细胞计数器（血细胞计数器）

4. 细胞分选仪（例如，BD FACS Aria）

5. 96孔板离心机

6. 冷冻机 (-80 °C)

7. 伽马射线辐照器

8. 培养箱（5% CO ₂37°C）

9. 倒置显微镜

10. 层流柜

11. MACS MultiStand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）

12. MidiMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302）

13. 移液器辅助

14. 摆斗转子（贝克曼库尔特，型号：SW32 Ti）

15. 超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-100 XP）

16. 水浴

软件

1. 微软Excel

程序

开始前的重要信息：在符合当地规则的 II 类实验室中执行程序。为病毒工作、主要人体样本处理和操作以及异种移植研究获得所有必要的当地健康与安全和道德批准。图 1提供了本协议中描述的程序的示意图概述。

图 1.使用高度纯化的人类造血干细胞和祖细胞群作为目标群体进行体外和体内转化试验的主要步骤示意图。

A. 病毒制备

1. 携带感兴趣的癌基因的浓缩逆转录病毒的产生

a. 将 9 毫升 D10 中的 400 万个 HEK293T 细胞放入每个 10 厘米的板中。为本协议中要测试的每个病毒构建体准备 3 个板。

b. 将板放入 37°C、5% CO ₂_的培养箱中过夜。

c. 第二天，将所有试剂置于室温 (RT)，包括 IMDM、PEI、质粒。

d. 更换媒体。吸出培养基并更换为 8 毫升温热的 D10 培养基。将板放入 37°C、5% CO ₂培养箱中。对于逆转录病毒生产，将 3 ml IMDM 移液到 15 ml Falcon 管中。添加 7.5 μg Gag/Pol 质粒、7.5 μg VSVG 质粒和 15 μg 含有感兴趣基因的逆转录病毒质粒，例如MSCV-MLL-ENL-IRES-GFP。通过涡旋混合。

e. 将 90 μl (1 mg/ml) PEI 添加到 15 ml Falcon 管中并涡旋 20 秒。在 RT 中孵育15 分钟。

f. 孵育后，短暂涡旋 15 ml Falcon 管。相应地标记您的板并将 1 毫升这种混合物转移到三个 HEK293T 板中的每一个中。这最好以覆盖板的大部分区域的逐滴方式缓慢进行。轻轻旋转板并将它们放回 37°C、5% CO ₂_的培养箱中过夜。

g. 第二天，更换媒体。吸出培养基并更换为 12 毫升温热的 D10 培养基。

h. 将板放入 37°C、5% CO ₂_的培养箱中过夜。

i. 第二天，在转导后至少 48 小时，使用 10 ml 注射器收集转染 HEK293T 板的上清液。将 0.45 μm 过滤器连接到注射器上，将上清液放入标记的超速离心管中。对用相同构建体转染的其他板重复，直到所有上清液都收集在同一超速离心管中。丢弃注射器并过滤到新鲜制备的 1% virkon 溶液中。

j. 将装满的超速离心管放入桶中并盖上盖子。如果需要，准备一个天平。按照制造商的说明将所有桶放在转子上并插入转子。

k. 在 4°C下以 25,000 rpm (>80,000 × g )旋转3 小时。

l. 旋转后，取回标记的超速离心管。吸出培养基，在管中留下约 3 毫升。轻轻涡旋剩余的培养基（= 浓缩逆转录病毒），然后将每份 220 μl 分装到预先标记的 Eppendorf 管中。将病毒储存在 -80°C。对于该协议，细胞可以通过在 -80°C 下储存超过 1 年的病毒进行转化。

2. FACS 病毒滴定

a. 将 500 μl D10 中的 50K HEK293T 细胞加入 24 孔板的每个孔中。准备7口井。

b. 将板放入 37°C、5% CO ₂_的培养箱中过夜。

c. 第二天，解冻含有浓缩病毒的一个 Eppendorf 管，并使用 D10 制备多个系列稀释液，例如，通过将 30 μl 病毒与 120 μl D10 混合来制备四个 1:5 连续稀释液。

d. 对于 HEK293T 细胞的病毒转导，将 0.25 μl 聚凝胺添加到 HEK293T 细胞的每个孔中。将井标记为“未转导”、“库存”，并相应地根据您的连续稀释，例如“1:5”、“1:25”、“1:125”和“1:725”。将 100 μl 原液或相应的连续稀释病毒添加到标记的孔中。将 100 μl D10 添加到标记为“未转导”的孔中。

e. 将 24 孔板放入预热的离心机中，并在 33°C 下以 800 × g旋转1 小时。

f. 将 24 孔板放入 37°C、5% CO ₂_的培养箱中过夜。

g. 第二天，在添加病毒后至少 24 小时，吸出培养基。在 400 μl PBS 中重悬 HEK293T 细胞，然后转移到 FACS 管中。通过 FACS 分析 GFP 表达，使用未转导的细胞作为控制来设置门。

h. 100 μl 浓缩病毒中的病毒滴度可以通过乘以（接种细胞数）*（GFP ⁺细胞的比例）*（稀释因子）来计算。

B. 从人脐带血或成人骨髓/动员外周血中分离确定的 HSPC 种群

注意：根据我们的经验，与冷冻脐血相比，新鲜脐带血或成人 BM/PBMC 可提供更可靠的转化结果。

1. 将 Ficoll-Paque Plus 带到 RT。

2. 通过将 15 ml 脐带血或成人 BM 转移到含有 15 ml PBS 的 50 ml 管中，在 PBS 中以 1:1 的比例稀释新鲜脐带血或成人 BM/动员的外周血。如果适用，使用多管稀释所有原始脐带血或成人 BM/动员外周血产品。

3. 将 20 ml Ficoll-plaque Plus 添加到单独的 50 ml 管中。用 30 ml 稀释的脐带血或成人 BM/PB 缓慢覆盖 Ficoll。如果适用，对其他管重复此操作。将 RT 离心机以 400 × g的速度离心 30 分钟，加速和减速设置为 0。

4. 小心地吸出大约 2/3 的含有血清的顶部部分。然后收集含有低密度单核细胞的界面并转移到新的 50 ml 管中。这最好通过使用连接到移液器辅助装置的 10 毫升移液器来完成。如果适用，对其他管重复此操作。加 PBS 至 50 ml，洗涤单核细胞。通过颠倒管数次混合并以 700 × g离心7 分钟，加速和减速设置为最大。

5. 吸出大部分上清液。如果使用多管，每管留出约 3-5 毫升。在剩余培养基中重悬细胞并合并到一个 50 ml 管中。加入 PBS 至 50 ml，再次以 700 × g离心7 分钟。

6. 吸出大部分上清液。在 5 ml 红细胞裂解缓冲液中重悬细胞沉淀（应为红色/粉红色，因为存在残留的红细胞），移液混合并在室温下放置 10 分钟。孵育后，加入 45 ml PBS 并颠倒混合管。通过 40 μm 细胞过滤器将细胞过滤到新的 50 ml 管中。使用血细胞计数器计数细胞。将 100K 细胞转移到一个标有“MNC 未染色”的 1.5 毫升 Eppendorf 管中，并置于 4°C。将含有剩余细胞的 50 ml 试管以 700 × g 的速度离心7 分钟。

7. 细胞沉淀现在应该显示为白色（如果仍然是红色，请再次重复步骤 B6）。根据制造商的建议，吸出上清液并在适当体积的 MACS 缓冲液中重悬沉淀，即300 μl，最多可容纳 10 ⁸^个细胞。添加 100 μl FcR 封闭试剂最多可用于 10 ⁸^个细胞并混合。添加 100 μl CD34 微珠，最多可用于 10 ⁸^个细胞，混合并在 4°C 避光孵育30 分钟。孵育后，加入 45 ml MACS 缓冲液清洗细胞。混合并以 700 × g离心7 分钟。

8. 将 MidiMACS 分离器放在支架上并插入 LS 柱。将 50 ml Falcon 置于柱下并加载 3 ml MACS 缓冲液以平衡柱。缓冲液将通过重力流过色谱柱。

9. 在步骤 B7 中从细胞中吸出上清液并重悬在适当体积的 MACS 缓冲液中（每 10 ⁸^个细胞500 μl MACS 缓冲液）并加载到柱上。等到所有体积都通过色谱柱。每次将 3 ml MACS 缓冲液上柱，洗涤 3 次。

10. 最后一次洗涤后，从 MidiMACS 分离器上取下色谱柱并置于 15 ml Falcon 管中。向柱中加入 5 ml MACS 缓冲液，插入并缓慢推动柱塞。使用血细胞计数器对洗脱的细胞进行计数。将 Falcon 管以 700 × g离心7 分钟。吸出上清液。

注意：从 90 g 的脐带血中，通常可以分离出100 × 10 ⁶-200 × 10 ⁶MNC。其中大约 0.3-1% 是 CD34 ⁺细胞，具体取决于产品。根据我们的经验，超过 130 g 的非常大的脐带血单位会产生更多的 MNC 和 CD34 ⁺细胞，超过将两个高达 90 g 的较小单位汇集在一起所获得的细胞数量。

11. 在 1 ml MACS 缓冲液中重悬细胞并转移到 1.5 ml Eppendorf 管中。将此 Eppendorf 管标记为“CD34 染色”。以 2000 × g离心2 分钟。吸出上清液并在 156 μl MACS 缓冲液中重悬沉淀。添加 4 μl (200 ng) 的每种 HSPC 抗体（工作浓度 1 ng/μl）。添加 2 μl (100 ng) 的每种谱系抗体（工作浓度0.5 ng/μl）。通过移液混合并在 4°C 下孵育 30 分钟。

12. 孵育后，将 1 ml MACS 缓冲液添加到两个 Eppendorf 管中，标记为“MNC 未染色”和“CD34 染色”。以 2,000 × g离心2 分钟，吸出上清液，并分别重悬在300 μl 和 1 ml FACS 缓冲液中。通过 40 μm 细胞过滤器过滤到无菌 FACS 管中。

13. 使用 FACS 分选器，例如BD Aria 或等效物，对造血祖细胞进行分选，例如HSC (lin^——CD34 ⁺CD38 ^-CD90 ⁺CD45RA ^–)、LMPP (lin ^–CD34 ⁺CD38 ^–CD90 ^–CD45RA ⁺)、CMP (lin ^–CD34 ⁺CD38 ⁺CD123 ⁺CD45RA ^–)、GMP (lin ^–CD34 ⁺CD38 ⁺CD123 ⁺CD45RA ⁺）。根据所使用的相应 FACS 机器的说明，必须在运行样品之前对不同的荧光染料进行补偿。我们通常使用补偿珠。我们通常直接分选到含有 500 μl MACS 缓冲液的 1.5 ml Eppendorf 管中。“MNC 未染色”管可用于定义所有图中的阴性未染色对照群体。门控策略和预期频率的示例如图 2 所示。

图 2. HSPC 亚群门控策略和频率。

A. 显示了 HSC、LMPP、CMP 和 GMP 种群的门控策略。B. 每个群体的频率显示为谱系阴性 CD34 富集细胞的百分比。UCB，脐带血（n = 12）；成人、成人骨髓或动员的 PBMC（n = 3）。

注意：文献中描述了人类 HSPC 种群的不同表型定义，这些文献可能使用不同的谱系标记混合物和/或不同的 HSPC 标记来纯化不同的种群（Edvardsson 等，2006；Doulatov 等，2012；Pellin 等。 , 2019)。

14. 计数分选的细胞并使用至少 300 个细胞来评估分选后的纯度，该纯度应高于 95%。为此，将至少 300 个细胞转移到一个新的标记的 FACS 管中。添加 FACS 缓冲液以弥补 150 μl。对每个排序的人口重复。通过在 FACS 分拣机中运行样本来评估分拣后的纯度。

15. 以 2,000 × g离心 Eppendorf 管和分选种群2 分钟。吸出上清液并重悬在细胞密度为 2,000-20,000/100 μl 的扩增培养基中。

16. 将多达 200 μl 转移到 U 型底 96 孔板的一个孔中，并在盖板上标记细胞群的身份。对所有排序的细胞群重复。在 96 孔板的所有外孔中加入 250 μl MACS 缓冲液，以避免膨胀介质蒸发。置于 37°C 培养箱中，加入 5% CO ₂过夜。

C. HSPC 群体的病毒转导

1. 从孵化器中取出带有排序种群的 96 孔板。

2. 根据要测试的癌基因的数量计算每个细胞群的适当数量。添加一个额外的条件作为您的未转换控制。在扩增培养基中以 1,000-10,000 个细胞/100 μl 的浓度重悬细胞，然后将 100 μl 转移到新 96 孔板的所需孔数中。

注意：例如，如果将测试 2 个致癌基因，则为每个种群准备 2 口井，并为每个种群准备一个额外的井，用于未转导控制（每个分类种群总共 3 口井）。

3. 对于每个准备好的孔，在单个 1.5 ml Eppendorf 管中混合以下物质：9.6 μl IMDM、15% FBS、P/S、0.12 μl (1.2 ng) 每个 SCF、TPO 和 FLT3L，0.075 μl (0.75 μg)聚凝胺。将 10 μl 这种混合物添加到每个含有细胞的孔中（为了准确移液，应制作主混合物）。

4. HSPC 种群的病毒转导所需的感染复数 (MOI) 为 5-10。使用确定的病毒滴度（参见步骤 A2h）计算每个种群制备的细胞密度（参见步骤 C2）所需的病毒体积。

5. 第一次转导：在 37°C 的水浴中解冻冷冻病毒。通过将计算出的病毒体积移入新的 Eppendorf 管中，并添加 D10 培养基，使总体积为 50 μl，为每次转导准备正确数量的病毒。将 50 μl 滴定的浓缩病毒转移到 96 孔板中的细胞群中。将 50 μl 温 D10 添加到对照细胞中。现在细胞/病毒混合物的总体积应为 150 μl。通过移液将细胞和病毒充分混合。

6. 将 96 孔板置于 5% CO ₂_的37°C 培养箱中过夜。

7. 第二天，从培养箱中取出 96 孔板。

8. 对于每个孔，在单个 1.5 ml Eppendorf 管中制备以下混合物：9.8 μl IMDM、15% FBS、0.1 μl (1 ng) 的每种 SCF、TPO 和 FLT3L。将 10 μl 这种混合物添加到每个含有细胞的孔中（为了准确移液，应制作主混合物）。

9. 第二次转导：解冻冷冻病毒。通过将计算出的病毒体积移入新的 Eppendorf 管中，为每次转导准备正确数量的病毒，并添加 D10 培养基，使总量为 50 μl（使用与步骤 C4 中相同的计算和步骤 C5 中的病毒体积）。像前一天一样将 50 μl 浓缩病毒转移到细胞群中。将 50 μl 的温 D10 添加到对照细胞中。现在细胞/病毒混合物的总体积应为 200 μl。通过移液将细胞和病毒充分混合。

注意：如果使用多种不同的病毒，请确保将与前一天相同的病毒添加到孔中。

10. 将 96 孔板置于 5% CO ₂_的37°C 培养箱中过夜。

D. 使用细胞因子进行液体培养测定

1. 第二天，从培养箱中取出 96 孔板，在显微镜下使用 10 倍物镜检查细胞。在孔的中心应该可以看到细胞簇。

2. 从含有细胞的每个孔中吸出 100 μl 上清液，而不会干扰细胞。再加入 100 μl IMDM、15% FBS、0.2 μl（2 ng）SCF、TPO 和 FLT3L，以及 0.4 μl（4 ng）IL-3 和 IL-6。通过移液充分混合。

3. 将 96 孔板置于 5% CO ₂_的37°C 培养箱中过夜。

4. 第二天，从培养箱中取出 96 孔板，在显微镜下使用 10 倍放大镜检查。如果细胞填满视野的 2/3 以上，则将细胞转移到 48 孔板中，加入 300 μl 培养基并返回至 37°C 的 5% CO ₂培养箱过夜。如果没有，则将细胞留在 96 孔板中，返回到 37°C 的 5% CO ₂培养箱过夜，并在第二天重复步骤 4。

5. 一旦细胞进入 48 孔板，每隔一天在显微镜下监测细胞扩增。如果细胞覆盖孔表面的 70% 以上或如果培养基颜色变黄，则添加 500 ul 新鲜培养基一次，总体积为 1 ml。将 48 孔板放入含 5% CO ₂_的37°C 培养箱中。

6. 一旦细胞总体积为 1 ml 并覆盖整个孔，将它们转移到 12 孔板并添加 2 ml 培养基（现在总体积为 3 ml）。将 12 孔板放入含 5% CO ₂_的37°C 培养箱中。

7. 每隔一天监测 12 孔板中的细胞，并使用血细胞计数器计算细胞数。一旦细胞浓度在 600K-1 百万/ml 内，将 400K 细胞重新悬浮在 2ml 新鲜培养基中（即200K 细胞/ml）转移到 12 孔板的新孔中。将新的 12 孔板放入含 5% CO ₂_的37°C 培养箱中。

8. 三天后，在含有细胞的新 12 孔板中再加入 2 ml 培养基（现在总体积为 4 ml）。将 12 孔板放入 5% CO ₂_的37°C 培养箱中。

9. 再过 4 天后（即，步骤 D7 后 1 周），对细胞进行计数，并将重新悬浮在 2 ml 新鲜培养基中的 400K 细胞转移到 12 孔板的新孔中。将新的 12 孔板放入含 5% CO ₂_的37°C 培养箱中。

10. 重复步骤 D8-D9 长达 15 周以监测细胞的生长。

笔记：

a. 对照细胞通常会在第 3-8 周停止扩增并完全分化，而转化细胞继续体外增殖（图 3A 和 3B）并保留未成熟的成髓细胞形态（图 3C）。获得完全分化的对照培养物的时间因样品而异。虽然有时未转导的 HSC 可能仍会在第 36 天显示出一定比例的未成熟细胞，但其他细胞群可能在第 36 天之前很久就已完全分化。

b. 一旦观察到来自同一细胞群的转导细胞和控制细胞之间的增殖模式存在差异，请制作 cytospin 制剂（图 3C）并执行流式细胞仪（图 3D）以表征这些早期转化细胞。冷冻细胞（> 100 万个细胞/小瓶）。

c. 每周对细胞形态和细胞表面标记表达进行表征。继续每两周冻结一次细胞，以建立可以在未来访问的转化细胞的冷冻库存。一旦观察到对照和转导细胞之间的增殖差异，转导细胞就可以用于其他研究，包括移植到免疫缺陷小鼠中（协议程序 E）。

图 3. MLL-ENL 转导的 HSPC 种群的体外转化。

AB。显示了 MLL-ENL 转导或未转导的 HSC 和 CMP 群体的累积细胞数 (A) 和倍数扩展 (B)。C. May-Gruenwald Giemsa 染色的细胞制剂在培养的第 36 天显示了指定细胞类型的典型细胞形态。D. 转化细胞在培养第 36 天时的典型表面标记表达。红色轮廓代表未染色的细胞，蓝色轮廓是用指定的表面标记染色的细胞。

E. 用于体内疾病发展的移植

在移植前不超过 24 小时对免疫缺陷 NSG 小鼠进行亚致死照射 (200-250 cGy)。小鼠应始终饲养在独立通风的笼子 (IVC) 中，所有程序始终在安全罩下进行。

小鼠通过后腿骨进行静脉内 (iv) (视频 1) 或骨内(io) (视频 2) 移植（股骨优于胫骨，因为它具有更大的骨髓腔）。移植途径取决于细胞数量：

对于 iv，应移植至少 500,000 个且不超过 1000 万个细胞。

对于io，没有设置最小单元数，但不应超过100万。

视频 1.静脉移植。

这段视频是在伦敦国王学院制作的。本视频中显示的实验程序已获得伦敦国王学院伦理委员会的批准，并符合英国内政部的规定。

视频 2.骨内移植。

这段视频是在伦敦国王学院制作的。本视频中显示的实验程序已获得伦敦国王学院伦理委员会的批准，并符合英国内政部的规定。

1. 用于移植的细胞的制备。

细胞应重悬于 PBS 或等渗盐水中。每只小鼠注射以下体积：对于静脉注射，150-200 μl 在连接到胰岛素注射器的 29G 1 ml 针头中。对于 io 注射，最多 20 μl 在连接到胰岛素注射器的 29G 1 ml 针头中。细胞应始终保持在冰上，并在移植前 5 分钟带回 RT。

注意：Matrigel 也可用作 io 注射的载体。在这种情况下，细胞在注射前应始终保持在冰上。

2. 通过静脉注射移植。

a. 小鼠在它们的 IVC 中用红外线辐射器 (200-300 W) 加热10 分钟，间隔 15 厘米，或在设置为 37°C 的 Mini-Thermacage 中加热 10 分钟。Mini-Thermacage 是首选，因为加热更均匀。在移植前加热小鼠可以使它们的尾静脉扩张并变得更加明显。应定期监测小鼠，如果它们出现热衰竭迹象，例如远离热源和呼吸急促，应立即远离热源。

b. 将鼠标放在无菌动物支架中，并将其尾巴保持在管外。尾部可见四根血管；两条静脉位于尾巴的侧面。仅使用静脉进行注射。

注意：切勿通过尾部腹侧和背侧血管注射；它们是动脉。会导致大出血！

c. 将针头倾斜几次，小心地重新悬浮细胞，并确保注射器内没有气泡。使用消毒湿巾清洁注射部位。将针头从尾部到头部的方向插入静脉约5mm，轻轻推动柱塞，缓慢注入全部体积2-3 s。您应该能够平稳地推动柱塞，看到尾静脉暂时变成白色 3-5 秒，然后再次变成红色/粉红色。

注意：如果推柱塞有阻力，注射部位周围变白，则注射失败，即针头不在静脉内。5 到 10 分钟后，当静脉再次可见时，再次尝试通过另一侧静脉注射。

d. 注射完注射器中的所有物质后，在拔针前保持 5 秒（注射后立即拔针会冲洗注射部位的一些细胞）。如果注射成功，一旦拔出针头，就会有轻微的出血。使用消毒湿巾再次清洁注射部位，并通过轻轻按压注射部位约 10 秒来止血。将鼠标放回 IVC。

3. 通过 io 注射移植到股骨。

注意：所有程序都应在安全罩下进行。

a. 将细胞置于冰上。就在注射之前，通过将针头倾斜几次并确保注射器内没有气泡来小心地重新悬浮细胞。

注意：制备细胞悬液时，每只小鼠重悬细胞 22 μl，因为胰岛素注射器中约有 1-2 μl 死体积。通过这样做，您可以确保注射 20 μl 细胞。

b. 通过 Plenum 蒸发器（例如，VetFlo ^TMVaporizer ），通过轻吸入麻醉剂例如 2-4% 异氟烷将小鼠置于无菌室中的麻醉下。观察老鼠的呼吸从“浅而快”到“深而慢”的变化。当小鼠深而缓慢地呼吸时，它处于深度麻醉状态，可以转移到设置在 37°C 的热垫上（如果没有热垫，则可以使用预热的聚苯板）并通过吸入异氟醚维持麻醉状态。在整个过程中，不断监测老鼠的呼吸至关重要，如果它再次变浅但又变快，则需要增加异氟醚的剂量。当鼠标呼吸浅而快速时，不应进行侵入性操作。如果它变得浅而缓慢，立即将老鼠从麻醉中取出，因为剂量太强，老鼠可能会被杀死。

c. 将鼠标背侧朝上。通过拔毛去除膝盖周围的毛发。使用消毒湿巾清洁注射部位。在皮肤上涂抹止痛霜（例如，EMLA 霜）。使用无菌 27G 针（不是细胞注射针）的锐角切开膝盖区域的横向（3-4 毫米长）皮肤，髌韧带（白色）现在应该暴露和可见。使用相同的针在髌韧带下方的股骨前端钻孔。轻轻地向各个方向来回移动针 - 在每次移动时，您应该感觉到骨骼内腔有刮擦。

d. 轻轻缓慢地抽出27G针头，记住抽出针头的方向。将含细胞的 29G 胰岛素针插入同一部位，与 27G 针拔出的方向相同。将针头插入注射部位时，您应该感觉不到阻力。感觉有阻力时，稍微调整进针方向。进针后，向四面八方轻轻划伤，确认针头在骨髓腔内。注入注射器中的所有内容物并拔出针头。将小鼠送回由红外线辐射器加热的 IVC，它们应在 3-5 分钟内从麻醉中恢复（如果被异氟醚麻醉）。

e. 每天监测通过 io 移植的小鼠。他们注射的腿应该被轻微跛脚/拖拽至少 2 天，但应该会在一周内恢复正常。根据兽医的指示，可以给小鼠服用止痛剂 1 周。

4. 鼠标监控

a. 移植后，应每天监测小鼠的健康状况。人体细胞的植入可以通过尾静脉采血进行追踪，然后进行 FACS 分析，每周不超过一次。移植的细胞应该是人类 CD45 ⁺。人类原代体外转化细胞植入 NSG 小鼠的肿瘤负荷和时间变化很大，有时它们甚至根本无法植入。根据我们的经验，最早在移植后 2 周就可以检测到人体外转化的细胞。

b. 当移植的小鼠开始表现出中度疼痛和痛苦的迹象（Burkholder等，2012），或达到人道终点（Burkholder等，2012）时，需要通过人道的方法剔除小鼠。采集血液、骨髓、脾脏、肝脏、胸腺和相关器官，以使用适当的细胞表面标志物（包括但不限于 CD34、CD38、CD45 和 CD33）通过 FACS 检查任何人体细胞植入，并产生血液/骨骼骨髓涂片检查细胞形态。如果白血病细胞浸润到这些器官中，脾脏、肝脏和/或胸腺可能会扩大，因此应记录它们的重量和大小（图 4A），并且可以通过具有适当细胞表面标记的 FACS 评估它们的人类细胞植入（图4B)，苏木精和伊红染色，在组织固定和切片后 (图 4C)。

图 4. 人类白血病移植小鼠的分析。

A. 对照小鼠（重量 = 42.2 毫克）和患病小鼠（重量 = 314.6 毫克）的脾脏照片，标尺为厘米。B. 移植的人 AML 细胞（蓝色）的代表性 FACS 图，对人 CD45 和 CD33 均呈阳性。C. 固定患病小鼠脾脏和肝脏的苏木精和伊红染色。人类 AML 细胞被染成深蓝色，比例尺 = 50 μm。

数据分析

建议使用不同的脐带血或成人骨髓样本进行至少 3 次体外转化试验，从中对定义的 HSPC 种群进行分类。在每个独立实验中，建议至少重复执行每个条件。用于每周倍数扩增的转化细胞的典型测定内和测定间变异性如下：

测定内变异性早期培养（第 2-4 周）HSC MLL-ENL（1%-85%）、CMP MLL-ENL（3%-25%）；中期培养（第 5-8 周）：HSC MLL-ENL (1%-12%)、CMP MLL-ENL (1%-21%)；长期培养（第 8-12 周）：HSC MLL-ENL (2%-10%)、CMP MLL-ENL (3%-23%)；

批间变异早期培养（第 2-4 周）HSC MLL-ENL（18%-80%）、CMP MLL-ENL（29%-50%）；中期培养（第 5-8 周）：HSC MLL-ENL (12%-32%)、CMP MLL-ENL (6%-29%)；长期培养（第 8-12 周）：HSC MLL-ENL (7%-24%)、CMP MLL-ENL (5%-21%)。虽然 %CV 在培养的早期阶段（第 2-4 周）相对较高，反映了脐带血样本的高度可变性，但由于 MLL-ENL 介导的转化，随着培养时间的推移，变异会减少。

相比之下，未转导的 HSC 和 CMP 群体的测定间 %CV 范围在 13% 和 141% 之间，仅在培养开始时观察到较低的变化，从第 3 周 (CMP) 和第 5 周 (HSC) 开始观察到更高的变化。对于数据分析，我们一般使用 Microsoft Excel 绘制累积生长曲线和倍数扩展，并使用 GraphPad Prism 绘制移植动物的存活曲线。

食谱

1. 文化传媒

IMDM、15% FBS、P/S、20 ng/ml 每种 SCF、TPO、FLT3L、IL-3 和 IL-6

2. D10

DMEM，10% FBS，P/S

3. 扩展媒体

IMDM、15% FBS、P/S、100 ng/ml 每种 SCF、TPO、FLT3L

4. 流式细胞仪缓冲液

PBS，0.5% FBS，P/S，碘化丙啶

5. MACS缓冲区

PBS，2 mM EDTA，0.5% FBS，P/S

6. PEI (1 微克/微升)

a. 将 PEI 溶解在已加热至 ~80°C的无内毒素 dH ₂O 中。

b. 冷却至室温。

c. 中和至 pH 7.0，过滤除菌（0.22 μm），等分并储存于 -20°C；工作库存可保持在 4°C。

7. 红细胞裂解缓冲液

a. 10 mM KHCO ₃、150 mM NH ₄Cl、0.1 mM EDTA

b. 用不含内毒素的 dH ₂O补足 300 ml ，然后过滤除菌 (0.22 μm)。储存在 4°C。

致谢

这项研究得到了英国癌症研究、英国血癌、Kay Kaydall 白血病研究基金和 TBRS RGC HK 的支持。该协议基于并用于最近的一份报告（Zeisig等人，2021 年；DOI：10.1126/scitranslmed.abc4822）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有实验程序均经伦敦国王学院伦理委员会批准并符合英国内政部的规定。

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