材料和试剂

1. 机械微量移液器（Eppendorf，目录号：2231302001）
2. 机械微量移液器的匹配移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：02-707-507、02-707-450、02-717-133）
3. 1.5 ml 微量离心管（Eppendorf，目录号：022363204）
4. 锥形管，15 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
5. 石英 EPR 管，3 mm ID × 4 mm OD × 250 mm 长（Sigma-Aldrich，目录号：Z566535）
6. 石英毛细管，0.8 mm ID × 1 mm OD × 100 mm 长度（VitroCom，目录号：CV8010-Q-100）
7. 毛细管密封剂（Fisher Scientific，目录号：02-678）
8. PTFE胶带，中等密度，12.7 mm × 13.21 mm（防卡死技术，目录号：16035）
9. 用于在液氮中冷冻的杜瓦瓶屏蔽真空瓶，350 毫升（Pope Scientific，目录号：8600-0099）
10. 低型杜瓦瓶，275 ml（Cole-Parmer，目录号：EW-03771-21）
11. 金属线，约 50 厘米
12. 黄铜圆柱体，直径 20 mm × 长度 30 mm，一端带盲孔，直径 7 mm × 长度 25 mm
13. 气体调节器（Uniweld，目录号：RP3E）
14. Tygon E-3603 管，5/16” ID × 7/16” OD（Cole-Parmer，目录号：EW-07407-83）
15. 安全护目镜（Fisher Scientific，目录号：12-888-305）
16. Cr yogen 保护手套（Grainger，目录号：2AEY6）
17. 去离子水（Fisher Scientific，目录号：21-520-113）
18. 五水硫酸铜（Spectrum Chemical，目录号：C1431）
19. 盐酸，需要制备 1 M HCl 溶液以调节 pH 值（Fisher Scientific，目录号：02003059）
20. 氢氧化钠颗粒，需要制备 1 M NaOH 溶液以调节 pH 值（Fisher Scientific，目录号：56-753-0250GM）
21. 校准溶液（pH = 4.00、7.00、10.00）（Fisher Scientific，目录号：SB101-500、SB107-500、SB115-500）
22. pH电极储存液（Hanna Instruments，目录号：HI70300）
23. pH电极填充液（Hanna Instruments，目录号：HI7082）
24. pH电极存储帽（Hanna Instruments，目录号：HI740200）
25. 氯化钠（Fisher Scientific，目录号：BP3581）
26. MOPS（Fisher Scientific，目录号：BP358）
27. 次氮基三乙酸二钠，NTA（Sigma-Aldrich，目录号：N0128）
28. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7757）
29. Ficoll PM 70（Fisher Scientific，目录号：45002020）
30. MAP-Pro 丙烯/丙烷气（Bernzomatic，目录号：MG9）
31. 用于 CW-EPR 和 ESEEM 实验的液氮
32. 用于 DEER/PELDOR 实验的液氦
33. 具有一个或多个 dHis 突变的蛋白质
34. 100 mM MOPS 缓冲液（见配方）
注意：对于需要更长演化时间的实验，氘化溶剂可用于增加 T m弛豫时间（Casto 等人，2021）。

设备

1. 分析天平（Denver Instruments，型号：M-220D）
2. Vortex-Genie 2（科学工业，目录号：SI-0236）
3. pH电极（Hanna Instruments，目录号：HI1332B）
4. pH计，accumet AB150（Fisher Scientific，目录号：13-636-AB150A）
5. 冰箱 4°C
6. 冷冻室 -20 ° C 和 -80°C
7. 用于确定蛋白质浓度的分光光度计（Thermo Scientific，型号：NanoDrop 2000）
8. 布鲁克 ElexSys E680 CW/FT X 波段光谱仪
9. 布鲁克 ER4118-MD5 谐振器
10. 布鲁克 ER4122 SHQE-W1 高分辨率谐振器
11. 牛津ITC503温度控制器
12. Oxford LLT 650 低损耗传输管
13. Oxford CF935 动态连续流低温恒温器

软件

1. MATLAB 版本 R2020b 或更高版本（The MathWorks Inc.）https://www.mathworks.com/
2. 适用于 MATLAB 的 EasySpin 工具箱，版本 5.2.30，免费提供（Stoll和 Schweiger，2006 年）https://www.easyspin.org/
3. Bruker Xepr 软件随 EPR 光谱仪提供
4. NanoDrop 2000 程序随分光光度计提供
5. 一个进行 NLSL.MOMD 分析的程序，免费提供（Budil等人，1996 年）https://www.acert.cornell.edu/index_files/acert_ftp_links.php
6. 用于 EasySpin 和 NLSL 的 Xepr ESEEM 程序和示例脚本可从https://github.com/SaxenaLab/Copper 获得

程序

除非另有说明，所有溶液均在去离子水中制备。使用 1 M HCl 或 1 M NaOH 溶液进行任何 pH 调节。实际上，我们发现了多种缓冲液，例如磷酸盐、HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸）、MOPS（3-（N-吗啉代）丙磺酸）和 NEM（N-乙基吗啉） ) 可以使用缓冲区。然而，使用 Tris 缓冲液会降低标记的性能。在上面列出的缓冲液中，MOPS 可实现最高的 Cu(II)NTA 标记效率（Gamble Jarvi等人，2020a）。因此，这里描述的所有实验都是在 MOPS 缓冲液中完成的。尽管如此，大多数缓冲区之间的差异很小，因此如果系统需要，可以使用另一个缓冲区。此外，该协议提供了在 pH = 7.4 时进行标记的条件，但该标记可耐受 6.4 和 8.4 之间的 pH 值，以及竞争离子（如 Zn(II)NTA）的存在（Wort等人，2021b）。分步 EPR 光谱仪协议可在其他地方（Vicino等人，2021 年）以及 EPR 光谱仪随附的布鲁克手册中找到。因此，我们在以下协议中提供了特定于 Cu(II) 的参数和步骤。讨论的 EPR 实验使用 X 波段频率（大约 9.8 GHz）的相关参数。虽然每个单独的 EPR 实验都应该一次完成，但 CW-EPR、3 脉冲 ESEEM 和 DEER 不必背靠背进行。

A. Cu(II)NTA的制备
1. Cu(II)NTA合成
a. Cu(II)NTA 复合物的储备溶液的制备是根据先前发表的文献 (Mehlenbacher等人, 2015) 修改的。这种合成对时间不敏感，可以在每个步骤之间中断进行。
b. 在 15 ml 锥形管中将大约 5 ml 去离子水 (DI) 水的 pH 值调节至 12.00。通过每 1 毫升 pH = 12.00 去离子水 (117.46 毫克/5 毫升) 溶解 23.49 毫克 NTA 来制备 100 mM NTA 库存溶液。NTA 是酸性的，会改变溶液的 pH 值，因此一定要通过添加 NaOH 将 pH 值保持在 12 以确保 NTA 溶解。
c. 在单独的 15 ml 锥形管中，将 5 ml 去离子水的 pH 值调整为 2.00。以每 1 毫升去离子水 (24.95 毫克/5 毫升) 4.99 毫克的比例将Cu(II)SO 4 ·5H 2 O溶解在 pH = 2.00 去离子水中。这是 20 mM Cu(II)SO 4储备溶液。
d. 在单独的 15 ml 锥形管中，使用 MOPS 缓冲液将 1 ml 等分的 100 mM NTA 原液稀释至 5 ml（20 mM NTA）（参见食谱）。慢慢加入 5 ml 的 20 mM Cu(II)SO 4原液。这使得 10 mM Cu(II)NTA 库存溶液。Cu(II)NTA 溶液是比 Cu(II)SO 4更深的蓝色，如图 1A 所示。如果 Cu(II)NTA 溶液中有蓝色沉淀，则合成不成功，应更加小心地调整 pH 值。
e. Cu(II)NTA 不会永远存在。要么每几个月制作一次新库存，要么将等分试样冷冻以进行长期储存。定期检查 CW-EPR 光谱是否有任何可观察到的变化，这可能表明 Cu(II)NTA 库存已退化（请参阅 CW-EPR 设置的下一节）。如果在 Cu(II)NTA 溶液中形成任何沉淀物，请准备或解冻新批次并检查 CW-EPR 光谱。
2. Cu(II)NTA配合物的CW-EPR
a. 样品制备
i. 在 1.5 ml Eppendorf 管中，在 MOPS 缓冲液中制备 100 μl 200 μM Cu(II)NTA。添加 20 μl 甘油作为冷冻保护剂。涡旋 Eppendorf 管以混合溶液。
ii. 在单独的 Eppendorf 管中，在 MOPS 缓冲液中制备 100 μl 200 μM Cu(II)SO 4 。加入 20 μl 甘油并涡旋。
iii. 将所有 120 μl Cu(II)NTA 和 Cu(II)SO 4样品移入单独的石英 EPR 管中。或者，可以使用 Hamilton 注射器和 PTFE 管通过 Luer 锁附件将样品转移到EPR 管中。与氮氧自由基不同，石英背景很容易与 Cu(II) 光谱区分开来。此外，在硼硅酸盐上使用石英是因为石英不易破碎。
iv. 小心摇动 EPR 管，直到溶液沉淀在底部。
v. 可选：用薄层 PTFE 胶带覆盖 EPR 管的开口端。这有助于防止由于大气水而在 EPR 管内积冰。这也有助于防止样品卡在谐振器中。或者，可以用精密密封橡胶隔垫盖住管子。
vi. 将足够的液氮倒入 350 毫升杜瓦瓶中，以淹没 EPR 样品溶液。将 EPR 样品放入液氮中冷冻。请注意，使用液氮冷冻样品速度较慢，因此建议对生物大分子采用更快的程序来减少蛋白质构象和/或动力学的变化（参见下面的步骤 B2e）。尽管添加了甘油作为冷冻保护剂，但 EPR 管在冷冻时会破碎，因此建议使用适当的 PPE（护目镜和冷冻剂保护手套）。对于冷冻保护剂百分比较高的样品，试管破裂的风险会降低。样品冷冻后，可置于 -80 °C冰箱中长期保存或立即运行。
b. CW-EPR
i. 使用液氮将 MD5 谐振器冷却至 80 K。请参阅 ElexSys E680 EPR 光谱仪随附的 Bruker 手册来调整和设置 CW-EPR 实验。将 Cu(II)SO 4样品插入谐振器并调整光谱仪。
ii. EPR 仪器冷却至 80 K 并调谐后，将参数设置为：
1) 调制频率 = 100 kHz
2) 调制幅度 = 4 G
3) 调制相位=下一步确定，从0开始
4) 谐波 = 1
5) 平滑点 = 0
6) 接收器增益 = 60 dB
7) 转换时间 = 20.48 毫秒
8) 中心场 = 3100 G，请注意，不同的微波频率可能需要不同的中心场以在频谱周围有足够的基线
9) 扫描宽度 = 2000 G
10)如果可能，打开正交检测
iii. 首先，确定调制相位。运行快速 CW-EPR 实验。如果正交检测打开，则对频谱进行相位直到信号为实数，即虚数中的信号最小化（处理→变换→相位）。将此阶段插入步骤 A2b.ii.3) 中提到的调制阶段。如果正交检测关闭，则在各个阶段运行 CW-EPR 实验，直到频谱信号最小化（这意味着一切都在想象中）。然后，将相位改变 90°，使信号 100% 真实。如果信号为负，则将相位再改变 180°。
iv. 一旦频谱被定相，对 CW-EPR 实验进行信号平均，直到信噪比达到可接受的水平。作为参考，图 1 中的数据是在 60 次扫描或大约 20 分钟内采集的。
v. 如布鲁克手册中所述，解调并移除 Cu(II)SO 4样品。重复步骤 A2b.i-iv。对于 Cu(II)NTA 样品。
vi. 解调并去除 Cu(II)NTA 样品。用空白样品重复步骤 A2b.i-iv。在这种情况下，空白包含 100 μl MOPS 缓冲液和 20 μl 甘油。空白 CW-EPR 光谱的噪声水平应等于或小于其他光谱。
vii. 背景减去两个 EPR 谱。
1) 将 Cu(II)SO 4光谱设置为主要光谱，将背景设置为次级光谱。
2) 将背景与 Cu(II) 光谱中观察到的类似特征对齐。要在 XEPR 中对齐，请转到处理 → 转换 → 左移/右移。这是必要的，因为频率的细微差异会导致频谱相互偏移。图 1C 显示了对齐的背景信号。
3) 更改背景强度，使背景峰强度与 Cu(II)SO 4光谱中观察到的强度相匹配。转到处理 → 代数 → 常数运算。
4) 从 Cu(II)SO 4 中减去背景信号。转到处理 → 代数 → 初级 - 次级。
5) 在 XEPR 窗口的左侧，转到基线校正 → 多项式 → 定义区域。突出显示 Cu(II)SO 4信号左侧和右侧的基线。选择能够很好地拟合背景的最小阶多项式，然后单击“减去线”。图 1D 包含背景和基线减去 CW-EPR Cu(II) 光谱。
6) 如果使用正交检测，提取实部处理→复杂→实部。这是将用于所有分析的 CW-EPR 光谱。
7) 对 Cu(II)NTA 样品重复步骤 1)-6)。
8) 两个光谱应该看起来彼此不同。如果去除背景后Cu(II)NTA 看起来与 Cu(II)SO 4相似，则 Cu(II)NTA 合成不完整，需要重做。
viii. 请参阅数据分析的 A 部分以模拟 CW-EPR 光谱。

图 1. 初步的 Cu(II)NTA 观察结果。
A. 10 mM Cu(II)NTA 与 50 mM Cu(II)SO 4 相比。尽管浓度较低，但 Cu(II)NTA 具有比 Cu(II)SO 4更深的蓝色。这是一种简单粗暴的方法来确认络合是否有效。B. dHis 基序的示例定位显示为 α-螺旋位点（残基 i 和 i+4）和 β-折叠位点（残基 i 和 i+2）。蛋白质 GB1 (pdb: 2QMT) 用于涉及 Cu(II)NTA 标记的 dHis 的所有样本数据。C. 在任何背景扣除之前，Cu(II)NTA 的原始 CW-EPR 光谱位于顶部（灰色），下方是空白样品 CW-EPR（黑色虚线）。与 Cu(II)NTA 光谱重叠的黑色实线是最小化的虚部。谐振器信号用五边形标记，石英 EPR 管信号用星形标记。请注意，当适当退火时，纯度较高的石英将具有较弱的信号。背景光谱发生了偏移，因此这些特征是对齐的。Cu(II)NTA 光谱范围从大约 2,700 到 3,500 G。这比氮氧化合物光谱更广泛，因此重要的是在 Cu(II) 信号的任一侧具有更长的基线以进行充分的背景扣除。D. 显示了 Cu(II)NTA ± dHis 和 Cu(II)SO 4的背景扣除 CW-EPR 光谱。请注意，由于 q 因子、实验频率以及每个样品使用不同石英管的细微差异，背景扣除很少是完美的。但是，背景扣除应尽可能优化，以避免分析过程中出现困难。右边的插图指出了任何 Cu(II) CW-EPR 光谱的两个重要特征，g II （与磁场成反比）和 A II分裂（以高斯为单位）。

B. 蛋白质标记和样品制备
1. 生成带有一个或两个 dHis 突变的突变蛋白。要设计突变蛋白质，必须知道蛋白质的二级结构。对于 α-螺旋位点，组氨酸突变必须位于氨基酸残基 i 和 i+4 上。对于 β-折叠位点，组氨酸突变位于残基 i 和 i+2 上（图 1B）。如果目标是进行动力学测量，则在蛋白质上进行一个 dHis 突变。对于两个位点之间的距离测量，两个 dHis 突变是必要的，除非蛋白质形成寡聚体。参考之前关于蛋白质表达和纯化的工作（Gräslund等，2008）。
2. 蛋白质标记
a. 在 1.5 ml Eppendorf 管中，在 MOPS 缓冲液中制备含有 200 μM Cu(II)NTA 和 200 μM dHis（例如，100 μM 单体和两个 dHis 麦粒）的 100 μl 样品。要确定蛋白质浓度，可以在线找到一种估算摩尔吸收率的简单方法（https://web.expasy.org/protparam/）。由于标记反应是放热的（Wort等人，2019 年），因此在 4°C 下孵育约 30 分钟很重要。标记时间可能受标记位点的影响，可以通过紫外-可见光谱准确确定（Gamble Jarvi等人，2020a）。
b. 加入 20 μl 甘油并涡旋。甘油防止冷冻过程中结晶。除了防止 EPR 管破碎外，甘油还允许样品冻结在玻璃状状态，从而延长 T m弛豫时间（Casto等人，2021 年）。
c. 使用带有 PTFE 管的微量移液器或 Hamilton 注射器将 120 μl 蛋白质样品转移到单独的 EPR 管中。小心摇动 EPR 管，直到溶液沉淀在底部。
d. 可选：用 PTFE 胶带或精密密封橡胶隔垫盖住 EPR 管的开口端。
e. 在预冷的丙烯 + 丙烷 (MAP-Pro) 中冷冻样品，请参阅图 2 了解冷冻设置。由于两个原因，这比浸入液氮中更快地冻结样品。首先，液氮将始终处于其沸腾温度。因此，当浸入液氮中时，任何温暖的东西都会导致氮气沸腾。这会产生气体屏蔽，使样品与热接触不良，称为莱顿弗罗斯特效应 (Walker, 2010)。由于 MAP-Pro 冷却到其沸点以下，因此当温热的样品浸入其中时，它不会沸腾。此外，MAP-Pro 具有与液氮相似的热容量。或者，样品可以在液氮中冷却，但这是一个较慢的过程，可以让蛋白质采用其最稳定的构象，而不是生理温度下的所有构象（Georgieva等，2012）。更快的冷冻方法，例如浸入液化乙烷（Russo等人，2016 年）或快速冷冻淬火（Hett等人，2021 年），也消除了这种担忧。

图 2. EPR 管样品冷冻设置。
有关冻结协议的更多信息，请参见视频 1。 A. 带有 RP3E 气体调节器的 MAP-Pro 气瓶。附带的是 5/16 英寸内径管，并插入了移液器吸头。B. 用于冷冻样品的带盲孔的金属圆柱体。一根金属丝缠绕在金属圆柱体上，用作把手来安全地移动冷金属。C. 金属圆筒在液氮中预冷。在引入 MAP-Pro 之前，等待氮气停止快速沸腾。确保金属圆筒内部的所有液氮也已清空。D. 打开 MAP-Pro 气罐，直到气体流出。注意气体流速：流速过慢会导致MAP-Pro在足够多的时间内液化，导致MAP-Pro冻结在金属气瓶中；流速太快会导致大量过量的气体被泵入大气中；如上图所示，良好的流速会导致云几乎不妨碍观察金属圆柱体中的孔。将 MAP-Pro 气体插入孔中，吹散或挥动云层以查看气缸。一旦钢瓶充满液体，最多大约30 秒，插入 EPR 样本大约一秒钟。取出冷冻的 EPR 样品，放入装有液氮的单独杜瓦瓶中。

视频 1. 快速冷冻 EPR 样本。

C. Cu(II)NTA标记蛋白的EPR实验
1. 获得各向异性 CW-EPR 光谱
a. 遵循步骤 A2b 中的协议。
b. 数据分析的 A 部分概述了在 MOPS 中与 dHis 结合的 Cu(II)NTA 的预期 g II和 A II值。请注意，当 Cu(II)NTA 处于不同缓冲区时，这些值可能会发生变化（Gamble Jarvi等人，2020a）。转到数据分析的 A 部分以模拟 CW-EPR 频谱。通过使用自由和结合的 Cu(II)NTA 模拟 CW-EPR 光谱来获得标记效率。可以使用以下等式从模拟光谱计算标记效率：或者，可以根据 DEER 调制深度计算标记效率（Lawless等人，2017 年；Gamble Jarvi等人，2020b）。标记效率也可以从从 UV-Vis（Gamble Jarvi等人，2020a）和 RIDME 脉冲 EPR 实验（Wort等人，2021a）获得的 K D曲线中获得。
2. 脉冲 EPR 初步实验
a. 用液氮将 MD5 谐振器冷却到 80 K。
b. 有关脉冲实验设置，请参阅 Bruker 手册。此外，之前发表了一个有用的协议，包括更详细地概述的初步脉冲实验（Vicino等人，2021 年）。运行场扫描频谱，中心场和扫描宽度等于 3,100 G 和 2,000 G（图 3A）。
c. 在最大强度场进行章动实验，以确定未来实验的最佳脉冲长度（图 3B）。Xepr 只能做偶数长度的脉冲，所以改变衰减直到 π/2 脉冲长度是偶数。
d. 运行回声衰减实验，也称为 2 脉冲 ESEEM 实验（图 3C）。如果 ESEEM 调制不支配信号，则将时域信号拟合到拉伸指数衰减以获得 T m弛豫时间。
在 PulseSPEL 窗口中，在以下文件夹中加载反演恢复实验 (InvRec_ESE.exp)：
xeprFiles/PulseSPEL/shared/Standard/Spel2009/Relaxation
e. 使用以下参数进行反转恢复实验（单位为 ns，除非另有说明）：n = 1，d30 = 2000，d1 = 200，d2 = 1000，SRT = 1500 你s, h = 10, p0 = π/2在步骤 C2c 中确定的脉冲长度，p1 = 在步骤 C2c 中确定的 π 脉冲长度，p2 = π 脉冲长度，d0 和 pg 确定由 Vicino等人概述。(2021)。
反转恢复完成后，按照图 3D 中的信息计算 T 1 。在所有其他 80 K 脉冲实验中使用的冲击重复时间 (SRT) 等于 5 × T 1 。

图 3. 所有其他脉冲技术所需的脉冲 EPR 数据。
A. 回波检测到与 dHis 结合的 Cu(II)NTA 的场扫描光谱。实验以大约 3,350 GB 的最大强度进行 Nutation 实验，以确定有效自旋反转的最佳脉冲长度。第一个最小值是 π 脉冲长度，在本例中为 12 ns。因此，π/2 脉冲长度为 6 ns。C. 显示回声衰减 (2pESEEM) 时域信号。该实验可用于确定 DEER 实验中允许的最大偶极演化时间，因为 T m是相位记忆弛豫时间。记下回声衰减何时处于基线，因为这代表 DEER 脉冲序列的时间限制。对于此示例，基线约为 3 μs。因此，长于 3 μs 的脉冲序列不太可能在 DEER 中产生足够的回声。与氮氧自由基不同，氮 ESEEM 通常主导回声衰减，因此用拉伸指数衰减拟合以确定 T m可能很困难。如果需要 T m ，克服这个问题的一种方法是使用较软的脉冲来削弱 ESEEM 调制。D. 显示了 80 K 时 Cu(II)NTA 的反转恢复序列。该实验对于测量在未来实验中使用的必要 SRT 很重要。SRT 在每个测量数据点之间应用延迟，以确保自旋弛豫回到平衡。等于纵向弛豫时间 (T 1 ) 5 倍的 SRT允许在每次实验之间恢复 99% 的自旋磁化强度。Ť 1可以通过拟合反转恢复到以下公式确定：。A 是幅度，γ是 0 到 1 之间的拉伸参数，τ是脉冲间隔（时域信号中的 x 轴变量）。改变 A、T 1和γ直到拟合最佳。EPR 仪器具有最小 SRT ，因此如果测量的 SRT 太短，请延长 SRT，直到错误消息消失。上述数据是在 SRT = 400 μs 时获得的。三脉冲电子自旋回波包络调制 (3pESEEM)
a. 从 GitHub 下载 ESEEM 程序和参数文件（请参阅软件）。
b. 在参数窗口的采集选项卡中，选中“从 PulseSPEL 运行”并打开 PulseSPEL 窗口。
c. 单击“加载变量”。定义。” 并加载在步骤 C3a 中下载的变量定义文件“ESEEMvar.def”。在 PulseSPEL 窗口中单击“编译”。然后单击“加载程序”并加载 3pESEEM.exp 文件。再次点击“编译”。
d. 在“参数”窗口中，将实验和相位循环都设置为“3pESEEM 设置”。在 PulseSPEL 变量文本框中输入以下参数（单位默认为 ns，除非另有说明）。
i. d0 = 0
ii. pg = 0
iii. d1 ≈ 148，取决于磁场。该值对于在氢盲点进行实验很重要。要计算最佳 d1，请下载 GitHub 上的 excel 文档。请注意，脉冲是非理想的，换句话说，脉冲具有非零持续时间，因此具有有限的频率带宽。因此，可能有必要在计算出的 d1 附近尝试一些值，以优化氢 ESEEM 抑制。
iv. d2 = 288
v. dx = 0, dy = 0
vi. d30 = 16
vii. p1 是在步骤 C2c 中确定的 π 脉冲长度。
viii. p0 是 p1 的一半。这两个数字必须是偶数。
ix. SRT 在步骤 C2e 中确定。请务必在数字后添加“us”，因为单位不是 ns（例如：500 us）。
x. n = 1
xi. 一 = 1024
xii. 小时 = 100
e. 在 PulseSPEL 窗口中，单击验证。如果没有出现错误，则运行设置实验。如果实验未切换到 PulseSPEL 模式（步骤 C3b）或程序检测到不合逻辑的参数，通常会出现错误。确保一切输入正确。如果脉冲序列超出光谱仪的内存，则可能会出现另一种可能的错误。这可以通过降低步长 d30 或减少脚本顶部的点数来解决。
f. 检查 3pESEEM 回波的相位。如果回波未定相，请在 Receiver Unit 选项卡下的 FT Bridge 窗口中更改信号相位。继续改变阶段并重新运行设置，直到一切都真实且积极。找到回波的起点 (d0) 和回波的宽度 (pg)。在 PulseSPEL 变量文本框中设置这些值。
图 4. 3pESEEM 时域信号的实部和虚部相位。
真正的组件（黑色）是未来所有实验中都应该使用的组件。虚部（灰色）应该被定相，以便不存在调制。

g. 将实验和相位循环更改为“3pESEEM”。在 PulseSPEL 窗口中单击验证。如果没有出现错误，则将扫描次数 (n) 设置为任意大的值（例如 n = 10000）并运行 3pESEEM 实验。如果出现错误，请返回并确保正确输入所有参数。3pESEEM 实验大约需要 12 小时才能在 80 K 下获得足够的信噪比，但可能会更短或更长，具体取决于标记效率、Cu(II) 原子总数和脉冲长度。或者，3pESEEM 可以在 18 K 下获得，通常在 1 小时内。
h. 一旦 3pESEEM 准备好停止，将 n 设置为比当前扫描次数高 1。这允许当前扫描完成而不会中断。对时域信号进行相位调整，使所有调制都处于实相。有时，相位并不完美，信号仍保留在虚部中（图 4）。如果是这种情况，则傅立叶变换将在零频率处显示一个强烈的峰值。为防止出现这种情况，请转到处理 → 复杂 → 实部。
i. 有关 3pESEEM 的更多信息，请参阅数据分析下的 B 部分。
4. 双电子-电子共振 (DEER)/脉冲电子双共振 (PELDOR)
a. 先前概述了 DEER 设置和分析（Vicino等人，2021 年）。该协议将仅讨论与硝基氧自由基描述的工作在设置上的差异。对于在较高浓度下不稳定的蛋白质，可以在亚微摩尔浓度下获得弛豫诱导偶极调制增强 (RIDME) 的距离测量值（Ackermann等，2021）。
b. 使用液氦将 MD5 谐振器冷却至 18 K。
c. 将 EPR 样本插入 MD5 谐振器并按照 Bruker 手册进行调整。
d. 在设置 DEER 实验之前，请按照 18 K 的步骤 C2b-e。
e. 将中心场设置为在场扫描光谱中观察到的最大强度，大约为 3,350 G。
f. 在两个相距 150 MHz 的频率上运行章动实验。较低的频率是泵浦频率 (ν B )，较高的频率是观察者频率 (ν A )。这些脉冲应该尽可能短，以最大化脉冲的激励带宽。
g. 在 ν B处重新运行场扫描光谱。将中心场设置为最大强度。然后将频率更改为 ν A 。
h. 继续遵循 Vicino等人的协议。(2021) 运行 DEER 实验。设置 DEER 时，请务必考虑由回声衰减实验（步骤 C2d）确定的最大允许偶极演化时间。
5. 室温动态测量
a. 在 MOPS 中制备 25 μl 300 μM Cu(II)NTA 和 900 μM 蛋白质。用 Cu(II)NTA 对蛋白质进行欠载可确保生成的 CW-EPR 光谱具有可忽略不计的游离 Cu(II)NTA 成分。对于较小的蛋白质 (<50 kDa)，样品可以包含 25% w/v Ficoll 以减缓全局翻滚并最大限度地减少其对 CW-EPR 线形的影响（López等，2009）。
b. 通过毛细作用将溶液吸入石英毛细管中，并用毛细管密封剂密封同一端。将毛细管插入 250 毫米长的石英管中，并将其插入 SHQE 高分辨率谐振器。
c. 按照 Bruker 手册设置和调整光谱仪。
d. 将 CW-EPR 参数设置为：
i. 调制频率 = 100 kHz
ii. 调制幅度 = 6 G
iii. 调制相位=下一步确定，从0开始
iv. 谐波 = 1
v. 平滑点 = 0
vi. 接收器增益 = 60 dB
vii. 转换时间 = 20.48 毫秒
viii. 中心场 = 3200 G，请注意，不同的微波频率可能需要不同的中心场才能在频谱周围有足够的基线
ix. 扫描宽度 = 1600 G
x. 如果可能，打开正交检测
e. 与步骤 A2b.iii 类似，确定调制相位。如果信号太弱而无法快速找到调制相位，则在相位 = 0 和相位之后运行实验。
f. 运行 CW-EPR 实验，直到足够的信噪比，大约 12 小时。
g. 使用 MOPS 缓冲区重复步骤 C5a-C5f 以获得背景光谱。
h. 按照步骤 A2b.vii 进行背景减去 CW-EPR 光谱。用游离的 Cu(II)NTA 或 Cu(II)NTA + 野生型蛋白质重复这些步骤，以确认获得的光谱包含 dHis 结合的 Cu(II)NTA。
i. 请参阅数据分析的 C 部分以模拟室温 CW-EPR 光谱。

数据分析

A. 80 K CW-EPR 光谱分析
1. 粗略计算Cu(II)NTA 光谱的 g II和 A II 。图 5 中概述了 g II和 A II的预期值。当 Cu(II)NTA 复合物在不同的缓冲溶液中时，这些值可能会有所不同。
A II可以从图 1 中概述的峰分裂中测量。
2. 使用 MATLAB 中的 EasySpin 工具箱（Stoll和 Schweiger，2006 年）模拟 Cu(II)NTA 和 dHis 结合的 Cu(II)NTA 光谱。GitHub 上提供了用于模拟可用于 EasySpin 的 Cu(II) CW-EPR 光谱的脚本（请参阅软件部分）。EasySpin 脚本识别所有参数和必要信息，因此需要最少的 MATLAB 知识。在自动拟合之前使用手动拟合代码拟合光谱，以确保自动拟合代码不会陷入局部最小值并产生不良拟合。两个 Cu(II) 光谱应适合不同的参数。如果 dHis 结合的 Cu(II)NTA 需要额外的成分，请尝试使用从游离 Cu(II)NTA 获得的参数进行模拟，以检查络合是否完成。同样，可以拟合 Cu(II)SO 4 CW-EPR 光谱以与 Cu(II)NTA 进行比较，以查看络合是否完成。

图 5. EasySpin 模拟 CW-EPR 光谱。
显示了带有 dHis（顶部）和没有 dHis（底部）的 Cu(II)NTA 的 CW-EPR 光谱。这些是首先通过手动模拟定位峰获得的，然后允许自动拟合脚本完成拟合。游离的 Cu(II)NTA 需要两个组分才能获得足够的拟合，这可能是由于 NTA 与 Cu(II) 原子的多种配位几何结构（Gamble Jarvi等人，2020a）。该表显示了用于拟合数据的相关参数。超精细值 A ⊥和 A II以高斯为单位。请注意，对于这些样本，A ⊥太小而无法观察，因此 A ⊥通常与线加宽参数不明确。

B. 3pESEEM
1. 将 3pESEEM 时域信号拟合到拉伸指数衰减或双指数衰减，以更适合的为准。减去指数衰减，如图 6A 所示。
2. 转到处理 → 转换 → FFT 并单击转换。然后转到 Processing → Complex → Absolute 以获得 3pESEEM 频谱。如果傅里叶变换在 0 频率有一个强烈的信号，那么背景减法需要重新进行。尝试使用不同的指数拟合，或使用区域限定符仅拟合 3pESEEM 时域信号的无特征尾部。
3. 与其他配位位点相比，与 dHis 结合的 Cu(II) 具有独特的 3pESEEM 光谱（图 6B）。核四极杆相互作用 (NQI) 以 0.5、1.0 和 1.5 MHz 的频率发生（Shin和 Saxena，2011）。双量子 (DQ) 频率约为 4-5 MHz。检查 2.8 MHz 附近的频率，因为这表明骨干协调。

图 6. 3pESEEM 分析。
A. 显示了与 dHis 协调的 Cu(II)NTA 的 3pESEEM 时域。3pESEEM 时域信号（灰色实线）的背景（黑点）符合双指数衰减。减去背景的时域以黑色显示。B. 背景减去时域信号的傅立叶变换。这具有与 dHi 协调一致的峰值。请注意，三个 NQI 峰值 (~1 MHz) 并不总是很好解析。

C. 室温 CW-EPR 光谱
1. 有关使用宏观无序膜域 (MOMD) 的非线性最小二乘法 Levenberg-Marquardt 分析 (NLSL) 理解模拟的详细信息，请参见先前发表的工作（Budil等人，1996 年）。
2. 模拟室温 Cu(II) 光谱时，请使用以下参数：
a. 根据实验和模拟的各向异性光谱确定的输入参数。这包括 gxx、gyy、gzz、Axx、Ayy、Azz 和 b0。
b. 让 in2 = 3
c. 让 betad = 90
d. 让北 = 20
e. 基本设定参数：
lemx = 20
lomx = 19
公里数 = 10
毫米 x = 6
ipnmx = 4
f. 改变 c20、gib0 和 rbar。
g. 作为起始值，让 c20 = 1、gib0 = 40 和 rbar = 8

食谱

1. 100 mM MOPS 缓冲液
45 毫升去离子水
1.05 克拖把
0.29 克氯化钠
将 pH 值调整为 7.4
用去离子水稀释至 50 ml

致谢

这项研究由美国国家科学基金会 (NSF BSF MCB-2006154) 资助。该协议应结合我们最近的评论（Gamble Jarvi等人，2021 年）一起阅读。该协议建立在 Saxena 小组先前关于 Cu(II) 标记的研究文章（Ghosh等人，2018 年；Gamble Jarvi等人，2020a）和室温动态测量（Singewald等人，2020 年）的基础之上。

利益争夺

作者声明没有竞争利益或利益冲突。

参考

1. Ackermann, K.、Wort, JL 和 Bode, BE (2021)。蛋白质中的纳摩尔脉冲偶极 EPR 光谱：Cu II -Cu II和氮氧化物-氮氧化物案例。J Phys Chem B 125(20): 5358-5364。
2. Budil, DE、Lee, S.、Saxena, S. 和 Freed, JH (1996)。使用改进的 Levenberg-Marquardt 算法对一维和二维慢动作 EPR 谱进行非线性最小二乘分析。J Magn Reson, Ser A 120(2): 155-189。
3. Casto, J.、Mandato, A. 和 Saxena, S.（2021 年）。dHis-troying Barriers: Deuteration 为提高 Cu 2+标签的灵敏度和可达距离提供了途径。J Phys Chem Lett 12(19): 4681-4685。
4. Cunningham, TF、Putterman, MR、Desai, A.、Horne, WS 和 Saxena, S. (2015)。双组氨酸 Cu 2+结合基序：用于电子自旋共振距离测量的高刚性、位点特异性自旋探针。Angew Chem Int Ed Engl 54(21): 6330-6334。
5. Gaffney, BJ, Bradshaw, MD, Frausto, SD, Wu, F., Freed, JH 和 Borbat, P. (2012)。在通往脂肪氧化酶活性位点的入口处定位脂质。生物物理学杂志103(10): 2134-2144。
6. Gamble Jarvi, A.、Bogetti, X.、Singewald, K.、Ghosh, S. 和 Saxena, S. (2021)。Going the dHis-tance：蛋白质和核酸的定点 Cu 2+标记。ACC 化学研究54(6)：1481-1491。
7. Gamble Jarvi, A.、Casto, J. 和 Saxena, S. (2020a)。使用双组氨酸基序对定点 Cu 2+标记的缓冲作用。J Magn Reson 320：106848。
8. Gamble Jarvi, A.、Cunningham, TF 和 Saxena, S.（2019 年）。通过基于Cu 2+的 EPR 距离测量有效定位蛋白质内的天然金属离子。物理化学化学物理21(20): 10238-10243。
9. Gamble Jarvi, A.、Sargun, A.、Bogetti, X.、Wang, J.、Achim, C. 和 Saxena, S. (2020b)。用于通过 EPR 和 MD 模拟确定 PNA 构象和动力学的基于Cu 2+的距离方法和力场参数的开发。J Phys Chem B 124(35): 7544-7556。
10. Georgieva, ER, Roy, AS, Grigoryants, VM, Borbat, PP, Earle, KA, Scholes, CP 和 Freed, JH (2012)。冷冻条件对距离及其分布的影响来自双电子电子共振 (DEER)：双自旋标记 T4 溶菌酶的研究。J Magn Reson 216：69-77。
11. Ghosh, S., Lawless, MJ, Rule, GS 和 Saxena, S. (2018)。Cu 2+ -次氮基三乙酸复合物改善了α-螺旋双组氨酸位点的负载，用于通过脉冲ESR进行精确距离测量。J Magn Reson 286：163-171。
12. Gräslund, S., Nordlund, P., Weigelt, J., Hallberg, BM, Bray, J., Gileadi, O., Knapp, S., Oppermann, U., Arrowsmith, C., Hui, R., Ming , J.等。(2008)。蛋白质生产和纯化。Nat 方法5(2): 135-146。
13. Hett, T., Zbik, T., Mukherjee, S., Matsuoka, H., Bonigk, W., Klose, D., Rouillon, C., Brenner, N., Peuker, S., Klement, R.,等。(2021)。通过将脉冲电子-电子双共振光谱与微秒冷冻超淬火相结合，生物分子构象变化的时空分辨率。J Am Chem Soc 143(18): 6981-6989。
14. Hubbell, WL, Gross, A., Langen, R. 和 Lietzow, MA (1998)。蛋白质定点自旋标记的最新进展。Curr Opin Struct Biol 8(5): 649-656。
15. Jeschke, G. (2012)。蛋白质的 DEER 距离测量。Annu Rev Phys Chem 63：419-446。
16. Klose, D., Klare, JP, Grohmann, D., Kay, CW, Werner, F. 和 Steinhoff, HJ (2012)。模拟与现实：计算机距离预测与 DEER 和 FRET 测量的比较。PLoS 一7(6)：e39492。
17. Klug, C.、Lerch, M. 和 Feix, J. (2021)。氮氧化物自旋标签在结构生物学中的应用。在：氮氧化物。Ouari, O. 和 Gigmes, D.（编辑）。392-419。
18. Lawless, MJ、Ghosh, S.、Cunningham, TF、Shimshi, A. 和 Saxena, S. (2017)。关于使用 Cu 2+ -亚氨基二乙酸复合物通过脉冲 ESR 进行基于双组氨酸的距离测量。物理化学化学物理19(31): 20959-20967。
19. López, CJ, Fleissner, MR, Guo, Z., Kusnetzow, AK 和 Hubbell, WL (2009)。渗透物扰动揭示了自旋标记蛋白质的构象平衡。蛋白质科学18（8）：1637-1652。
20. Mehlenbacher, MR、Bou-Abdallah, F.、Liu, XX 和 Melman, A. (2015)。Ni(II) 和 Cu(II) 次氮基三乙酸和 N-乙酰低聚组氨酸的三元配合物的量热研究。无机化学学报437：152-158。
21. Pannier, M.、Veit, S.、Godt, A.、Jeschke, G. 和 Spiess, HW (2000)。电子自旋之间偶极-偶极相互作用的无死区时间测量。J Magn Reson 142（2）：331-340。
22. Park, SY, Borbat, PP, Gonzalez-Bonet, G., Bhatnagar, J., Pollard, AM, Freed, JH, Bilwes, AM 和 Crane, BR (2006)。趋化受体-激酶组装体的重建。Nat Struct Mol Biol 13(5): 400-407。
23. 普尔，磅（2015 年）。氧化还原生物学和化学中硫醇和半胱氨酸的基础知识。自由基生物医学杂志80：148-157。
24. Qiu, H., Honey, DM, Kingsbury, JS, Park, A., Boudanova, E., Wei, RR, Pan, CQ 和 Edmunds, T. (2015)。半胱氨酸变体对重组人 α-半乳糖苷酶 A 的结构、活性和稳定性的影响。Protein Sci 24(9): 1401-1411。
25. Russo, CJ、Scotcher, S. 和 Kyte, M.（2016 年）。用于手动和半自动低温插入仪器的精密低温恒温器设计。Rev Sci Instrum 87(11): 114302。
26. Sameach, H.、Ghosh, S.、Gevorkyan-Airapetov, L.、Saxena, S. 和 Ruthstein, S.（2019 年）。EPR 光谱检测转录调节器 CueR 的各种活动状态构象。Angew Chem Int Ed Engl 58(10): 3053-3056。
27. Shin, BK 和 Saxena, S.（2011 年）。His13-His14 二元组的两个咪唑环对在生理 pH 值下淀粉样蛋白-β(1-16) 中 Cu(II) 结合的重要贡献及其意义。J Phys Chem A 115(34): 9590-9602。
28. Singewald, K.、Bogetti, X.、Sinha, K.、Rule, GS 和 Saxena, S. (2020)。在生理温度下基于双组氨酸的 EPR 测量允许特定地点阐明酶中的隐藏动力学。Angew Chem Int Ed Engl 59(51): 23040-23044。
29. Stoll, S. 和 Schweiger, A. (2006)。EasySpin，一个用于 EPR 中光谱模拟和分析的综合软件包。J Magn Reson 178（1）：42-55。
30. Todd, AP, Cong, J., Levinthal, F., Levinthal, C. 和 Hubbell, WL (1989)。大肠杆菌素 E1 的定点突变为自旋标签提供了特定的附着位点，其光谱对局部构象敏感。蛋白质6(3)：294-305。
31. Vicino, MF、Hett, T. 和 Schiemann, O. (2021)。使用“点击”化学自旋标记 RNA，通过脉冲电子-电子双共振光谱法测定粗粒结构。生物协议11(9)：e4004。
32. 沃克，J.（2010 年）。沸腾和莱顿弗罗斯特效应。物理学基础：E10-11。
33. Wort, JL, Ackermann, K., Giannoulis, A., Stewart, AJ, Norman, DG 和 Bode, BE (2019)。亚微摩尔脉冲偶极 EPR 光谱揭示了在较低温度下双组氨酸基序的Cu II标记增加。Angew Chem Int Ed Engl 58(34): 11681-11685。
34. Wort, JL, Ackermann, K., Norman, DG 和 Bode, BE (2021a)。用于优化脉冲偶极 EPR 应用中双组氨酸基序的Cu II标记效率的通用模型。物理化学化学物理23(6): 3810-3819。
35. Wort, JL, Arya, S., Ackermann, K., Stewart, AJ 和 Bode, BE (2021b)。脉冲偶极 EPR 揭示了双组氨酸基序 Cu II -NTA 自旋标记对竞争离子的稳健性。J Phys Chem Lett 12(11): 2815-2819。