材料和试剂

1.5 ml Eppendorf 管（Sarstedt，目录号：72.692.005）
移液器吸头（过滤）（Thermo，目录号：TF112-1000-Q [1,000 µl]、T104RS-Q [10 µl]、TF140-200-Q [200 µl]）
24 孔透明板（Corning，目录号：3524-ND）
75 cm 2 T形烧瓶（Grenier，目录号：658-975）
500毫升真空过滤瓶系统，无菌（康宁，目录号：431097）
计数容器（Invitrogen，目录号：C10283）
铝箔 (Nidix)
Vero 细胞（WHO，目录号：RCB 10-87）

注意：用于校准曲线的细胞必须是一样在载体上的细胞。

L-丙氨酸-L-谷氨酰胺（Biological Industries，目录号：03-022-1B）
NutriVero FLEX-20（生物工业，目录号：05-069-1A）
Pen-strep抗生素（生物工业，目录号：03-031-1C）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（生物工业，目录号：02-020-1A）
重组胰蛋白酶-EDTA 溶液（生物工业，目录号：03-079-1A）
台盼蓝溶液（生物工业，目录号：03-102-1B）
Alamar blue（Promega，目录号：G808）
细胞培养基（见配方）

设备

无菌镊子（United Scientific Supplies，目录号：20A00R146）
无菌手术刀（Asp medical，目录号：LDT455）
移液器 200 和 1,000 µl（ThermoFisher Scientific，目录号：4652140、4652080）
37°C 培养箱，含 5% CO 2 （ThermoFisher Scientific，型号：Heracell 150i）
层流罩（ThermoFisher Scientific，型号：Msc-advantage）
冰箱 4°C（Mondial Elite，型号：BEV PV 40 MED）
离心机（Eppendorf，型号：Minispin plus spin）
SPARK 读板机（NEOTEC BIO、TECAN）
细胞计数仪细胞计数 II（Invitrogen，型号：AMQAX1000）
加热器（Talboys，微孔板加热器）

软件

微软 Excel 2010

程序

准备细胞

将细胞保持在 75 cm 2 T 瓶中的细胞培养基（参见配方）中，温度为 37°C，5% CO 2 。
通过在室温 (RT) 下用 5 ml PBS 在室温下洗涤烧瓶一次来收获细胞，然后在 37°C 下用 2 ml 胰蛋白酶-EDTA 孵育 5 分钟。
将细胞从烧瓶中转移到 1.5 ml Eppendorf 管中。
将细胞在室温下以 1,200 × g离心 5 分钟。
用1 ml 移液器除去上清液。
在 37°C 下用 1 ml 细胞培养基重悬沉淀，上下吹打溶液 5 次。
从细胞溶液中取 50 μl 样品，在 1.5 ml Eppendorf 管中与台盼蓝按 1:1 混合。
用细胞仪细胞计数仪计数细胞。
根据需要，通过添加细胞培养基进行稀释，以达到 800,000 个细胞/ml 的浓度（用于校准曲线的原液）。总共需要2毫升。
如果要定量的细胞在与此处描述的培养基不同的培养基中培养和生长，则完全相同的条件应适用于校准曲线的细胞。

准备校准曲线
1. 1毫升新鲜培养基添加至孔1A，2A，3A，4A和5A的一个24孔板.
2. 代替2-毫升800000个细胞/ ml（对于股票校准曲线，参见A9）中公6A。
3. 从 6A 孔中取 1 ml，并将其转移到相邻的孔 (5A) 中。
4. 用 1 ml 移液器轻轻移液五次混合。
5. 从 5A 孔中取 1 ml，并将其转移到相邻的孔 (4A) 中。
6. 用 1 ml 移液器轻轻移液五次混合。
7. 从 4A 孔中取出 1 ml，并将其转移到相邻的孔 (3A) 中。
8. 用 1 ml 移液器轻轻移液五次混合。
9. 从 3A 孔中取 1 ml，并将其转移到相邻的孔 (2A) 中。
10. 用 1 ml 移液器轻轻移液五次混合。
11. 从 2A 孔中取出 1 ml 并处理掉。
12. 1A 孔仅包含 1 ml 新鲜培养基用于阴性对照。
13. 2A-6A 孔分别包含 50,000、100,000、200,000、400,000 和 800,000 个细胞（图1）。
14. 如果样品超过 18 个，请使用另一个 24 孔板。在这种情况下，如上所述在新板中准备另一条校准曲线。

图 1. 校准曲线的制备。

将细胞原液调至 800,000 个细胞/ml，并将其中的 2ml 加入 24 孔板的 6A 孔中。在同一排，其他五个孔（1A-5A）中加入1ml培养基。通过从 A6孔中取出 1 ml 800,000 细胞/ml到相邻孔 (5A) 中，并在整个行中连续稀释，使孔中含有 800,000、400,000、200,000、100,000 和 50,000 个细胞，从而进行系列稀释。行 (1A) 中的最后一个孔留有 1 ml 新鲜培养基作为空白对照。

确定载波上的小区数量
1. 向板中 B、C 和 D 行的所有空孔中加入 1 ml 细胞培养基。
2. 在新鲜的培养基的孔中含有1毫升地方一个载波。
3. 加入100μl阿尔玛蓝的在板所有孔。
4. 用铝箔盖住盘子（避光）。
5. 将板在 37°C 下孵育 1 小时。
6. 使用 Ex 550 nm、Em 580 nm 过滤器在 SPARK 读板器中读取板。

数据分析

将数据传输到 Excel 文件。
在 Excel 文件中，在 A 列上写下校准曲线中使用的细胞数 (50,000-800,000)，并包括空白（无细胞，来自 A1 孔）。
在相邻的列 (B) 中插入相应的荧光强度值。
从所有荧光值中减去空白值，并将结果写在相邻的列 (C) 中。请参见下面的示例（图 2）。

图 2. 用于分析的数据布局示例。

用于校准曲线的细胞数量及其荧光强度值在 Excel 文件的 A 列和 B 列中。从所有值中减去空白的荧光并写在 C 列中。

写下所有其他孔（包含细胞载体）的荧光结果。如果从同一个容器/反应器中取出多个载体，请将所有结果写在同一列中。
将第 5 步的结果（如果来自同一个实验的载体超过一个）平均并减去空白值。
使用基于校准曲线的 excel FORECAST 公式计算每个载体上的细胞数（图 3）。

图 3. 数据分析示例。

记录所有孔（包含载体）的荧光结果并计算它们的平均值。载体上的细胞数量是根据校准曲线通过预测公式计算的。

笔记

可以使用每种类型的小区和载波。
可以使用每个经过验证的 24 孔板。
可以使用带有合适过滤器的每种类型的读板器。
对于每个 24 孔板，使用其自己的校准曲线。
校准曲线的细胞必须是新鲜的，并且可以在每个经过验证的细胞计数器中计数。
该方法可以对不同培养基中的细胞进行定量，但校准曲线必须在相同条件下进行。

食谱

细胞培养基

取 500 毫升 FLEX-20 培养基

添加 5 ml 200 mM L-丙氨酸 L-谷氨酰胺

添加 0.5 毫升 Pen-strep 抗生素

用过滤瓶过滤溶液

致谢

此处描述的协议源自 Rosen等人的工作。(2021)。

利益争夺

作者宣称没有任何利益争夺

参考

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