材料和试剂

无RNase一次性颗粒研杵（Fisher Scientific，目录号：12-141-368）
1.5 ml 管（Eppendorf，目录号：0030120086）
2.0 ml 管（Eppendorf，目录号：0030120094）
玻璃培养皿100 × 22 mm（Duroplan，目录号：217554804）
用于研究的黑腹果蝇菌株由以下几个库存中心维护和分发，如下所示：

布卢明顿果蝇保育中心 (BDSC) ( https://bdsc.indiana.edu/ )

京都股票中心 (DGRC) ( https://kyotofly.kit.jp/cgi-bin/stocks/index.cgi )

维也纳果蝇资源中心 (VDRC) ( https://stockcenter.vdrc.at/control/main )

FlyORF ( https://www.flyorf.ch/ )

国立遗传学研究所飞股票 (NIG-FLY) ( https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/ )

注意：在图 1 和图 2 中，使用了以下菌株：w 1118 (#3605, BDSC) – elav-GAL4/CyO (#8765, BDSC) – UAS-mCD8::GFP/CyO (#30002, BDSC) – UAS-TBPH F/L /TM3, Sb（Godena 等人，2011 年）– UAS-TBPH/CyO（Feiguin 等人，2009 年）。

qPCR 引物 [参见 Romano等人。(2020)]：

Rpl11：正向 5'-ccatcggtatctatggtctgga-3' 反向 5'-catcgtatttctgctggaacca-3'

Dcr-2：正向 5'gcttttatgtgggtgaacaggg-3' 反向 5'-ggctgtgccaacaagaactt-3'

语法：正向 5'-tgttcacgcagggcatcatc-3' 反向 5'-gccgtctgcacatagtccatag-3'

液氮
抗Flag M2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F3165）
Dynabeads TM Protein G（Thermo Fisher，目录号：10003D）
完全游离蛋白酶抑制剂（Roche，目录号：11836170001）
Trizol（Invitrogen，目录号：15596026）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氯化钾（KCl）（默克，目录号：P3911）
氯化镁溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
Na 2 HPO 4 （Thermo Fisher，目录号：10182863）
KH 2 PO 4 （Thermo Fisher，目录号：P285-500）
Tris（Thermo Fisher，目录号：17926）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：436143）
脱氧胆酸钠（DOC）（ThermoFisher，目录号：89904）
尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U5128）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：10197777001）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸）HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Merck，目录号：200-449-4）
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3149）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
RNase OUT，RNAse抑制剂（Thermo Fisher，目录号：10777019）
cOmplete TM ，无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：11873580001）
吐温 20（默克，目录号：9005-64-5）
Triton X-100（默克，目录号：9002-93-1）
氯仿（CHCl 3 ）（默克，目录号：67-66-3）
2-丙醇（默克，目录号：67-63-0）
乙醇（默克，目录号：64-17-5）
SuperScript TM IV VILO TM Master Mix（ThermoFisher，目录号：11756050）
的iQ TM -SYBR ® Green超（Bio-Rad公司，目录号：1708880）
超纯糖原（ThermoFisher，目录号：10814010）
1× PBS（见食谱）
1×蛋白质-mRNA-裂解缓冲液（见配方）
1×蛋白质-蛋白质-裂解缓冲液（见配方）
珠结合缓冲液（见配方）
1×洗涤缓冲液（见配方）
5× Laemmli 缓冲液（见配方）
50 mg/ml 肝素原液（见配方）

设备

立体显微镜（徕卡，型号：M1028）
Glass Dounce 型组织研磨器 1 毫升（惠顿，型号：357538）
DynaMag Spin Magnet Stand（ThermoFisher，目录号：12320D ）
多转子 PTR-35 (Grant-Bio)
离心机 5424 R (Eppendorf)
CFX Connect 实时 PCR 检测系统 (Bio-Rad)
镊子 Dumont n.°5 学生标准尖端 0.1 × 0.06（FST，目录号：91150-20）

软件

ImageJ（韦恩拉斯班德，NIH，https: //imagej.nih.gov/ ）
棱镜（GraphPad，https ://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

UAS-GAL4 系统（Brand 和 Perrimon，1993）通过将 GAL4 驱动原种与在 UAS 激活序列控制下携带感兴趣的 RBP 蛋白的转基因果蝇杂交，允许目标组织特异性基因表达。蛋白质表达可以使用不同的驱动程序（如 GMR-GAL4 或 Elav-GAL4）靶向多个组织和动物隔室，从而可以轻松收集感兴趣的组织。在这些实验的设计中，强烈建议包括表达无关蛋白质（例如，UAS-GFP）的对照后代。

头的集合

选择苍蝇在麻醉下的立体镜 [暴露于二氧化碳 (CO 2 )]。
此时将 20 只麻醉的苍蝇转移到一个空的 1.5 毫升管中。
立即在液氮中快速冷冻管子。
以最大效力涡旋离心管 10 秒。
将管中的内容物倒在冰上的玻璃培养皿上。
用镊子收集头部并将它们转移到装有适当裂解缓冲液的 1.5 ml 管中。
在收集过程中，将管子放在冰中。

注意：免疫沉淀实验所需的后代约为 100 只苍蝇。因此，苍蝇可以在液氮中快速冷冻后在 -80°C 下积累和储存。每管 20 只苍蝇的等分试样是允许在收集时通过涡旋轻松分离头部的最佳解决方案。

珠子的制备
1. 对于每个免疫沉淀样品，必须使用50 μl珠浆（大约1.5 mg 珠）。使用前通过反复倒置彻底混合珠子。
2. 将总珠浆转移到单个 2 毫升管中。
3. 用 2 ml 0.02% Tween 20-PBS 清洗珠子两次，使用磁力架收集珠子并更换缓冲液。
4. 在 0.02% Tween 20-PBS 中以 2-5 mg/ml 的终浓度稀释一抗（本例中为 a-Flag-M2），将其加入洗涤过的珠子中，并在室温 (RT) 下孵育在旋转器上至少放置 10 分钟，以便涂覆珠子。
5. 孵育后，将抗体包被的珠子分装在新的 1.5 ml 管中（每个样品一个）。
6. 在加入含有均质组织的溶液之前，丢弃含有初级抗体的缓冲液。

蛋白质-mRNA 免疫共沉淀

在装有 200 μl蛋白质-mRNA 裂解缓冲液的 1.5 ml 管中堆积 100 个果蝇头。
用杵手动挤压头 2 分钟（在冰上工作）。
将裂解液转移到 dounce 中（用裂解液缓冲液预湿）。
通过将 500 μl新鲜裂解缓冲液添加到 1.5 ml 管中，收集所有匀浆，随后将其添加到 dounce 中，并进行 60 次匀浆。
再机械挤压 2 分钟（在冰上工作）。
将大约700 μl转移到干净的 1.5 ml 管中。
在 4°C 下以 500 × g离心管5 分钟。
通过避免碎片收集大约 600 μl裂解液，并将其转移到新的干净管中。
肝素到裂解物中加入5的最终浓度μ克/米升。
除去100 μ升裂解物，并将其存储作为输入材料（50微升用于蛋白质分析和50 μ升用于RNA提取）。50 μ用于蛋白质分析升等分试样可以直接储存在-80℃，同时600微升Trizol试剂的，用于RNA提取，必须添加到50微升在-80℃下等份它的存储之前。
传输剩余500 μ升裂解物到含有免疫沉淀的抗体包被的珠的1.5ml试管中。
在 4°C 下在圆形旋转器上孵育管子 30 分钟。
温育后，固定在磁体的珠，并回收100 μ每种上清液为“耗尽材料”（50升μ升用于蛋白质分析和50 μ升用于RNA提取）。50 μ升用于蛋白质分析可以储存在-80℃，而600 μ Trizol试剂的升必须在50加入μ升用于RNA提取其保存前在-80℃下。
取出并丢弃剩余的上清液，始终将管子固定在磁铁上，以在去除上清液的同时保留珠子。
用 1 ml 洗涤缓冲液洗涤珠子：加入缓冲液，将珠子转移到旋转器上 10 分钟，将管子固定在磁铁上，然后取出洗涤缓冲液。重复五次，将缓冲液保持在冰上，将旋转器保持在 4°C。
在第五洗涤结束时，将管连接到所述磁铁，转移100之前μ的溶液中，以用于蛋白质分析的新管中的珠升，然后将剩余的900 μ在新管中的珠升在溶液中RNA提取。
固定珠子并丢弃液体。
加入50 μ 1升× Laemmli缓冲液，以指定用于蛋白质提取管中，在95℃下煮沸管5分钟，立即传送到磁体，并收集上清液。
附上指定用于RNA分析，以磁铁的管，除去上清液，并添加600 μ的Trizol的升向管。在室温下将管子放在旋转器上 5 分钟，然后收集上清液，将珠子留在管子中（使用磁铁）。
在这一步，这些材料可以储存在 -80°C。

蛋白质-蛋白质免疫共沉淀

收集在1.5ml管100头填充有100 μ蛋白质-蛋白质裂解缓冲液的升。
在冰上用杵手动挤压头 2 分钟。
转移裂解物进杜恩斯（预湿以裂解缓冲液），与另外的400洗1.5 ml管μ缓冲器的升并将其添加到在杜恩斯裂解物。进行 60 次均质化。
收集匀浆，它转移到新的1.5ml管中，用500洗杜恩斯μ新鲜蛋白质-蛋白质裂解缓冲液的升，并随后将其添加到溶胞产物。
将裂解液在4°C 下以 500 × g离心5 分钟，并收集上清液，避开沉淀物。
100添加μ新鲜蛋白质-蛋白质裂解缓冲液l至沉淀，清洗，并重复离心步骤如前面。避免沉淀，将此上清液添加到已收集的裂解液中，最终裂解液体积约为 1 ml。
取100 μ的裂解物的等分试样升。使用20 μ的该L与裂解液中的蛋白质含量的评价进行。向剩余的80 μ裂解物加20升μ的5升×在95℃Laemmli样品缓冲液，变性5分钟，并储存在-80℃下为“输入”用于SDS-PAGE分析。
对感兴趣的样品和对照进行免疫沉淀必须使用等量的蛋白质，因此向新的 1.5 ml 试管中添加相当于大约 1-1.4 mg 蛋白质量的体积。在样品中加入等量的蛋白质-蛋白质裂解缓冲液。
将裂解物转移到带有免疫涂层珠子的管中，并在 4°C 下在旋转器上进行免疫沉淀 30-60 分钟。
孵育后，将裂解物和珠的管转移至新的1.5毫升管，锚定到所述磁体，并回收80 μ上清液升（“贫原料”）。对此，加入20 μ升的5 × 95℃Laemmli样品缓冲液，变性5分钟，并储存-80℃以下SDS-PAGE。
始终将管子固定在磁铁上，取出并丢弃剩余的上清液。
从磁铁上取下试管，向珠子中加入 1 ml 冰冻的蛋白质-蛋白质裂解缓冲液，然后将它们转移到新的 1.5 ml 试管中。在 4°C 下将其放在旋转器上 10 分钟，然后将管子固定在磁铁上并取出洗涤缓冲液。重复至总共五次洗涤。
在第五洗涤结束时，除去在最后一次洗涤之前转移珠到新的管中，然后锚定管与磁铁，完全除去液体，同时避免与珠子接触，加80 μ蛋白质-蛋白质裂解缓冲液升和20 μ 5升× Laemmli样品缓冲液中，转移至95℃5分钟，然后立即锚固到磁体并收集洗出液。储存在 -80°C 以进行进一步的 SDS-PAGE 分析。

免疫沉淀验证

注意：要确认免疫沉淀，最好运行蛋白质印迹并验证免疫沉淀样品中是否存在您感兴趣的蛋白质。如果可能，最好使用另一种识别免疫沉淀蛋白不同表位的抗体进行蛋白质免疫分析。

按照预制凝胶供应商的说明运行 SDS-PAGE。在免疫沉淀过程中收集的所有样品：输入 (IN)、消耗材料 (DEP) 和免疫沉淀材料 (IP) 必须在同一块凝胶上运行。
像往常一样继续蛋白质印迹；用一抗孵育膜，进行洗涤，然后用二抗孵育。
按照您通常的方案开发免疫印迹。
如果发生良好的免疫沉淀，加载等体积的 IN 和 DEP 材料，与 IN 部分相比，DEP 部分中对应于免疫沉淀目标的信号必须减少。
与模拟物相比，免疫沉淀靶标的信号必须在 IP 组分中富集。在图 1 中，展示了一个西方印迹验证的例子。
如果出现任何问题，请参见表 1。它总结了可能出现的最常见问题及其各自的解决方案。

图 1. SDS-PAGE IP 验证。

在左侧，使用来自黑腹果蝇成虫头部的抗 FlagM2 进行免疫沉淀的蛋白质印迹分析：泳道 1、2 和 3 w 1118 （模拟 - 无标记）；泳道 4、5 和 6 elav -GAL4 >UAS 无关蛋白（标记）；泳道 7、8 和 9 elav -GAL4 >UAS-TBPH F/L （突变和标记）；泳道 10、11 和 12 elav -GAL4 >UAS-TBPH（标记）。泳道 1、4、7 和 10 分别代表输入分数 (IN)，泳道 2、5、8 和 11 代表耗尽分数 (DE)，泳道 3、6、9 和 12 代表免疫沉淀分数 (IP ); 泳道 13 是抗体 (+) 的阳性对照。使用抗 FlagM2 抗体进行免疫沉淀，而使用抗 TBPH 抗体进行免疫印迹。膜的 Ponceau 用作加载控制。在右侧面板上，柱状图量化了实验。IN 和 DE 分数的结果针对每个菌株的输入进行了标准化，IP 分数针对 TBPH 菌株进行了标准化。

免疫共沉淀对照

控制在免疫沉淀实验中极其重要，阴性和阳性都需要。

下面列出的那些可以用作实验的阴性对照：

模拟控制（图 1，泳道 1、2、3）；
用相同标志标记的不相关蛋白质（图 1，泳道 4、5、6）；
感兴趣的蛋白质含有突变，该突变会损害其 RNA 结合或蛋白质-蛋白质相互作用（图 1，泳道 7、8、9）。

作为实验的阳性对照，如果有的话，必须确认一个已知的目标。

RNA提取

将IN、DEP 和 IP 样品（在 -80°C 下储存在 600 μl Trizol 试剂中）转移到冰上。
解冻后，向每管中加入 120 μl 氯仿 (CHCl 3 )，并充分混合 5 秒。
在 RT 中孵育 5 分钟。
在 4°C 下以 12,000 × g离心15 分钟。
回收透明的水相（〜300 μ升），并将其转移到一个干净的1.5ml管中。
1倍体积的异丙醇（添加〜300 μ l）和糖原，以0.2的最终浓度μ克/微升
轻轻颠倒管五次。
要提高产量，请在 -80°C 下放置过夜。
在 4°C 下以 12,000 × g离心30-45 分钟。

丢弃上清液，保留沉淀。
用 1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀。
在 4°C 下以 12,000 × g离心5 分钟，并去除上清液。
重复洗涤。
在 4°C 下以 12,000 × g离心5 分钟。完全去除上清液。
将沉淀重悬在 30 μl无 RNase 的水中。
将 RNA 储存在 -80°C。

逆转录聚合酶链反应

使用 Superscript Vilo Master Mix 将1 μg RNA 逆转录为 cDNA。
在水中稀释 cDNA 1:10。
样品已准备好使用您感兴趣的引物进行 qPCR（有关引物序列和参考文献，请参阅材料和试剂）。
对于定量PCR，使用2 μ稀释的cDNA的升与IQ-的Sybr Green超。
PCR 定量条件为：95°C 3 min 1 个循环；40 个循环，95°C 10 秒，60°C 30 秒。
图 2 显示了一个结果示例（来自 Romano等人，2020）：

图 2.黑腹果蝇成体头部由 Flag-M2 标记的 TBPH (Elav>TBPH) 及其突变体 TBPH-F/L (Elav>TBPH F/L )免疫沉淀的 mRNA 的 RT-qPCR 分析。

所述切片机-2和突触富集褶皱被称为rpl11 （持家）（改编自罗马诺等人。，2020）。

蛋白质分析

IN、DEP 和 IP 样品均在 1×Laemmli 上样染料中，储存在 -80°C，在 95°C 变性 5 分钟后，可以按照制造商的说明在预制 SDS-PAGE 凝胶中运行。
SDS-PAGE 后，按照您通常的方案进行蛋白质印迹。有关此子协议的更多信息，请参阅 Romano等人。（2014 年、2018 年、2020 年）。
必须针对您的免疫沉淀蛋白质（可能使用针对不同蛋白质表位的抗体）进行免疫印迹以确认免疫沉淀，并使用针对您感兴趣的蛋白质的抗体来验证可能的相互作用。

数据分析

RT-qPCR 分析

要计算富集倍数，请使用 Livak 和 Schmittgen (2001) 中的以下等式：

2 -ΔΔCT

结果必须来自三个独立的实验，差异由t检验确定( P < 0.05)。

蛋白质强度定量

使用 NIH ImageJ 对蛋白质条带进行量化。

简而言之，在 ImageJ 中打开西方图像，从 ImageJ 工具栏中选择“矩形选择”工具，然后选择感兴趣的波段。
按 Ctrl+1 并按 Ctrl+2 将相同的矩形选择拖动到所有其他波段，重复直到最后一个波段。
按 Ctrl+3，将打开一个直方图。
从 ImageJ 工具栏中选择“直线”工具，并用线关闭每个选择的底部。
从 ImageJ 工具栏中选择“魔杖”工具，然后在每个直方图中单击。
将出现面积和百分比表，并且可以将它们复制到 Excel。
每个蛋白质条带的强度除以其加载控制的强度。
结果可以绘制在图表中。

笔记

表 1. 故障排除

食谱

1×PBS

137 毫米氯化钠

10 mM Na 2 HPO 4

1.8 mM KH 2 PO 4

2.7 毫米氯化钾

调整到 pH 值 7.4

高压灭菌并在 4°C 下储存

1×蛋白质-mRNA裂解缓冲液

150 毫米氯化钠

0.5 mM EDTA

20 mM HEPES

10% 甘油

0.1% 海卫 X-100

1 毫米 DTT

RNase 输出 (0.2 U/μl)

蛋白酶抑制剂 (1×)

调整到 pH 值 7.6

挤压后加入0.005 μg/μl肝素

1×蛋白质-蛋白质裂解缓冲液

20 mM Tris

酸碱度 7.5

110 毫米氯化钠

0.5% 海卫 X-100

蛋白酶抑制剂 (1×)

珠结合缓冲液

PBS 1× pH 7.4

0.02% 吐温 20

洗涤缓冲液

150 毫米氯化钠

0.5 mM EDTA

20 mM HEPES

10% 甘油

0.1% 海卫 X-100

1 毫米 DTT

RNase 输出 (0.2 U/μl)

蛋白酶抑制剂 (1×)

0.2% DOC

0.5 M 尿素

调节至 pH 7.5

5× Laemmli 样品缓冲液

300 mM Tris-Cl，pH 6.8

50% 甘油

10% 安全数据表

0.05% 溴酚蓝

50 毫克/毫升肝素原液

通过将肝素粉末溶解在蒸馏水中制备 50 mg/ml 的储备溶液

等分试样可在 -20°C 下储存

致谢

目前的工作得到了 ICGEB 校内资金的支持。该协议是根据先前发表的工作改编和修改的（Godena等人，2011 年；Romano等人，2014 年和 2020 年）。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

参考

Brand, AH 和 Perrimon, N. (1993)。靶向基因表达作为改变细胞命运和产生显性表型的一种手段。发展118（2）：401-415。
de Boer, EMJ, Orie, VK, Williams, T., Baker, MR, De Oliveira, HM, Polvikoski, T., Silsby, M., Menon, P., van den Bos, M., Halliday, GM, et艾尔。(2020)。TDP-43 蛋白病：新一波神经退行性疾病。J Neurol Neurosurg Psychiatry 92(1): 86-95。
Feiguin, F., l, VK, Romano, G., D'Ambrogio, A., Klima, R. 和 Baralle, FE (2009)。TDP-43 的消耗会影响果蝇运动神经元的末端突触和运动行为。FEBS Lett 583：1586-1592。
Godena, VK, Romano, G., Romano, M., Appocher, C., Klima, R., Buratti, E., Baralle, FE 和 Feiguin, F. (2011)。TDP-43通过调节 Futsch/MAP1B 水平和突触微管组织来调节果蝇神经肌肉接头的生长。PLoS 一6(3)：e17808。
Livak, KJ 和 Schmittgen, TD (2001)。使用实时定量 PCR 和 2 -ΔΔCT方法分析相关基因表达数据。方法25(4)：402-408。
Prasad, A.、Bharathi, V.、Sivalingam, V.、Girdhar, A. 和 Patel, BK（2019 年）。TDP-43 错误折叠的分子机制和肌萎缩侧索硬化症的病理学。Front Mol Neurosci 12：25 。
Romano, G.、Klima, R.、Buratti, E.、Verstreken, P.、Baralle, FE 和 Feiguin, F. (2014)。TDP-43 功能在突触组织和机车控制中的时间顺序要求。Neurobiol Dis 71：95-109。
Romano, G.、Holodkov, N.、Klima, R.、Grilli, F.、Guarnaccia, C.、Nizzardo, M.、Rizzo, F.、Garcia, R. 和 Feiguin, F. (2018)。果蝇 TDP-43-null 大脑中谷氨酸脱羧酶的下调通过影响神经肌肉突触的组织而引起瘫痪。科学众议员。8, 1809.
Romano, G.、Klima, R. 和 Feiguin, F.（2020 年）。TDP-43通过调节 Dicer-2 活性防止果蝇运动系统中的逆转录转座子激活。 BMC 生物学18（1）：82。