材料和试剂

70 μm 细胞过滤器（Fisher Scientific，Falcon，目录号：10788201）
圆底聚苯乙烯5毫升试管（Fisher Scientific，Falcon，目录号：14-959-5）
1.7 ml 离心管（Crystalgen）
50 毫升锥形管 (BD)
无菌移液器 (Corning)，组织培养 6 cm 培养皿 (BD)
小鼠 E13.5 胚胎胎肝
EasySep 小鼠 PE 阳性选择试剂盒（Cell Signaling Technologies，目录号：17656）
抗 F4/80-PE 抗体（兔多克隆）（eBiosciences，目录号：12-4801-80）
FWV ICAM4/αv 抑制剂肽（定制序列 LRQGKTLRG）（Genscript，目录号：SC1848）。以 23 mM 制备储备溶液并储存在 -20℃. 储备液至少可稳定保存 2 年。
细胞培养磷酸盐缓冲盐水 1 ×（Fisher Scientific，Corning，目录号：MT21040）
胎牛血清（GE Healthcare，HyClone，目录号：SH30070.03）
0.5 M EDTA 原液

设备

移液器 (P200)
解剖工具（例如，锋利的镊子）
EasyEights EasySep Magnet（Cell Signaling Technologies，目录号：18103）
能够安装 1.7 ml 和 50 ml 试管的冷冻离心机
流式细胞仪 (Attune)

程序

小鼠 E13.5 胚胎胎肝提取和细胞匀浆

牺牲鼠标并提取 E13.5 胚胎，将它们放入冰冷的 1 × PBS 中，置于无菌 6 厘米组织培养皿中。
使用锋利的镊子，小心地将胎肝提取到 200 μl含 2% FBS的1 × PBS 中。
使用 P200，反复但轻柔地移液以匀浆肝脏并生成单细胞悬液（不需要胶原酶或其他酶处理）。
将细胞通过 70 μm 滤网过滤到 50 ml 锥形管中的 5 ml 冰冷 1× PBS + 2% FBS 中。
混合均匀，取一小份用于细胞计数，将剩余的细胞在冷冻离心机中以 180 × g的速度在 4°C 下离心5 分钟。

使用 EZ-Sep 小鼠 PE 选择套件进行 F4/80-PE+ 细胞选择

在室温下以每毫升10 8 个细胞的密度在微量离心管中将细胞重悬于 1× PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA（EZ-Sep 推荐的培养基）中。（通常每个胎肝会产生大约 5-1000 万个细胞，因此每个肝脏都可以视为一个样本）。我们通常将每个胎肝重新悬浮在 200 µl 1× PBS + 2% FBS 的单独管中。
添加 FWV 肽至终浓度为 2 mM 并混合均匀（每 200 µl 样品添加约 17.5 µl 23 mM 储备溶液）。

注意：此时，步骤参考 EZ-Sep 鼠标 PE 选择套件的协议。

从 EZ-Sep 试剂盒和移液器中加入 2 µl 小鼠 FcR 阻断剂以混合细胞。
以 1:100 的稀释度（基于步骤 B1 的总体积），加入抗 F4/80-PE 抗体，轻轻吹打混匀，室温暗处孵育 20 分钟。

注意：抗体稀释度会因所使用的抗体而异，并且必须针对不同的抗体进行标准化。

从 EZ-Sep 试剂盒中加入 2 µl PE 选择鸡尾酒，轻轻移液混合均匀，并在室温下孵育 20 分钟。
从 EZ-Sep 试剂盒中加入 10 µl 磁性纳米颗粒，轻轻移液混合均匀，室温孵育 10 分钟
将管子放在 Cell Signaling Technologies 的 EasyEights EasySep Magnet 上（允许一次处理八个管子）在室温下放置 5 分钟。
通过将带有管子的磁铁倒置到废物容器中，轻轻倒出上清液（使用一种平稳的倒置运动，不要摇晃）。
从磁铁上取下管子，沿着管壁轻轻移液，将细胞收集到 1 ml 冷 EZ-Seq 推荐的培养基中。在 4°C 下以 180 × g离心5 分钟。
在室温下重新悬浮在 200 µl EZ-Sep 推荐的培养基中，并重复步骤 B6 中的磁性纳米颗粒选择步骤。
从磁铁上取下管子，用冰冷的 1× PBS 清洗两次。每次洗涤时，沿管壁加入 2 ml 1× PBS，放在磁铁上 5 分钟。每次轻轻倒出液体，如步骤 B8。
最后一次洗涤后，将细胞重悬在 0.5 ml 1× PBS 中并进行单细胞测序。
取出一小部分细胞并使用流式细胞术分析 F4/80-PE+ 细胞的纯度。

数据分析

请参考 Mukherjee等人(2021) 有关纯化的 F4/80+ 群体的流式细胞术数据分析的详细信息。在这项研究中，从两个独立的野生型 E13.5 胎肝中分离出 28,000 个健康的 F4/80+ 巨噬细胞（在台盼蓝染色后通过光学显微镜目测计数）并合并用于单细胞测序。有关单细胞测序质量、细胞异质性和数据分析的详细信息，请参阅 Mukherjee等(2021)。在使用 Seurat 包进行 U-MAP 分析后，我们获得了 13 个独立的簇（图 2）。

图 2. 从 E13.5 小鼠胎肝中分离的 F4/80+ 巨噬细胞的单细胞 RNA-Seq 数据的 U-MAP 聚类。

致谢

作者要感谢李雪在设计该协议的早期版本方面的投入。流式细胞术在西奈流式细胞术核心进行。这项工作得到了 NIH 向 JJB 提供 R01 DK102260 和 DK121671 以及向 KM 提供的黑人家庭干细胞研究所 (ISMMS) 试点赠款的支持。

该协议是对 Mukherjee等人先前发表的研究进行了微小修改的。（2021 年；Doi：10.7554/eLife.61070）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益

伦理

本研究严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。所有动物均按照西奈山医学院批准的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 协议 (#18-1911) 进行处理。

参考

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Li, W., Wang, Y., Zhao, H., Zhang, H., Xu, Y., Wang, S., Guo, X., Huang, Y., Zhang, S., Han, Y.,等。(2019)。成红细胞岛巨噬细胞的鉴定和转录组分析。血液134（5）：480-491。
Li, W.、Guo, R.、Song, Y. 和 Jiang, Z. (2021)。红细胞岛巨噬细胞塑造正常红细胞生成并驱动红细胞造血疾病中的相关疾病。 Front Cell 和 Dev Biol 8：613885。
Manwani, D. 和 Bieker, JJ (2008)。红细胞岛。Curr Top Dev Biol 82：23-53。
Mukherjee, K., Xue, L., Planutis, A., Gnanapragasam, MN, Chess, A. 和 Bieker, JJ (2021)。EKLF/KLF1 表达在小鼠红细胞生成过程中定义了一个独特的巨噬细胞子集。Elife 10：e61070。
Seu, KG, Papoin, J., Fessler, R., Hom, J., Huang, G., Mohandas, N., Blanc, L. 和 Kalfa, TA (2017)。解开成红细胞岛中巨噬细胞的异质性。前免疫学8：1140。
Xue, L.、Galdass, M.、Gnanapragasam, MN、Manwani, D. 和 Bieker, JJ（2014 年）。EKLF (KLF1) 在一个专门的红系生态位中的外在和内在控制。发展141(11)：2245-2254。