材料和试剂

使用 RNA 级和无核酸酶的试剂和溶液。将溶液储存在冷冻等分试样中，以避免反复冻融。

1.5 ml DNA LoBind 微量离心管（Eppendorf，目录号：022431021）
2 ml DNA LoBind微量离心管（Eppendorf，目录号：022431048）
Ep Dualfilter TIPS LoRetention 0.1-10 μl（Eppendorf，目录号：0030078632）
Ep Dualfilter TIPS LoRetention 2-100 μl（Eppendorf，目录号：0030078659）
Ep Dualfilter TIPS LoRetention 20-300 μl（Eppendorf，目录号：0030078675）
Ep Dualfilter TIPS LoRetention 50-1,000 μl（Eppendorf，目录号：0030078683）
8 × 0.2 ml PCR 反应管带连接平盖（Simport，目录号：T3202N）
二硫苏糖醇（DTT），1 M（Thermo Fisher Scientific，目录号：P2325）
dNTP 混合，每个 25 mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：R1122）。使用前用无 RNase 的水稀释至 20 mM
TGIRT-III酶（InGex，目录号：TGIRT50）

注意：从供应商处收到的 TGIRT-III 酶储存在 -80℃直到可以使用。将打开的试管储存在 -20°C。TGIRT-III 在 -20°C 下储存 3 个月后可能会失去活性（Behrens 等，2021）。

MinElute 反应净化试剂盒（Qiagen，目录号：28204 或 28206）或 MinElute PCR 纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004 或 28006）
5' DNA 腺苷酸化试剂盒（New England Biolabs，目录号：E2610S/L）
Oligo Clean & Concentrator 套件（Zymo Research，目录号：D4060/4061）
耐热 5' app DNA/RNA 连接酶（New England Biolabs，目录号：M0319S/L）
带有 HF 缓冲液的 Phusion 高保真 PCR 预混液（Thermo Fisher Scientific，目录号：F531S/L）
AMPure XP（Beckman Coulter，目录号：A63881）
高灵敏度 DNA 试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4626）
（可选）RNA 6000 Pico 试剂盒（安捷伦，目录号：5067-1513）
（可选）小 RNA 试剂盒（安捷伦，目录号：5067-1548）
寡核苷酸：所有寡核苷酸都应为 HPLC 纯化的无 RNase 级

R2 RNA

5'-RA的rA了rG rArUrC rGrGrA rArGrA rGrCrA rCrArC rGrUrC rUrGrA rArCrU rCrCrA rGrUrC RARC / 3SpC3 / -3'

注意：也可以使用其他阻断剂，例如来自 IDT 的 3' Amino Modifier C6 dT(3AmMC6T)。

R2R DNA

5'-GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC T TN-3'（N = 等摩尔 A、T、G、C）

注意：当前 TGIRT-seq 协议中使用的 R2R DNA 与早期版本中使用的不同。它有一个单核苷酸变化（在 3' 末端的 -3 位置插入带下划线的 T 残基），在连接步骤期间强烈减少 R1R-R2R 接头二聚体的形成（Xu 等人，2019）。在 R2 RNA 的相应位置插入一个互补的 A 残基（下划线 A；见上）。

R1R DNA

5'-/5Phos/GAT CGT CGG ACT GTA GAA CTC TGA ACG TGT AG/3SpC3/-3'

注意：Read 1 (R1) 序列对应于用于 Illumina 测序的 NEBNEXT Small RNA Library Prep Set 中使用的小 RNA 测序引物位点。

6N 唯一分子标识符 (UMI) R1R DNA

5'-/5Phos/NNN NNN GAT CGT CGG ACT GTA GAA CTC TGA ACG TGT AG/3SpC3/-3'

注意：在 R1R 序列的 5' 端添加了 UMI 核苷酸（机器混合的等摩尔 A、C、G 和 T 残基，表示为 N）。可以更改 N 个核苷酸的数量，以适应测序样品的复杂性和 PCR 后预期的重复数量。

Illumina 条形码 PCR 引物 (P5)

5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG AT BARCODE C TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GAC GAT C-3'

注意：引物中的条形码序列是有义链（例如，Illumina 网站上 TruSeq Barcode 01 (TSBC01) 引物中的 ATCACG）。此条形码是可选的，但建议为在 NovaSeq 仪器上测序的文库提供唯一的双索引 (UDI)。

Illumina 条形码 PCR 引物 (P7)

5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT 条形码 GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC T-3'

注意：引物中的条形码序列应该是 Illumina 网站上列出的条形码的反向互补序列（例如，TSBC01 引物中的 CGTGAT）。

UltraPure DNase/RNase-free 蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977015）或来自其他公司或内部来源的等效物
Trizma 盐酸盐溶液（Tris-HCl），pH 7.5，2 M（Sigma-Aldrich，目录号：T2944）
EDTA，0.5 M，pH 8.0，无RNase（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）
氯化钠溶液，5 M，无 RNase（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9760G）
氯化镁溶液，用于分子生物学的 BioUltra，2 M（Sigma-Aldrich，目录号：68475-100ML-F）
RNA Century TM -Plus Markers （例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：AM7145）
AMPure XP 珠（Beckman Coulter，目录号：A63880）
mirVana miRNA 分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM1560）
总外泌体 RNA 和蛋白质分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：4478545）
TRIzol LS 试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：10296010）
Turbo DNase（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2238）
DNase I（Zymo Research，目录号：E1010）
核酸外切酶 I（Lucigen，目录号：X40520K）
Illumina Ribo-Zero Plus rRNA Depletion 试剂盒（Illumina，目录号：20040526）
NEBNext 镁 RNA 片段化模块（New England Biolabs，目录号：E6150S）
RNA Clean & Concentrator-5（Zymo Research，目录号：R1013）

设备

-20°C 冰箱
T100 96 孔 PCR 热循环仪（Bio-Rad，目录号：1861096）、Veriti 9044 60 孔热循环仪（Applied Biosystems，目录号：4384638），或具有加热盖和稳定温度控制的等效热循环仪
微量离心机（Eppendorf，目录号：2231000768）
DynaMag-2 磁铁（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
2100 生物分析仪（安捷伦，目录号：G2939BA）
芯片启动站（安捷伦，目录号：5065-4401）

软件

2100 Expert 软件/升级（安捷伦，目录号：G2946CA）

注意：生物分析仪软件应与仪器捆绑在一起。如果没有，可以从 Agilent 购买升级版本。

程序

10×起始双工的制备（表1）

表 1. 10× (1 μM) Starter Duplex 所需的组件

通过手动混合等体积的四个单独的 R2R DNA 寡核苷酸与 3' A、C、G 或 T，制备 10 µM R2R DNA，在 1-nt DNA 悬垂位置含有等摩尔比例的 A、C、G 和 T 残基残留物（每个 10 µM）在 1.5 ml Eppendorf Lobind 微量离心管或等效物和涡旋中。将原液分装并储存在 -20°C 直至使用。50 μl 的 10× Starter Duplex 足以进行 25 次反应（每个反应 2 μl）。

注意：具有不等比例的 1-nt 3' DNA 悬垂核苷酸的 R2R DNA 可用于减轻 TGIRT-seq 中的模板切换偏差（Mohr 等人，2013 年；Xu 等人，2019 年），

将上述反应组分设置在无菌 PCR 管中，用于寡核苷酸退火以形成起始双链体。
在预热的热循环仪中，在 82°C 下孵育混合的 10x Starter Duplex 组分 2 分钟。
以 10% 的斜坡或以 0.1°C/s 的速率冷却至 25°C。

注意：退火的 R2 RNA/R2R DNA Starter Duplex 应在每次模板转换反应前新鲜制备。使用后丢弃任何剩余物。

模板转换逆转录反应

在无菌 PCR 管中设置以下反应组分，最后添加 TGIRT-III 酶（表 2）。

表 2. 模板转换逆转录反应所需的成分

笔记：

因为 TGIRT 酶也可以模板转换为 DNA，所以 RNA 样本应该在 TGIRT-seq 之前进行 DNase 处理。DNase 处理的 RNA 样本的最低 RNA 输入为： 2 ng rRNA 耗尽、化学碎片化的细胞 RNA；20-50 ng rRNA 耗尽、未片段化的细胞 RNA；500 pg 血浆 RNA；从高度纯化的细胞外囊泡中提取的 2 ng RNA。使用 Qubit 或生物分析仪测量低 RNA 浓度。有关为 TGIRT-seq 准备 RNA 样本的更多详细信息，请参阅文本末尾的注释 1-4。
我们在此协议中使用 200 mM NaCl，而不是早期版本中使用的 450 mM NaCl，以提高模板切换的效率，而不会过度增加多个顺序模板切换，从而导致人为融合读取。另见下面的注释 5。
使用安捷伦生物分析仪或等效仪器进行中试，以确定样品的最佳酶浓度，以监测文库质量和数量。
使用 TGIRT-III 酶对商业RNA 阶梯（例如 Thermo Fisher Scientific，目录号：AM7145）的模板转换逆转录反应可以作为阳性对照进行整个过程。

在室温下预孵育 30 分钟，然后通过添加 1 μl 20 mM dNTP（dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 20 mM 的等摩尔混合物）启动模板转换和逆转录。
全细胞、EV 或血浆 RNA 在 60°C 下孵育 15 分钟，成熟 miRNA 孵育 5-10 分钟，长或重度修饰的 RNA 孵育最多 60 分钟。对于不同的 RNA 模板，应通过实验确定最佳孵育时间。
加入 1 μl 5 M NaOH 并在 95°C 下孵育 3 分钟。
冷却至室温并用 1 μl 5 M HCl 中和。

注意：需要步骤 B4 和 B5，因为 TGIRT-III 与核酸结合非常紧密。碱性水解降解 RNA 模板和酶，但不降解 cDNA 产物。

加入 78 μl 无核酸酶水，使终体积为 100 μl。
使用 MinElute Reaction Cleanup 试剂盒（QIAGEN，目录号：28204）或 MinElute PCR 纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）清理 cDNA，并在 10 μl QIAGEN 洗脱缓冲液中洗脱。

注意：离心前用洗脱缓冲液在室温下孵育色谱柱以最大限度地提高回收率。

该过程可以在此处中断，将 cDNA 储存在 -20°C。

继续进行 R1R 腺苷酸化、热稳定连接和 Phusion PCR 扩增。

使用 New England Biolabs 试剂盒（New England Biolabs，目录号：E2610S/L）进行 R1R 5' DNA 腺苷酸化

注意：如果腺苷酸化寡核苷酸是从商业供应商处购买的，请继续进行连接步骤。

在无菌 PCR 管中设置以下反应组分（表 3）：

表 3. 5' DNA 腺苷酸化所需的成分

注意：New England Biolabs 试剂盒包括 10×DNA 腺苷酸化缓冲液、1 mM ATP 和 Mth RNA 连接酶。

在 65°C 下孵育 1 小时。
在 85°C 下孵育 5 分钟以灭活酶。
使用 Oligo Clean & Concentrator 试剂盒（Zymo Research，目录号：D4060）进行清理，并在 10 μl 无核酸酶水中洗脱，最终浓度为 10 μM 5'-末端腺苷酸化 R1R DNA。

注意：如果需要大量 TGIRT-seq 文库，我们建议通过使用相同量的酶和寡核苷酸进行多次（例如 6 倍到 8 倍）20 微升反应，然后组合产品来放大腺苷酸化反应用于净化，因为较高的洗脱体积有助于有效回收腺苷酸化寡核苷酸。清理后，R1R 的回收材料应为 80-100 ng/ μl，6N UMI R1R 的回收材料应为 100-120 ng/μl，使用 Nanodrop 分光光度计使用 ssDNA 设置进行测量。可以使用带有 Small RNA 试剂盒的安捷伦生物分析仪监测腺苷酸化。腺苷酸化寡核苷酸可在 -20°C 下储存长达两周。

5' 腺苷酸化接头的热稳定连接（New England Biolabs，目录号：M0319S/L）

在无菌 PCR 管中设置以下反应组分（表 4）：

表 4. 5' 接头热稳定连接所需的组件

在 65°C 下孵育 1-2 小时。

注意：我们建议结扎 2 小时。但是，如果起始材料丰富，可以使用 1 小时连接。

加入 80 μl 无核酸酶水，最终体积为 100 μl。
使用 MinElute Reaction Cleanup 试剂盒（QIAGEN，目录号：28204）清理连接的 cDNA，并在 23 μl QIAGEN 洗脱缓冲液中洗脱（在离心前用洗脱缓冲液在室温下孵育柱子以最大化回收率）。

注意：该过程可以在此处中断，连接的 cDNA 储存在 -20°C。

继续进行 Phusion PCR 扩增。

PCR扩增（Thermo Fisher Scientific，目录号：F531S/L）

在无菌 PCR 管中设置以下反应组分（表 5）：

表 5. PCR 扩增所需的组件

PCR循环：

98°C 变性 5 秒。
最多 12 个循环，98°C 5 秒，60°C 10 秒，72°C 15-30 s/kb，4°C 保持。

笔记：

尽量减少 PCR 扩增的循环次数可减少偏差和重复读数。对于 TGIRT-seq，12 个 PCR 循环通常是令人满意的，RNA 输入如 B 节所示。循环次数可以根据不同的 RNA 输入和文库复杂性增加或减少。
该过程可以在此处中断，并将 PCR 产物储存在 -20°C。

使用AMPure XP 磁珠（Beckman Coulter，目录号：A63880）去除接头二聚体并富集文库中所需的 DNA 大小。默认比例为 1.4 × v/v（70 μl 珠子/50 μl PCR 反应）。珠子与样品体积的比例可以根据被测序的 RNA 的大小特征进行调整。
通过使用高灵敏度 DNA 分析试剂盒在生物分析仪上分析 1 μl 来检查文库质量（图 2）。

图 2. 使用配备高灵敏度 DNA 试剂盒的安捷伦生物分析仪获得的代表性 TGIRT-seq 文库的生物分析仪迹线。

A.核糖耗尽和化学碎片化的 HeLa S3 细胞 RNA（核去除后 20 ng 起始材料）。片段化为 70-90 nt 的细胞 RNA 的文库产品以 190-210 bp 运行。B.血浆 RNA（0.5 ng 起始材料）。库产品运行在 140-240 bp，峰值在 ~200 bp 对应于来自 tRNA 的库产品。残留的接头二聚体 (AD) 以低浓度存在于最终文库中，R1R-R2R 的运行速度约为 120 bp，而 UMI R1R 接头或唯一双索引 (UDI) PCR 引物则稍大一些。小于 100 bp 的峰对应于未使用的 PCR 和接头寡核苷酸 (P+A)。下部 (35 bp) 和上部 (10,380 bp) 标记是高灵敏度 DNA 试剂盒提供的内部标记。DNA 长度 (bp) 由软件程序根据试剂盒提供的梯子确定。

笔记：

如果需要，可以执行额外的一轮 1.4 × AMPure XP 磁珠清理，以进一步耗尽适配器二聚体的水平。更广泛的 AMPure XP 磁珠清理会导致文库产品的丢失。
最终的 TGIRT-seq 库可以储存在 -20°C 下，直到提交进行测序。

测序和数据分析

TGIRT-seq 文库可以在任何 Illumina 测序仪器上进行测序，以获得单端 (SE) 或双端 (PE) 读数。读取长度和读取深度取决于实验的需要。我们在 NextSeq 500 上使用了 PE75，具有 3.3 亿个读数输出，用于分析细胞、EV 和血浆 RNA。我们还在 NovaSeq 上使用了 PE150，为需要高深度分析的大型项目或样本输出至少 7 亿个读数。

由于 TGIRT-seq 同时分析编码和非编码 RNA，TGIRT-seq 的读取映射管道通常使用具有专门数据库的顺序映射策略，首先使用在多个位点编码的 rRNA 和 tRNA 序列以及嵌入蛋白质内含子中的 sncRNA 映射读取- 编码基因，在将剩余读数映射到人类基因组参考序列之前。除了端到端比对之外，通常还包括局部比对步骤，以通过 TGIRT 酶更有效地捕获非模板化核苷酸添加到 cDNA 3' 端的读数。读取处理和映射的详细协议，包括重复读取的 UMI 解卷积，以及识别受蛋白质保护的 mRNA 片段、结构化切除的内含子 RNA 和内含子 RNA 片段作为人血浆中潜在生物标志物的峰值调用，可以在 Yao等人中找到. (2020)。

用于不同样本类型和应用的其他 TGIRT-seq 读取映射协议，包括统计测试和不同应用的重复细节，可在以下参考文献中找到：血浆 RNA（Qin等人，2016 年）；总细胞 RNA，包括spike-ins (Nottingham et al. , 2016)；血浆 DNA，包括核小体定位和 DNA 甲基化位点的定位（Wu 和 Lambowitz，2017）；sncRNA（Boivin等人，2018 年）；总细胞 RNA，包括详细分析和修复测序偏差（Xu等，2019）。

笔记

我们已经使用各种商业试剂盒来分离 TGIRT-seq 的 RNA。商业试剂盒在 RNA 产量方面存在显着差异，并且可能会偏向于不同的 RNA 生物型。我们已经使用 mirVana miRNA 分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM1560）对人细胞 RNA 的 TGIRT-seq 取得了良好的结果。对于 EV，我们通过使用总外泌体 RNA 和蛋白质分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：4478545）获得了良好的结果。为了分离人血浆 RNA，我们尝试了多种不同的提取试剂和试剂盒，包括 TRIzol LS Reagent（Thermo Fisher Scientific，目录号：10296010）和 Direct-zol RNA Miniprep（Zymo Research，目录号：R2051）；QIAamp ccfDNA/RNA 提取试剂盒（QIAGEN，目录号：55184）；和 miRNeasy Serum/Plasma Advanced 试剂盒（QIAGEN，目录号：217204）。每个试剂盒在输入量、易用性和 RNA 产量方面都有优缺点。在我们手中，QIAamp ccfDNA/RNA 试剂盒在提取 DNA 方面比 RNA 更有效（Yao等，2020）。
TGIRT 酶可以从 R2 RNA/R2R DNA 起始双链体模板切换到 DNA 片段的 3' 端，该活性已被用于对单链 DNA 进行测序，以分析核小体定位和 DNA 甲基化位点的定位（Wu 和 Lambowitz , 2017) 。对于 RNA-seq，重要的是尽可能多地去除 DNA，以最大限度地减少 DNA 读数。我们使用了 Turbo DNase（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2238）以及 DNase I（Zymo Research，目录号：E1010）和核酸外切酶 I（Lucigen，目录号：X40520K）（Yao等人，2020）的组合。我们使用 RNA Clean & Concentrator-5 试剂盒（Zymo Research，目录号：R1013）和修改后的 8x V/V（乙醇/输入 RNA）方案清理 DNase 处理的 RNA。
细胞 RNA 是 rRNA 耗尽的，以最大限度地减少映射到 rRNA 的读数。由于 rRNA 去除程序对 rRNA 并非 100% 特异，不同的 rRNA 去除试剂盒也会影响与其他 RNA 生物型（包括感兴趣的 RNA）对应的读数。因此，研究中的所有样品都应使用相同的 rRNA 去除试剂盒。使用制造商方案的 Illumina Ribo-Zero Plus rRNA Depletion 试剂盒（Illumina，目录号：20040526）为 TGIRT-seq [最终文库中的 5-10% rRNA 读数提供了令人满意的结果，尽管在我们手中它在去除 rRNA 作为该试剂盒的原始（现已停产）版本（RiboZero Gold，<1-2% rRNA 读数）]。
对于细胞 RNA 的化学片段化，我们使用 NEBNext 镁 RNA 片段化模块（New England Biolabs，目录号：E6150S）。我们通常使用 50 ng 去除了 rRNA 的总细胞 RNA 作为输入，并在 94°C 下加热 5-7 分钟以进行片段化。RNA 输入和片段化时间应由研究人员根据感兴趣的 RNA 和 Illumina 测序所需的读取长度进行优化。片段化后，我们使用RNA Clean & Concentrator-5 试剂盒（Zymo Research，目录号：R1013）和修改后的8x V/V（乙醇/输入 RNA）方案清理RNA。应使用具有 3'-磷酸酶活性的 T4 多核苷酸激酶处理用二价阳离子生成的碎片化细胞 RNA，以去除阻碍 TGIRT 模板转换的 3' 磷酸和 2',3'-环磷酸（Mohr等人，2013 年；诺丁汉等人，2016 年）。这种抑制在 200 mM 时不如在 450 mM NaCl 时明显（Lentzsch等人，2019 年；Yao等人，2020 年）。
在初始 TGIRT-seq 方案中使用高盐浓度 (450 mM NaCl) 来抑制 TGIRT 酶的多个端到端模板转换也降低了来自 R2 RNA/R2R DNA Starter Duplex 的初始模板转换反应的效率（Lentzsch等人，2019 年）。多个模板切换对于 miRNA 测序尤其成问题。使用 200 mM NaCl 提高来自 R2 RNA/R2R DNA 起始双链体的初始模板转换反应的效率的更新方案提供了人血浆中编码和非编码 RNA 的综合库，具有可接受的融合读数水平（0.5-4% )，其中包括多个模板开关 (Yao et al. , 2020)。
对于低 RNA 输入（例如，对于人血浆和 EV RNA），TGIRT-seq 文库的 Bioanalyzer 痕迹可能会显示适配器二聚体峰，但没有软件称为文库产物峰。在这些情况下，1μl 的文库可以用另外12个PCR循环扩增以检测文库产物。如果进一步 PCR 扩增后可以检测到文库产物，则未进一步扩增的原始文库应该可以用于测序。额外扩增后，接头二聚体水平将更高（因为短产物优先扩增），但用户应该期望观察到预测大小的所需产物。如果仍未检测到文库产品，则可能意味着由于 RNA 输入问题（质量或数量）导致文库制备失败。
最终 TGIRT-seq 库的 Bioanalyzer 痕迹中缺少产物峰和接头二聚体峰 (120-125 bp) 表明连接反应不成功，最有可能是由于 R1R 腺苷酸化步骤或连接失败。

致谢

TGIRT-seq 方法的开发得到了 NIH 赠款 R35 GM136216 和韦尔奇基金会赠款 F-1607 的支持。该协议已改编自姚等人。(2020)。

利益争夺

热稳定性 II 组内含子逆转录酶及其使用方法是德克萨斯大学和东田纳西州立大学向 InGex, LLC 授权的专利和专利申请的主题。AML、Lambowitz 实验室的一些前任和现任成员以及德克萨斯大学是 InGex, LLC 的少数股权持有人，并从使用 TGIRT 模板转换活动的 TGIRT 酶和试剂盒的销售以及知识分子的再许可中获得特许权使用费。其他公司的财产。

参考

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