材料和试剂

1. 40 µm 细胞过滤器（Biologix，目录号：15-1040）

2. 玻璃底培养皿，No. 1.5 Coverslip（直径35 mm，MATTEK，目录号：P35G-1.5-20-C）或等效物（例如，ibidi，目录号：81158）

3. 75 cm ²组织培养处理过的带过滤盖的烧瓶（Thermo Fisher Scientific，Nunc ^TMEasYFlask ^TM目录号：NUN156499）或等效物（例如，Corning，目录号：CLS430641U）

4. 一次性血清移液管（Corning ^®Costar ^®Stripette ^®，目录号：CLS4487 [5 ml]；CLS4488 [10 ml]）

5. 无菌滤嘴（ZAP ^TM，目录号：1051-965-038 [0.1-10 µl]；1055-965-018 [1-40 µl]；1059-965-008 [1-200 µl]；1057-965- 018 [1,000 微升])

6. 1.5 ml Eppendorf 管（Eppendorf South Pacific Pty Ltd，目录号：0030120086）

7. 离心 Falcon 管（BD Falcon ^TM，目录号：BDAA352096 [15 ml]，BDAA352070 [50 ml]）

8. 具有明确定义的细胞 - 细胞连接的上皮细胞系，例如 MCF-7 或 Caco-2：野生型并表达可以标记细胞 - 细胞连接的荧光标记蛋白（例如，E-钙粘蛋白或 ZO-1），细胞骨架细胞-细胞连接处的皮层（例如，肌球蛋白调节轻链，MRLC）或连接蛋白的生物传感器（例如，活性 RhoA 生物传感器 AHPH）。应使用绿色（例如.，GFP）或红色（例如.，mCherry）荧光蛋白作为荧光标签，以区别远红色 Annexin V 染色（Alexa Fluor ^TM647）

9. 胎牛血清（FBS）（HyClone ^TM，目录号：SH30084.03）

膜联蛋白 V，Alexa Fluor ^TM647 偶联物（Thermo Fisher Scientific，目录号：A23204）
Opti-MEM 培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）
Lipofectamine ^TMRNAiMAX 转染试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：13778150）
MEM 非必需氨基酸 100 ×（MEM NEAA；Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11140050 ）
L-谷氨酰胺100×（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030149）
青霉素-链霉素（5,000 U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15070063）
用于 MCF-7 细胞的 DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11995073 ）或用于 Caco-2 细胞的 RPMI（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21870076）
汉克平衡盐溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
完全细胞培养基（见配方）
成像介质（见配方）

设备

1. 移液枪（例如，Thermo Fisher Scientific ^TM，目录号：9501）

2. 移液器套件（例如，Gilson PIPETMAN ^®，目录号：FA10001M [0.2-2 µl]；FA10003M [2-20 µl]；FA10005M [20-200 µl]；FA10006M [100-1,000 µl]）

3. 明场显微镜（例如，配备 Plan Fluor 4×/0.13 相差物镜的 Nikon Eclipse TS100）

4. 血细胞计数器计数室（例如，Livingstone，目录号：HCCB）

5. 细胞培养 CO ₂培养箱（例如，PHCbi 目录号：MCO-230AICUVL-PA）

6. II类生物安全柜（例如，Gel Aire，型号：20 BHEN 2004D）

7. 台式离心机（例如，Hettich Lab Technology ^TMROTIFIX 32A）

8. 激光扫描共聚焦显微镜最少配备：

a. 二向色滤光片和发射滤光片，分别用于使用 488 nm 和 633 nm 激光线以及检测 GFP 和 Alexa Fluor ^TM647 荧光

b. 488nm 和 633nm 激光线（例如，氩、氦氖或固态激光器）

c. 声光可调滤光片 (AOTF) 用于特定感兴趣区域的照射（即，选定区域的漂白）

d. 2W 或更多可调谐双光子激光器（可调至 790nm 激光线）（例如，MaiTai 或 Chameleon）

e. 用于活细胞成像的加热室 (37°C)

f. 40 倍 IR-VIS 兼容物镜（理想情况下浸入水中以最大程度地减少色差）

本协议中显示的实验是在配备完全可调的 Mai Tai eHP DeepSee 760-1040 nm 激光器、加热室（37 °C用于细胞成像）和 Plan Apochromat 40 × 1.3 NA 水的蔡司 LSM 710 Meta客观的。

软件

1. ImageJ 软件 ( https://imagej.nih.gov/ij/ )

2. GraphPad PRISM 软件 ( http://www.graphpad.com )

程序

A. 细胞制备

表达荧光标记连接蛋白的上皮细胞系可以通过病毒转导、编码感兴趣的荧光标记蛋白的质粒的瞬时转染或通过使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑标记感兴趣的基因来实现。下面的协议描述了生成未标记和荧光标记细胞的混合培养所需的步骤（图 1A）。

注意：为简单起见，荧光标记的细胞系将被称为“GFP 阳性线”。然而，GFP 可以被任何来自绿-红光谱的明亮荧光团替换。

图 1. 激光损伤的目标。

卡通 (A) 和感兴趣的细胞（黄色星号）的示例图像 (B)。激光损伤的目标应该由一个或两个未标记的细胞（黄色星号）组成，周围是荧光团阳性的相邻细胞。在这里，相邻细胞表达 MRLC-GFP。混合野生型细胞和荧光标记细胞可防止光干扰，这是由凋亡细胞在物理上从单层中排出并移出成像焦点时引起的。比例尺：15 µm。

第一天

1. 通过胰蛋白酶消化收集大约 80-90% 融合的 GFP 阳性和野生型 (WT) 细胞系的 T75 烧瓶，将它们旋转下来（1,500 rpm，3 分钟），并重新悬浮在 10 ml 新鲜的全培养基中（参见食谱）。将细胞悬液通过单独的细胞过滤器。

2. 通过轻轻上下移液以 20:1 的比例组合 GFP 阳性细胞和 WT 细胞，以确保细胞完全混合。

3. 在玻璃底培养皿上以 30% 汇合（Caco-2 细胞：3 × 10 ⁵细胞重悬于 2 ml 生长培养基）或 50% 汇合（MCF-7 细胞：5 × 10 ⁵细胞重悬于 2 ml培养基中）接种混合细胞生长培养基）。应根据单个细胞系的行为调整播种汇合度，以便在播种和达到 100% 汇合之间至少间隔 48 小时，以便在细胞之间形成成熟的连接。

第 2 天

如果实验需要敲除所选蛋白质，请根据既定程序用 siRNA 转染细胞，或按照使用 Lipofectamine RNAiMAX 的 siRNA 转染方案（附录 I）。

注意：如果细胞对使用 Lipofectamine RNAiMAX 进行转染具有抗性，请使用慢病毒转导来敲除所选蛋白质 [有关协议，请参阅 Priya 和 Gomez (2013)] 或使用 CRISPR/Cas9 基因敲除系（用于生成这些，参见 Ran 等人，2013 年）。

第 3 天

继续在细胞培养箱中培养细胞。

第 4 天

1. 使用明场显微镜确认细胞完全融合。

2. 将 1.5 ml 成像介质加热至 37°C。

3. 直接在成像之前，将 3 µl Annexin V、Alexa Fluor ^TM647 偶联物添加到成像介质中。使用 100-1,000 µl 移液器（Gilson PIPETMAN ^®或同等产品）轻轻去除生长培养基，并用 1.5 ml 成像培养基代替。

笔记：

a. 作为 Annexin V，Alexa Fluor ^TM647 偶联物具有光敏性，将原始管分装到一次性铝箔包裹管中。将等分试样在 4°C 下储存直至失效日期。

b. 为了确认感兴趣的蛋白质被击倒，在想象完成后立即裂解细胞并提取蛋白质进行蛋白质印迹。

B. 图像采集 —— 激光损伤和凋亡挤出的获得

注意：以下协议基于Zeiss LSM 710 Meta 共聚焦扫描仪（配备完全可调的 Mai Tai eHP DeepSee 760-1,040 nm 激光器，2.4 W 平均激光功率），但它可能会针对其他类似系统进行优化[例如，迈克尔等人。（2016 年）成功使用配备 700-1,100 nm 变色龙激光器、>2W 功率的蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜]。

1. 设置成像以检测 GFP、Alexa Fluor ^TM647 和微分干涉对比 (DIC)。

注意：由于 AnnexinV Alexa Fluor ^TM647 不标记活细胞，调整通道增益以查看成像介质中未结合的 Alexa Fluor ^TM647 阳性残基（图 3A，黄色箭头）。

2. 在采集面板中，激活以下选项：“Z-Stack”、“时间序列”、“漂白”和“区域”（图 2A）。

注意：我们使用 ZEN 软件中的“漂白”工具照射感兴趣的区域并诱导靶细胞凋亡。类似的工具可用于其他商用显微镜，如 Leica 和 Olympus，尽管它们的名称可能不同。

图 2. 蔡司软件的快照，包括为使用 790 nm 波长的 MAI TAI 激光诱导细胞凋亡而优化的设置。

3. 通过选择“全部显示”展开“漂白”窗口。激活“#scans 后开始漂白”并输入“1”。在“迭代次数”中输入“5”并选择“不同的 Z 位置 (µm)”。选择 790 nm 波长和 50% 的透射率（如果不能有效诱导受辐照细胞的细胞凋亡，则透射率可以进一步调整为大约 60%，参见步骤 B7）（图 2B）。

4. 通过找到被 GFP 阳性细胞包围的单个或双 WT、GFP 阴性细胞来识别目标细胞（图 1）。

5. 设置大约 30 个 1 µm Z 堆栈，其中中间堆栈集中在连接标记上。

6. 使用 DIC 通道，转到聚焦目标细胞核的 Z 堆栈（图 3C、3D）并选择此 Z 堆栈进行漂白，方法是更新“不同 Z 位置 (µm)”中的位置，Mark Z ”在“漂白”选项中（图 2B）。从“区域”（图 2C）中选择一个圆形工具，并在所选细胞的核仁上画一个圆圈（图 3D、3E）。

图 3. 激光损伤设置的优化。

A. 激光损伤前无凋亡细胞；黄色箭头指向细胞培养基中未结合的 Annexin V、Alexa Fluor ^TM647 偶联物的背景残基；B. 激光诱导细胞凋亡后两个细胞的膜联蛋白 V 染色呈阳性。将 Alexa Fluor ^TM647 偶联物以 1:500 稀释添加到成像介质中；光盘。DIC 视图的代表性图像集中在细胞核上。作为参考，细胞核用橙色虚线标记，核凝聚（核仁）的例子用黄色箭头标记。英孚。DIC 对激光损伤的看法。目标细胞的大致区域用洋红色虚线标记，激光损伤的圆形区域 (E) 用红色圆圈标记。注意激光损伤前 (E) 和激光损伤后约 1 分钟 (F) 靶细胞的形态。比例尺：15 µm。

注意：两个 Alexa Fluor ^TM647 图像（A、B）都是使用相同的激光设置捕获的。为确保阳性 AnnexinV 染色可见，请确保在激光损伤 (A) 之前，AnnexinV 的未结合残留物可见。

7. 使用上述设置开始成像。在第一帧和第二帧的采集之间，MAI TAI 激光将自动打开并多次用高功率红外光照射选定区域，从而伤害目标细胞。

注意：使用 DIC 通道观察目标细胞中发生的形态变化 - 核/细胞质浓缩应在损伤后 1-2 分钟内可见（图 3E、3F）。如果在受伤后 5 分钟内看不到形态变化/AnnexinV 染色（图 3B），请调整 MAI TAI 激光的传输设置（步骤 B3），直到细胞凋亡成功发生。

8. 设置合适的成像时间间隔——如果实验的目标是捕捉相邻细胞的行为，间隔应该是频繁的（20-30 秒）；如果目的是量化挤压，时间间隔可能会减少（5-10 分钟）。获取延时图像，直到挤出完成（20-30 分钟）或 1 小时，如果挤出没有进展。见下文对顶端凋亡挤出的评估。

C. 细胞凋亡的定量

1. 在 ImageJ 软件中打开获取的延时图像，选择“着色”作为颜色模式。

2. 使用附加的宏（附件 1：最大投影和正交视图.ijm）生成正交视图和延时图像的最大投影。

注意：或者，按照分步协议（附录 2）生成延时图像的正交视图和最大投影。

附件 1：从时间段图像生成正交视图和最大投影的宏。

3. 正交视图：使用底部滑块，选择延时的最后一帧；根据图 4A 定位 Z 视图标记线：如果挤出失败，这些线应在相邻细胞合并在凋亡细胞下方的点处交叉（图 4A，中间面板），或在凋亡细胞的中心（图4A，右面板）。回到电影的第一帧，确认 GFP 标记的连接蛋白在 Z 视图中清晰可见（图 4A，左面板）。

注意：旋转图像并稍微调整 Z 视图的位置，以清楚地捕获连接蛋白和 AnnexinV 标记的凋亡细胞。

图 4. 凋亡顶端挤压的评估。

A. 正交视图的卡通图（顶部）和示例示例（底部；品红色 – AnnexinV 染色，绿色 – 在相邻细胞中表达的 AHPH RhoA 生物传感器）。左图：激光损伤前的视图，中图：顶端挤压完成后（蓝色箭头 - 凋亡细胞下方相邻细胞的连接标记的积累），右图：挤压失败（凋亡细胞保留在单层 60激光损伤后分钟）。橙色星号标记凋亡细胞（中间和右侧）或激光损伤前的靶细胞（左侧）。B. 成功的顶端挤压的卡通片（左）和示例（右），在此期间上皮单层保持其完整性。C. 一个卡通（左）和一个顶端挤压失败的例子（右），在此期间上皮单层没有保持其完整性——一个凋亡细胞（橙色星号）与相邻细胞分离，导致形成空间隙（黄色箭头）在垂死的细胞和它的邻居之间。蓝色箭头指向“分离纤维”。比例尺：15 µm。

4. 通过注意来自相邻细胞的连接 GFP 信号是否聚集在 AnnexinV 阳性凋亡细胞下方，评估凋亡细胞的顶端挤出。如果在激光损伤后 60 分钟，连接标记之间仍然存在凋亡细胞，则将挤出归类为失败（图 4A）。如果相邻细胞聚集在凋亡细胞下方，则继续下一步。

5. 最大投影：评估细胞凋亡部位单层的完整性 - 在成功挤出时，应保持单层的完整性（在挤出完成之前，凋亡细胞不应与相邻细胞分离）（图 4B）。如果相邻细胞和凋亡细胞之间存在空白空间，则将挤出分类为失败（图 4C）。如果在挤压过程中单层的完整性没有受到干扰（在挤压过程中，凋亡细胞在任何时候都没有与相邻细胞分离），则将挤压归类为成功，并且凋亡细胞在顶端方向被排出（参见步骤 C4 ）。

注意：如果凋亡细胞与相邻细胞分离，您可能会观察到特征性的“分离纤维”（图 4C，蓝色箭头）。

6. 为所有剩余的延时图像（n ≥每个实验每个条件 5 个凋亡细胞）。计算条件下成功挤出细胞/所有凋亡细胞的百分比。将从至少三个独立实验中获得的数字输入到棱镜柱状图中。如果比较各种条件，计算显着性并生成图表。

注意：附上诱导细胞凋亡和随后的细胞凋亡挤出的样本延时成像的原始文件（附件 2）。

附件 2：诱导细胞凋亡和随后的细胞凋亡挤出的样本延时成像的样本原始文件。相邻细胞表达 RhoA 生物传感器（AHPH-GFP，绿色通道），根据此处介绍的协议，使用激光微辐照诱导两个 GFP 阴性细胞凋亡。通过膜联蛋白-V 染色（品红色通道）确认受损细胞的凋亡。

食谱

1. 完全细胞培养基

DMEM 或 RPMI 补充 10% FBS

1% 非必需氨基酸 (NEAA)

1% L-谷氨酰胺

100 单位/毫升青霉素和 100 单位/毫升链霉素

2. 成像介质

Hank 的平衡盐溶液补充了 10 mM HEPES pH 7.4

5 mM CaCl ₂和 10% FBS

致谢

这项工作得到了澳大利亚国家健康和医学研究委员会 (1123816、1164462、1136592) 和澳大利亚研究委员会 (DP19010287) 的资助。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1. Andrade, D. 和 Rosenblatt, J.（2011 年）。上皮细胞挤出的细胞凋亡调节。细胞凋亡16(5)：491-501。

2. Duszyc, K., Gomez, GA, Lagendijk, AK, Yau, MK, Nanavati, BN, Gliddon, BL, Hall, TE, Verma, S., Hogan, BM, Pitson, SM, Fairlie, DP, Parton, RG 和叶，AS (2021)。机械转导激活凋亡上皮细胞附近的 RhoA 以参与顶端挤压。 Curr Biol 31(6): 1326-1336 e1325。

3. Michael, M., Meiring, JCM, Acharya, BR, Matthews, DR, Verma, S., Han, SP, Hill, MM, Parton, RG, Gomez, GA 和 Yap, AS (2016)。Coronin 1B 重组 F-肌动蛋白网络的架构，以实现稳态和凋亡粘附连接处的收缩。 开发单元37（1）：58-71。

4. Priya, R. 和 Gomez, GA (2013)。使用光漂白后的荧光恢复 (FRAP) 测量连接蛋白动力学。生物方案3(20)：e937。

5. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J. Agarwala, V., Scott, DA 和 Zhang, F. (2013)。使用 CRISPR-Cas9 系统进行基因组工程。国家议定书 8：2281-2308。

6. Rosenblatt, J.、Raff, MC 和 Cramer, LP (2001)。注定要凋亡的上皮细胞通过肌动蛋白和肌球蛋白依赖性机制向其邻居发出信号以将其挤出。 Curr Biol 11（23）：1847-1857。

7. Slattum, G.、McGee, KM 和 Rosenblatt, J.（2009 年）。P115 RhoGEF 和微管决定凋亡细胞从上皮中挤出的方向。J Cell Biol 186(5): 693-702。

8. Teo, JL, Tomatis, VM, Coburn, L., Lagendijk, AK, Schouwenaar, IM, Budnar, S., Hall, TE, Verma, S., McLachlan, RW, Hogan, BM, et al . (2020)。Src 激酶松弛凋亡细胞相邻细胞之间的粘附连接以允许顶端挤压。分子生物学细胞31(23)：2557-2569。