材料和试剂

1. 1.5 ml Eppendorf 离心管（Eppendorf，目录号：NA ）

2. 0.5 ml Nest 微量离心管（Biosharp，Life Science，目录号：201214 ）

3. 18 号针头和注射器 ( Lujie ^®, 2015315175 )

4. 无菌 15 ml 和 50 ml 锥形管（Beijing Labgic Technology，目录号：CT-002-15 和 CT-002-50）

5. 100毫米细胞培养皿（赛默飞世尔科技）和12-48孔板（Costar ^®，康宁，目录号：430161 ）

6. 显微解剖板和针脚

7. 无菌手套和纱布

8. 70 µm 细胞过滤器（Biologix ，目录号：15-1070）

9. 移液器校准器 P1000 (N253062)、P200 (MZ26504) 和 P10 (N252362)

10. 磁分离柱和 MACS ^®分离器（MACS，Miltenyi Biotec）

11. 野生型小鼠 ( C57BL/6)

8-12周龄雄性和雌性野生型小鼠获自Jackson实验室。小鼠在中国江苏省徐州医科大学的规定下饲养。

12. 70-80% 乙醇

13. Milli-Q 水（Quantum ^®Tix，目录号：QTUMOTIX1）

14. Miltenyi Biotec CD 31 微珠，MS 柱（miniMACS ^TMSeparator，Miltenyi Biotec）

15. 胎牛血清 (FBS)（G ibco，Thermo Fisher Scientific）

16. 牛血清白蛋白 (BSA) (Solarbio ^®Life Science)

17. 蒸馏水

18. Accutase 溶液（A bsin，Biochemical Company/Thermo Fisher Scientific）

19. 盐酸（HCl）

20. 氯化钾 (KCl)

21. 氯化钠 (NaCl)

22. 磷酸氢二钠 (Na ₂HPO ₄)

23. 磷酸二氢钾 (KH ₂PO ₄)

24. 10,000 U/ml 青霉素/链霉素（G ibco，Thermo Fisher Scientific）

25. 鼠尾胶原蛋白 I 型 3 mg/ml （Thermo Fisher Scientific，目录号：A10483-01）

26. 人血浆纤连蛋白纯化蛋白（EMD Millipore，目录号：3383980 或 FC010）

27. PECAM-1（CD31），兔多克隆（Affinity Bioscience，目录号：AF6191）

28. VE-CADHERIN（CD144）兔多克隆（Affinity Bioscience，目录号：AF6265）

29. 血管内皮生长因子受体-2（VEGFR2（FlK-1）兔多克隆（Bioworld Technology，目录号：Q1169）

30. 二抗：山羊抗兔（IgG）Alexa Fluor ^®594（绿色；Abcam，目录号：Ab15008）和 Alexa Fluor ^®488（红色；Abcam，目录号：Ab15007）

31. 内皮细胞培养基（EBM-2）（Lonza公司，Clonetics ^®）

32. 1 × Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）（见配方）

33. Dulbecco 的改良 Eagle 培养基（DMEM）（G ibco，Thermo Fisher Scientific）（见食谱）

34. 0.5 M乙二胺四乙酸二钠（EDTA ）·2 H ₂O （见配方）

35. 0.001 M 乙二胺四乙酸（EDTA）/DBPS（见配方）

36. 无菌收获缓冲液（见配方）

37. 完整的内皮细胞培养基（见食谱）

38. 4%多聚甲醛（PFA）溶液（国药化学试剂）（见配方）

39. 1% 牛血清白蛋白（BSA/DPBS）（见食谱）

40. 0.5 M EDTA（见配方）

41. 盘子预涂层试剂（见配方）

设备

1. 手术剪刀/镊子（10-11 厘米长不锈钢解剖剪刀和10-11 厘米长不锈钢解剖直钳）

2. 细胞培养箱（CO ₂培养箱）（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell 150i ，目录号：41629032）

3. 移液器：P10、P200 和 P1000（Thermo Fisher Scientific，目录号：464000、4640050、4640060）

4. 细胞计数室（血细胞计数器）/自动细胞计数机（迈瑞）

5. 冰箱（2-8 °C ）（海尔、生物医药）

6. -20°C冰箱（海尔）

7. 层流钩（Thermo Fisher Scientific，SN-194564，型号 -1381 ）

8. 高速离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge ^®20R，目录号：MRZ14H028，低速离心机AIRTECH-KDC-40 AnhuiUSTC Zonkia Scientific Instruments co.Ltd，目录号：02241700049）

9. Nikon Eclipse 显微镜（Nikon，型号：Eclipse Ti）

灭菌机（Hirayama，型号：HICLAVE ^TMHVE-50，目录号：30613065826）
pH计和自动称重机（Metter Toledo）
磁力搅拌器（IKA ^®RCT Basic，0317090005661）
量筒

软件

1. 流式细胞术软件

2. FlowJo 软件版本 7.6.2

程序

注意：事先对所有必要的设备和试剂进行消毒。

A. 贴壁骨髓细胞的制备

1. 通过颈椎脱位对小鼠（8-12 周龄，图 1-i）实施安乐死，并将整只小鼠浸泡在 70% 乙醇中 2-5 分钟。将无菌显微切割板、镊子和剪刀放在层流钩中。用针脚将鼠标夹在解剖板上，用 70% 乙醇消毒。剥下鼠标从后腿顶部到脚的皮肤。用剪刀将后腿分开，轻轻地将脚剪掉，以保持骨骼的完整性。将后腿放入含有 4-5 毫升无菌室温 DBPS 的 100 毫米直径盘中 2-3 分钟。

2. 用镊子和剪刀将肌肉从骨骼中分离出来，用无菌牙钳解剖骨骼，并将它们放在一个直径为 2-3 毫升的 DPBS 的无菌 100 毫米盘中（图 1-ii）。在 DPBS 中用单独的无菌镊子清洁骨头，并将它们转移到含有 3 ml 0.002 M EDTA/DPBS/抗生素溶液的无菌 100 mm 直径盘中。切断股骨和胫骨的远端 (图 1-iii)。

3. 取出已消毒的 0.5 毫升巢式微量离心管，将 18 号针头向下推至管底部以形成一个孔。将股骨和胫骨的切缘向下插入，每管最多四根骨头，并盖紧盖子（图 1-iv）。

4. 将封闭的 0.5 ml Nest 微量离心管放入 1.5 ml Eppendorf 管中，并用用 70% 乙醇消毒的封口膜密封。将 1.5 ml Eppendorf 管以 15,000 × g离心30 秒，37 ℃（图 1-v）。取出 Eppendorf 管，确认骨头是白色的（图 1-vi）；如果不是这种情况，请重复离心。丢弃 0.5 ml 巢式微量离心管，用 100-200 µl 无菌室温 DPBS/EDTA 溶液轻轻悬浮在 1.5 ml Eppendorf 管底部的明显沉淀物，并将细胞转移到新的干净管中。

5. 用 3-4 ml 无菌室温 DPBS/EDTA 溶液轻轻吸取悬浮的骨髓细胞，并用 70 µm 细胞过滤器将细胞过滤到无菌 50 ml 锥形管中（图 1-vii）。将纯化的骨髓细胞转移到 10-15 ml 干净的管中（图 1-viii），并在室温（37°C）下以 300 × g离心5 分钟（图 1-ix）。丢弃上清液并用 2-3 ml 完整 DMEM（参见食谱）重悬可见颗粒（图 1-x）。使用自动细胞计数器或血细胞计数器计算细胞总数。

6. 将 50-1 亿个骨髓细胞接种到含有 10-12 ml 完整 DMEM（参见配方）的无菌 100 毫米直径细胞培养皿中，并在 5% CO ₂加湿培养箱中孵育 8-12 小时或过夜（图 1-十一）。

图 1. 程序 A 的图示：骨髓贴壁细胞的制备。

B. 培养贴壁 BMEC 的分离

1. 在 8-12 小时或过夜孵育后，从细胞培养箱中取出100 毫米细胞培养皿。耐心地用 P1000 从细胞培养皿中吸取非贴壁细胞并丢弃它们。用 2-3 ml 无菌室温 DPBS 清洗培养的贴壁骨髓细胞两次（图 2-i）。将 2-3 ml 的 accutase 溶液放入 100mm 细胞培养皿中，并在室温下孵育 15 分钟。

2. 在光学显微镜下观察培养的贴壁骨髓细胞。如果细胞已经从培养皿中分离出来，将它们悬浮在 1-2 ml的收获缓冲液中。将细胞转移到 10-15 ml 管中，并添加 2-3 ml 收获缓冲液，以重新悬浮细胞培养皿中的剩余细胞（图 2-ii）。在光学显微镜下观察细胞培养皿，确认所有细胞均已分离。在室温下将重悬的细胞 300 × g离心10 分钟（图 2-iii）。ř esuspended佩尔等（图2-iv）与100-200微升收获缓冲液中，确定细胞的总数通过自动细胞计数器或血细胞计数器。

3. 将大约 10 ⁷-10 ⁹培养的粘附骨髓细胞在 90 µl 中与 10 µl CD31 微珠分装到 1.5 ml Eppendorf 管中，并用 P200 移液器轻轻混合。然后，将混合物在 4°C 下在黑暗中孵育 15 分钟（图 2-v）。

4. 孵育后，将 CD31 微珠细胞转移到 10-15 ml 锥形管中，并用 10 ml收获缓冲液重新悬浮细胞（图 2-vi）。在室温下以300 × g离心10 分钟，以洗掉细胞中多余的磁珠（图 2-vii）。用 500-1,000 µl 收获缓冲液重悬沉淀（图 2-viii）。

5. 用 70% 乙醇对磁性（MACS ^TM分离器）和 miniMACS ^TM分离器进行消毒，并将其放入层流钩中。将 MS 色谱柱（miniMACS ^TMSeparator）连接到 MACS ^TMSeparator 并用 500 µl 收获缓冲液冲洗色谱柱一次。将重悬的骨髓细胞装入柱中，让单个细胞通过。用 500 µl 收获缓冲液冲洗 MS 色谱柱 3 次，然后用 100-200 µl 完整内皮细胞培养基单独洗涤（参见食谱）（图 2-ix）。

注意：非磁性 CD31 微珠细胞（CD31 阴性细胞）的流通由其他骨髓贴壁细胞组成，如巨噬细胞、间充质细胞和内皮祖细胞，可储存用于其他实验或丢弃。

6. 将磁珠细胞推入装有 1,000 µl 完整内皮细胞培养基的新无菌管中（参见食谱）（图 2-x）。通过将细胞移入血球计数室或自动细胞计数器的井中来确定 BMECs 的总数。

注意：对于分离的 BMEC 的直接实验用途，我们建议将阳性磁珠细胞用 1,000 µl 收获缓冲液重新悬浮并重复步骤 5。如果分离的细胞在分离后要保持培养几天，转到第 7 步。带有分离的 BMEC 的最小污染贴壁细胞将在细胞培养 4-7 天后死亡。

7. 如果 12-48 孔板预先涂有 I 型鼠尾胶原蛋白，则用 0.5-1ml 无菌室温 DPBS 溶液冲洗板两次，然后用 100-200 μl 完整内皮细胞培养基冲洗一次（参见食谱）。每孔播种大约 2 × 10 ⁵-3 × 10 ⁵^个细胞（图 2-xi），并使细胞不受干扰 3-4 天以保持其数量。然后，无需洗涤即可更换培养基，并将细胞再孵育 7-10 天（图 2-xii）。或者，如果板预先涂有人血浆纤连蛋白，则无需洗涤，细胞可以直接接种到上述孔中。

笔记：

a. 每只小鼠的 BMEC 总数约为 3 × 10 ⁴-5 × 10 ⁴^个细胞。

b. 制备的完整内皮细胞培养基（50 ml，参见食谱）应在室温下预热。

c. 细胞应分布在孔的侧面以具有等效的分配。必须避免搅动或摇晃板子，以防止细胞在孔的某些区域聚集。

图 2. 程序 B 的说明：分离培养的贴壁 BMEC。

C. BMEC 的治疗

1. 在用药物或抑制剂处理之前，细胞应在预包被的 12-48 孔板中培养 7 天。在处理细胞之前，用预热的内皮细胞培养基清洗细胞。添加 100-300 µl 含有抑制剂或药物的内皮细胞培养基和 100-300 µl 含有 2% FBS 的内皮细胞培养基，如我们的出版物中所述（Smith等，2021）。治疗持续时间后，用完整的内皮细胞培养基更换培养基（参见食谱）。对于辐射暴露等外部治疗，在室温下用预热的培养基替换完整的内皮细胞培养基（参见食谱）。

笔记：

a. 介质的吸入和释放踏板必须在井的一侧执行，以避免细胞聚集，如图 3 所示。

b. 对药物或抑制剂进行连续稀释，以确定主要 BMEC 的无毒浓度。

c. 需要确定单个实验的时间尺度以获得最佳结果。

d. 涉及从 BMEC 中提取蛋白质的实验应在 12-48 孔板中培养，无需涂层，以获得出色的结果。用纤连蛋白/鼠尾胶原蛋白 I 型对孔进行涂层会影响实验结果。

图 3. 介质的吸入和释放应在孔的一侧进行。

将板保持在大约 20-30 度的角度，并将移液器保持在 120 度以避免细胞脱离。

D. BMECs 的固定和成像（图 4）

1. 从粘附的 BMEC 中吸出上清液。

2. 将 50-100 µl 4% PFA 溶液（参见配方）滴入孔中，并在室温下孵育 20 分钟。用 DBPS 洗涤细胞并用 50-100 µl 90% 甲醇孵育 20-25 分钟。访问链接以查看整个程序：https : //rdcu.be/cni0O或https://doi.org/10.1186/s13287-021-02352-3。

注意：不要在载玻片中培养主要的 BMEC。即使在预先涂有纤连蛋白或 I 型鼠尾胶原蛋白的载玻片上，细胞也不会粘附。

图 4. 通过免疫荧光染色和流式细胞术表征 BMEC。

(A)细胞培养 7 天后 BMEC 特定标记的成像。一抗：PECAM-1 (CD31)兔多克隆抗体，VE-钙粘蛋白（CD144）兔多克隆，和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR2 / FLK-1）的兔多克隆。二抗：山羊抗兔 (IgG) Alexa Fluor ^®594（绿色，Ab15008）和山羊抗兔 Alexa Fluor ^®488（红色，Ab15007）。在 1% BSA/DPBS 中稀释 1:50 的初级抗体和 1:500 的二级抗体。比例尺 = 5 µm，20 ×放大倍数。(B) BMEC 表面标志物的流式细胞术分析：CD31（PE，anti-mouse，eBioscience ^TM），CD106（PE，Rat-anti-mouse，BD-Pharmingen ^TM），CD144（APC，anti-mouse，eBioscience ^TM）和内皮选择性粘附分子 (ESAM) (APC, anti-mouse, Biolegend ^®) 抗体。每管收集5 × 10 ⁵^个细胞，用 DPBS 洗涤，并在 37 °C 下以 500 × g离心5 分钟（此过程重复两次）。细胞在 4 °C下用抗体或空白对照稀释1 小时。在 24 小时内通过流式细胞术 (BD LSRFortessa ^TM)分析数据。较低的频率用于通过前向散射 (FSC) ×侧向散射 (SSC)排除死细胞/碎片，然后是图形直方图呈现。流式细胞术数据由 FlowJo 软件 7.6.2 版进行分析。

数据分析

每个独立实验应至少进行三个实验重复，并且数据用载体细胞或未经处理的细胞标准化，如我们的出版物（史密斯等人，2021）中所述。可以使用条形图和适当的统计测试来表示数据。点击链接查看统计分析：https : //rdcu.be/cni0O或https://doi.org/10.1186/s13287-021-02352-3。

注意：对于每个实验设置，每组至少需要六只（Smith 等人，2021）小鼠才能获得最佳结果。

食谱

1. 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲溶液 (DPBS) 钠 (1 L)

氯化钠 8.0 克

氯化钾 0.2 克

KH ₂PO ₄0.2 克

Na ₂HPO ₄1.15 克

溶于 1,000 毫升 Milli-Q 水中

用 HCl 将pH 值调节至 7.2-7.6 ，灭菌，并在 4 °C 下储存

2. 完整的 DMEM（50 毫升）

Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)

20% 胎牛血清 (FBS)

500 µl 10,000 U /ml 青霉素/链霉素

保持在 4 °C

3. 0.5 M 乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液，pH 8.0（500 毫升）

93.05 克Na ₂EDTA·2H ₂O

400 毫升 Milli-Q 水

用 NaOH 调节 pH 值，灭菌并在 4 °C 下储存。

4. 0.001 M 乙二胺四乙酸 (EDTA)/DBPS

50 毫升 DPBS

100 µl 0.5 M EDTA

100 µl 10,000 U/ml 青霉素/链霉素

储存在 4 °C

5. 无菌收获缓冲液

0.002 M EDTA/DBPS

2% 胎牛血清

1% 牛血清白蛋白

100 µl 10,000 U/ml青霉素/链霉素

在 4 °C 下储存4 周

6. 完全内皮细胞培养基 (50 ml)

25 毫升胎牛血清 (FBS)

0.2 毫升氢化可的松

0.5 ml 血管内皮生长因子 (VEGF)

人成纤维细胞生长因子 (hFGF)

抗坏血酸

人表皮生长因子 (hEGF)

肝素

庆大霉素/两性霉素

仅在 4 °C 下储存4 周

7. 1% 牛血清白蛋白 (BSA/DPBS)

50 毫升无菌 DPBS

0.5 克牛血清白蛋白 (BSA)

8. 4% 多聚甲醛 (PFA) 溶液

将 4 g 分级多聚甲醛添加到 50 ml 蒸馏水或 Milli-Q-水中。

加入 1 ml 1 M NaOH，在 60 °C 下用磁力搅拌器轻轻搅拌，直到 PFA 溶解。

加入 10 ml 10 × DPBS 溶液。

让混合物在室温下冷却。

用 1 M HCl 将 pH 值调节至 7.4，然后将体积增加至 100 ml。

通过 0.45 µm 膜过滤溶液以去除任何残留颗粒。

分装成适当的体积，并在 4 °C 下储存一个月或在 -20 °C下储存几个月。

9. 0.5 M乙二胺四乙酸

将 93.05 g Na ₂(EDTA) · 2H ₂O 添加到 400 ml 蒸馏水中并用磁力搅拌器搅拌。用 NaOH 调节 pH 至 8.0，将体积增加至 500 ml，并将溶液储存在 4 °C 。

10. 碟子预涂试剂

a. 鼠尾胶原蛋白 I 型 3 mg/ml 加 0.2 M 无菌 HCl (50-100 µg/ml) 。

在 0.02 M HCl 中制备 50 µg/ml 鼠尾胶原蛋白 I 型：

在 9 ml 蒸馏水中制备 0.02 M HCl = 1 ml 0.2 M HCl

将 ~17 µl 3 mg/ml 鼠尾胶原蛋白 I 型加入 983 µl 0.02 M HCl

b. 或者，人纤连蛋白涂层溶液 1 mg/ml 与 2-10 µg/cm ²。

制备 20 µg/ml 的人纤连蛋白涂层溶液：

将 200 µl 人纤连蛋白溶液分装到 3.8 ml 无菌室温 DBPS 中。

注：上述包衣试剂过夜预包衣效果最佳，下表列出了推荐的预包衣液体积范围。

板/孔	推荐音量
48井	250-300 微升
12井	400-500 微升
24井	0.5-1毫升
6 井	1-2毫升

致谢

该协议是从史密斯等人修改的。(2021)。作者感谢通讯作者：乔建林、徐开林和曾凌宇的支持和专家建议。

经费资助：本研究得到国家自然科学基金项目[批准号31872795、81570096和81700178]；自然科学重大基础研究项目[批准号17KJA320008]；江苏省重点研发计划[批准号BE2018637]；江苏省省级重点人才计划[编号ZDRCA2016054]；江苏省高等学校自然科学基金资助项目[编号BK20170259]；中国博士后科学基金资助[编号2018M632380]；江苏省博士后科学基金[编号1701064B]。

竞争利益

作者声明对这些协议没有竞争利益。

伦理

徐州医科大学（中国徐州）和中国江苏省卫生研究院实验动物护理和使用指南和使用委员会批准了该研究，验收号：XZMC20130226。

参考

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2. Coşkun, S. 和 Hirschi, KK (2015)。HSC 开发、维护和调节中的血管利基。在：组织特异性干细胞壁龛。施普林格国际出版社。第 191-219 页。

3. Isern, J. 和 Mendez-Ferrer, S. (2011)。骨髓壁龛中的干细胞相互作用。Curr Osteoporos 代表9(4)：210-218。

4. Mishra, A., Shiozawa, Y., Pienta, KJ 和 Taichman, RS (2011)。癌细胞归巢到骨骼。 癌症微环境4(3): 221-235。

5. Passweg, JR, Baldomero, H., Bader, P., Bonini, C., Cesaro, S., Dreger, P., Duarte, RF, Dufour, C., Kuball, J., Farge-Bancel, D.,等。(2016)。2014 年欧洲造血干细胞移植：每年移植超过 40 000 次。骨髓移植51(6): 786-792。

6. Smith, AO、Adzraku, SY、Ju, W.、Qiao, J.、Xu, K. 和 Zeng, L. (2021)。一种分离小鼠骨髓内皮细胞 (BMECs) 的新策略。干细胞水疗12(1): 267。