材料和试剂

1. 滤纸（Macherey-Nagel，目录号：742113）

2. 硝酸纤维素膜（Amersham，目录号：10600001）

3. 离心管（15 ml，1.5 ml）（VWR，目录号：352096 [15 ml]，Sarstedt，目录号：72.690.001 [1.5 ml]）

4. X 射线胶片（Fujifilm，目录号：47410 19289）

5. 酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741 与 S288c 同基因 (Mata his3 Δ 1 leu2 Δ 0 met15 Δ 0 ura3 Δ 0 ) (Brachmann et al. , 1998)

6. D（+）-葡萄糖一水合物（Roth，目录号：6780.2）

7. 放线菌酮溶液 100 mg/ml DMSO（Sigma，目录号：C4859）

8. MG132 InSolution 10 mM 在 DMSO 中（Calbiochem，目录号：474791）

9. NaOH（默克，目录号：1.06498.5000）

10. β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250-100ML）

11. 三氯乙酸（TCA）（Roth，目录号：3744.1）

12. SDS（Roth，目录号：CN30.3）

13. Tris（Roth，目录号：5429.5）

14. NaCl（Roth，目录号：3957.2）

15. 37% HCl（VWR，目录号：20252.335）

16. 甘氨酸（PanReac AppliChem，目录号：141340.0914）

17. DTT（MP，目录号：100597）

18. 溴酚蓝钠盐（USB，目录号：US12370）

19. 甘油（Serva，目录号：23176.01）

20. 彩色预染蛋白质标准品，宽范围 11-245 kDa（New England Biolabs，目录号：P7719）

21. Rotiphorese Gel 30 丙烯酰胺/双丙烯酰胺原液（Roth，目录号：3029.1）

22. 过二硫酸铵（APS）（默克，目录号：1.01201.0500）

23. 四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma，目录号：T9281-25ML）

24. 甲醇（Roth，目录号：8388.5）

25. 2-丙醇（VWR，目录号：20842.330）

26. Ponceau S（Serva，目录号：33429.02）

27. 乙酸（VWR，目录号：20104.334）

28. 脱脂奶粉（Roth，目录号：T145.3）

29. HA 一抗（克隆 3F10）（Roche，目录号：11867423001）

30. 叠氮化钠（NaN ₃）（默克，目录号：1.06688.0100）

31. 大鼠二抗（Invitrogen，目录号：31470）

32. GE Healthcare Amersham ^TMECL ^TMPrime（Amersham，目录号：RPN2232）

33. TBS 缓冲液，pH 7.4（见配方）

34. HU 样品缓冲液（见配方）

35. Ponceau S 溶液（见配方）

36. Tris/甘氨酸缓冲液（见配方）

37. 转移缓冲液（见配方）

38. 允许对酵母细胞进行营养缺陷选择的最小酵母培养基（参见食谱）

39. 1 M DTT（见食谱）

40. Rödel 混合（见食谱）

设备

1. 酵母培养物的振动培养箱（Infors-HT，Multitron Standard）

2. 台式离心机（VWR，型号：Mega star 1.6）

3. 台式冷却离心机（Eppendorf，型号：5145R）

4. Vortex（Scientific Industries, Inc.，型号：Vortex-Genie 2）

5. 光度计（日立，型号：双光束分光光度计 U-2900）

6. Thermomixer（Eppendorf，型号：Thermomixer Comfort 5355）

7. 玻璃注射器（Hamilton，例如，目录号：80565）

注意：可以使用毛细管吸头（VWR，目录号：53509-015）代替 Hamilton 注射器。

8. SDS-PAGE 设备（Hoefer ^TM，型号：SE 600 系列）

9. 蛋白质印迹设备（Peqlab，PerfectBlue ^TM，型号：“半干”-Blotter，Sedec ^TM）

10. 翻滚桌（Biometra，型号：WT12）

11. 放射自显影盒（Amersham，型号：RPN11642）

12. 显影机（AGFA，型号：CURIX 60）

程序

A. 培养条件

1. 预培养（第 1 天）

接种少量细胞 [起始光密度 (OD) ₆₀₀0.05 = 750,000 个细胞/毫升] 在 5 毫升补充有葡萄糖 (2%, w/v) 的选择性基本培养基中，并在 30° 下过夜生长至指数生长期C、160转/分振摇。

注意：30°C 是野生型酵母菌株的最佳生长条件。对于必需蛋白质的分析，因此对基因操作的温度敏感 (ts) 酵母菌株进行分析，必须相应地调整生长温度。此外，某些蛋白质可能仅在某些条件下降解，例如在热休克时，因此应对每种情况进行测试。

2. 主要文化（第 2 天）

通过稀释过夜培养物中的酵母细胞，在早上接种 50 ml 补充有葡萄糖（2%，w/v）的选择性培养基，起始 OD ₆₀₀= 0.3。让细胞分裂至少 4-6 小时到指数生长期，最大 OD ₆₀₀= 2。

B. CHX处理关闭蛋白质合成

1. 收获细胞总OD ₆₀₀= 12：测量主要培养物的 OD 并使用 V = 12 / 测量的主要培养物的OD ₆₀₀计算所需的体积 (V)，以毫升为单位。使用 15 ml 锥形管进行离心（5 分钟，4,100 × g ，室温），在管内保留 4 ml 生长培养基，并丢弃剩余的上清液。

例子：

· 主要培养物的实测 OD ₆₀₀= 1.3

· 需要 (V)：12 OD ₆₀₀毫升

计算：V = 12 OD ₆₀₀/1.3 OD ₆₀₀= 9.23 ml

· 9.23 ml 将转移到 15 ml 锥形管中，并通过离心收集细胞

2. 在 4 ml 培养基中重悬收获的细胞。

3. 该步骤是可选的，取决于在翻译抑制之前阻断蛋白酶体的需要。为了抑制蛋白酶体，将 0.1 mM MG132 添加到培养基中，并将细胞在 30°C 下孵育 1 小时，以 160 rpm 振荡。

注意：如果蛋白酶体抑制是通过 MG132 处理进行的，细胞必须预先在含有脯氨酸和 0.003% SDS 的培养基中生长至少 3 小时（Liu 等，2007），以确保 MG132 不会从细胞中输出立即通过几个 ABC（ATP 结合盒）转运蛋白（Liu 等，2007）。或者，可以使用缺乏 ABC 转运蛋白 Pdr5 和/或 Snq2 的细胞进行蛋白酶体抑制，而无需使用特殊的培养条件。重要的是：由于药物渗透性增加，PDR5/SNQ2 缺失的细胞仅用 0.05 mM MG132 处理（Collins 等，2010）。

4. 将 CHX 添加到细胞中，最终浓度为 100 µM，并轻轻地将管反转五次。

5. 立即将 1 ml 含有 3 OD ₆₀₀的细胞悬液转移到新的反应管中，并通过离心（5 分钟，16,100 × g ，4°C）收获细胞。吸出上清液并在 -20°C 下冷冻细胞沉淀（时间点 (t) = 0）。

6. 再次摇动细胞 1 小时，然后重复步骤 B5（t = 1）。

7. 在 30°C 下再孵育 2 小时后，以 160 rpm 摇动，将再次收获1 ml 含有 3 OD ₆₀₀的培养基（5 分钟，16,100 × g ，4°C）（t = 3）。

注意：追逐的时间点应根据研究中使用的蛋白质进行调整，例如，应在几分钟到 1 小时的时间范围内分析非常不稳定的蛋白质，而应在几个小时内分析稳定的蛋白质。

C. 样品制备

注意：以下所有步骤均在冰上进行。

1. 将细胞沉淀重悬于 1ml 无菌蒸馏水和 150 μl Rödels 混合物中，通过涡旋和冰上孵育 15 分钟来破坏酵母细胞壁并使蛋白质变性。

2. 要沉淀蛋白质，请向每个样品中加入 150 µl 55% TCA。倒置试管并在冰上孵育 10 分钟。

3. 在 4°C 下以16,100 × g离心 10 分钟。

4. 小心去除上清液。

5. 在 4°C 下再次离心 5 分钟，16,100 × g 。

6. 在 45°C 和 1,400 rpm 的热混合器上摇动管 20 分钟，去除整个上清液并在 50 µl HU 样品缓冲液（参见配方）中重悬沉淀。

D. SDS-PAGE 和免疫印迹

如前所述（Schuster等，2018），使用 SDS-PAGE 分离蛋白质。

1. 凝胶设备根据制造商的说明组装。

2. 用于堆积和分离凝胶的凝胶混合物按表 1 所述制备，但不含 APS 和 TEMED。

注意：用于通过 SDS-PAGE 分析蛋白质的凝胶取决于目标蛋白质的大小。蛋白质的尺寸越小，丙烯酰胺的百分比越高，反之亦然（Sambrook 和 Russell，2006）。

表 1.一块 12% SDS 凝胶的组成

	12% 分离胶 (ml)	堆积凝胶 (ml)
丙烯酰胺¹	4	0.5
1.875 M Tris pH 8.8	2	——
0.6M Tris pH 6.8	——	0.6
MilliQ水	3.8	1.85
10% 安全数据表	0.05	0.02
20% APS	0.05	0.015
泰德	0.01	0.005

¹30% 丙烯酰胺和 0.8% 双丙烯酰胺 (37.5:1)

3. 将 APS 和 TEMED 添加到分离凝胶混合物中，快速彻底混合，然后将 9.5 ml 混合物倒入两个玻璃板之间。在凝胶混合物上加入 1 ml 2-丙醇以去除气泡并使表面光滑。让凝胶聚合至少 15 分钟。

4. 除去2-丙醇和洗涤3 ×小心地用蒸馏水。用滤纸小心地除去多余的水。

5. 在倒入上层凝胶之前，将梳子放入两块玻璃板之间的空间。将 APS 和 TEMED 添加到浓缩凝胶混合物中。充分混合并将浓缩凝胶混合物倒在分离凝胶的顶部，直到两块玻璃板之间的空间已满。

6. 上层浓缩凝胶混合物聚合后（至少 15 分钟），取出梳子并用 Tris/甘氨酸缓冲液填充孔。

7. 每个样品最多上样 15 µl，并在每个凝胶中包含一个预染色的蛋白质标准标记物（例如NEB、P7719）。

8. 用 Tris/甘氨酸缓冲液填充电泳槽（阳极）的下室，并根据制造商的说明将凝胶插入系统。

9. 用新鲜制备的 Tris/甘氨酸缓冲液填充上阴极室。请按照制造商的说明获取有关所需缓冲液体积的信息。

10. 在 200 V 和 400 mA 下运行凝胶，直到蛋白质加载前沿（由于 HU 缓冲液中的溴酚蓝钠盐可见，用作跟踪染料以监测分子在聚丙烯酰胺凝胶中移动的进程）到达末端凝胶。要估计蛋白质的大小，请参阅凝胶上的预染色蛋白质标准。确保感兴趣的蛋白质留在凝胶内并且不会耗尽。

11. 从运行系统中取出凝胶，拆卸玻璃板三明治，并用塑料楔子取出堆积凝胶。

12. 通过半干西方印迹将丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜上，如先前在 Schuster等人中所述。(2018)。

13. 在 Ponceau S (PoS) 溶液中孵育膜以染色转移到膜上的所有蛋白质。这种染色用于确定足够的蛋白质转移并用作加载控制。膜成像后，将其在 20 毫升 TBS 中脱色至少 15 分钟。

14. 进行抗体检测。在本协议中举例说明的情况下，使用了 HA 特异性抗体。在 TBS 中的 5% 牛奶中以 1:1,000 的比例稀释抗体。在 4°C 下将一抗中的膜孵育过夜。第二天，去除一抗，用 TBS 清洗膜 15 分钟，然后在室温下用二抗在 TBS 中的 5% 牛奶中稀释 1:5,000 孵育 2 小时。去除二抗后，用 TBS 洗膜 3 次，每次 10 分钟。二抗与辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联，用于在过氧化氢催化的鲁米诺氧化中产生光发射。蛋白质印迹是通过使用光敏 X 射线胶片和增强的化学发光溶液 (Cytiva Amersham ^TMECL ^TMPrime) 开发的，其中包含过氧化氢和鲁米诺，如先前 Schuster等人的协议中所述。(2018)。

注意：CHX 处理期间不稳定蛋白质（例如 Ubc6）的降解或其在 MG132 处理后的稳定化可分别用作翻译和/或蛋白酶体抑制的阳性对照。

在图 1 中，显示了一个代表性图像。

图 1. 翻译关闭后 Fzo1 的稳定性，有或没有蛋白酶体抑制。

(A) 将FZO1删除并表达 HA 标记的 Fzo1 的细胞与表达 Fzo1 突变版本的细胞进行比较，称为突变体-1 ，稳定蛋白质。(B) 分析了缺乏PDR5并稳定表达基因组标记版本的 HA 标记的 wt Fzo1 或称为突变体-2的不稳定突变体版本的细胞。细胞用 100 µM CHX 处理 1 或 3 小时。当指示时，在 CHX 处理之前，将细胞与 0.05 mM MG132 孵育 1 小时。(A+B) 通过 SDS-PAGE 和免疫印迹分析总细胞提取物中的蛋白质水平。Fzo1 是通过使用 HA 特异性抗体检测到的。在该分析中通过使用 Ubc6 特异性抗体观察到的不稳定 ER 蛋白 Ubc6 被用作 MG132 蛋白酶体抑制和 CHX 翻译抑制的对照（代表性图像）。丽春红 S (PoS) 染色用作上样对照。

食谱

1. TBS 缓冲液，pH 7.4

50 mM Tris

150 毫米氯化钠

使用 37% HCl 将 pH 值调节至 7.4

2. HU 样品缓冲液

8M尿素

5% 安全数据表

200 mM Tris pH 6.8

0.2 g/L 溴酚蓝钠盐

使用前新鲜添加 100 mM DTT

3. 丽春红 S 溶液

0.1% 春红 S

5% 醋酸

4. Tris/甘氨酸缓冲液

25 mM Tris

200mM 甘氨酸

3.5mM SDS

5. 传输缓冲区

200 mM 甘氨酸

25 mM Tris

20% (v/v) 甲醇

0.02% SDS

使用 37% HCl 将 pH 值调节至 8.5

6. 最低限度的酵母培养基，允许对酵母细胞进行营养缺陷型选择（Kaiser等，1994）

1.5 g Dropout mix（包含除腺嘌呤、尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和色氨酸以外的所有氨基酸）

1.7 克酵母氮基

5克硫酸铵

上面列出的成分溶解在 1 升蒸馏水中，高压灭菌并补充 2% 葡萄糖和 CSM（完全补充混合物）氨基酸混合物（包含 Ade、Ura、Lys、His、Trp、Leu）。

7. 1 M 数字电视

1.54 克 DTT 溶于 10 毫升无菌蒸馏水中

8. 罗德尔混合

2M氢氧化钠

7.5% β-巯基乙醇

致谢

资助：Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; CRC 1218 TP A03; EXC 2030 – 390661388; to ME-H); 科隆分子医学中心（CMMC；CAP14，到 ME-H，A02 到 ME-H 和 M. Odenthal）；勃林格殷格翰基金会（BIS；勘探补助金；授予 ME-H）。Simões等人使用了该协议。（2018 年；Doi：10.7554/eLife.30015）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突或竞争利益。

参考

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2. Anton, F., Fres, JM, Schauss, A., Pinson, B., Praefcke, GJ, Langer, T. 和 Escobar-Henriques, M. (2011)。Ugo1 和 Mdm30 在 Fzo1 介导的线粒体外膜融合过程中依次起作用。J Cell Sci 124（第 7 篇）：1126-1135。

3. Anton, V., Buntenbroich, I., Schuster, R., Babatz, F., Simoes, T., Altin, S., Calabrese, G., Riemer, J., Schauss, A. 和 Escobar-Henriques, M . (2019)。盐桥中的可塑性允许有丝分裂蛋白和 Cdc48 识别的融合能力泛素化。生命科学联盟2(6)：e201900491。

4. Buchanan, BW, Lloyd, ME, Engle, SM 和 Rubenstein, EM (2016)。酿酒酵母中蛋白质降解的放线菌酮追踪分析。J Vis Exp (110)：53975。

5. Collins, GA, Gomez, TA, Deshaies, RJ 和 Tansey, WP (2010)。结合化学和遗传方法来抑制蛋白酶体的蛋白水解。酵母27(11)：965-974。

6. Kaiser, C.、Michaelis, S. 和 Mitchell, A. (1994)。酵母遗传学方法：冷泉港实验室课程手册。普莱恩维尤：冷泉港实验室。

7. Klinge, S.、Voigts-Hoffmann, F.、Leibundgut, M.、Arpagaus, S. 和 Ban, N. (2011)。与起始因子 6 复合的真核 60S 核糖体亚基的晶体结构。科学334(6058)：941-948。

8. Liu, C.、Apodaca, J.、Davis, LE 和 Rao, H.（2007 年）。野生型酵母酿酒酵母细胞中的蛋白酶体抑制。生物技术42（2）：158、160、162。

9. Sambrook, J. 和 Russell, DW (2006)。蛋白质的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。CSH 协议2006(4)：pdb.prot4540。

10. Schneider-Poetsch, T., Ju, J., Eyler, DE, Dang, Y., Bhat, S., Merrick, WC, Green, R., Shen, B. 和 Liu, JO (2010)。放线菌酮和拉克米霉素对真核翻译延伸的抑制。Nat Chem Biol 6(3): 209-217。

11. Schuster, R., Anton, V., Simoes, T., Altin, S., den Brave, F., Hermanns, T., Hospenthal, M., Komander, D., Dittmar, G., Dohmen, RJ 和Escobar-Henriques, M. (2020)。GTPase 构象开关对通过丝裂融合蛋白泛素化进行膜融合的双重作用。生命科学联盟3(1)：e201900476。

12. Schuster, R.、Simões, T.、den Brave, F. 和 Escobar-Henriques, M.（2018 年）。低丰度泛素化形式的分离和可视化。生物方案8(22)：e3081。

13. Simões, T.、Schuster, R.、den Brave, F. 和 Escobar-Henriques, M.（2018 年）。Cdc48 调节对线粒体融合至关重要的去泛素化酶级联反应。 Elife 7：e30015。