材料和试剂

注射器，10 ml（BD，目录号：302995）
注射器过滤器 (0.45 µm; Thermo Scientific, 目录号：44525-PP）
猎鹰管（Fisher Scientific，目录号：08-771-23）
35 毫米培养皿（组织培养皿）（康宁，目录号：CLS430165）
10厘米培养皿（组织培养皿）（康宁，目录号：CLS430167）
15厘米培养皿（组织培养皿）（康宁，目录号：CLS430597）
开顶薄壁超透明管（38.5 ml），25 × 89 mm（Beckman Coulter，目录号：344058）
注意：在文字“38.5 ml 超清管”上。
开顶薄壁超透明管（13.2 ml），14 × 89 mm（Beckman Coulter，目录号：344059）
注意：在文字“13.2ml 超清管”上。
开顶薄壁超透明管（5 ml），13 × 51 mm（Beckman Coulter，目录号：344057）
注意：在文字“5 ml 超清管”上。
移液管（Fisherbrand，目录号：13-711-7M）
293T 细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
N2A 细胞（ATCC，目录号：CCL-131）
mESC（R1，ATCC，目录号：SCRC-1011）
视黄酸（RA）（Sigma，目录号：R2625）
胎牛血清（FBS）（VWR，目录号：89510-194）
外泌体耗尽的 FBS（System Biosciences（SBI），目录号：EXO-FBS-250A-1）
嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P8833-100MG）
pcDNA3 APEX-nes（Addgene，目录号：49386）
XPack CMV-XP-MCS-EF1α-Puro 克隆慢病毒载体（System Biosciences）
psPAX（Addgene，目录号：12260）
pMD2.G（Addgene，目录号：12259）
Lipofectamine 2000（Life Technologies，目录号：11668019）
OPTI-MEM（Thermo Scientific，目录号：31985062）
蔗糖（Fisher Chemical，目录号：S5-3）
生物素-苯酚（Sigma-Aldrich，目录号：SML2135）
蛋白酶抑制剂混合物（100×）（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
链霉亲和素-HRP（Thermo Fisher Scientific；目录号：21130）
H 2 O 2 （Thermo Fisher ，目录号：34062）
抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich ，目录号：A7631）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich ，目录号：26628-22-8）
Trolox（Sigma-Aldrich，目录号：238813-5G）
生物素（Thermo Fisher Scientific，目录号：29129）
DTT（Gold Biotechnology，目录号：DTT25）
DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水；Thermo Fisher，目录号：14190144）
链霉亲和素-琼脂糖珠（Sigma，目录号：16-126）
Novex TM WedgeWell TM 10% Tris-甘氨酸迷你凝胶，10 孔（Thermo Fisher，目录号：XP10200BOX）
Ponceau S（Thermo Fisher Scientific，目录号：XP00100PK2）
考马斯 G250（Sigma，目录号：1.15444）
DMEM/F12 培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11320033）
DMEM培养基（Life Technologies，目录号：10566-024）
Neurobasal培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：21103049）
B-27 TM补充剂（50×）（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044）
N-2补充剂（100×）（Thermo Fisher Scientific，目录号：17502048）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
非必需氨基酸（100×）（Thermo Fisher Scientific，目录号：11140050）
β-巯基乙醇（0.1 M）（Sigma，目录号：M3148）
DMEM + 10% FBS（见食谱）
RA (10 μM) + DMEM 中 1% 外泌体耗尽的 FBS（参见食谱）
缓冲液 C（见配方）
淬火溶液（见配方）
4 × 上样缓冲液（20 ml）（见配方）
N2B27 培养基（1 升）（见食谱）
RIPA（见食谱）
缓冲液 D（见配方）
TBS-T（见食谱）

设备

Sorvall RC 6+ 离心机（Thermo Scientific，型号：46910）
固定角转子 F14S-6X250y FiberLite（Thermo Scientific，目录号：78500）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima XE-90，目录号：A94471）
摆斗转子 SW 32 Ti 和铲斗套件（Beckman Coulter，目录号：369694）
摆斗转子 SW 28 Ti 和铲斗组（Beckman Coulter，目录号：342204）
摆斗转子 SW 55 Ti 和铲斗套件（Beckman Coulter，目录号：342194）
摆斗转子 SW 41 Ti 和铲斗组（Beckman Coulter，目录号：331362）
ChemiDoc MP 成像系统（Bio-Rad 实验室，型号：ChemiDoc MP 10）
NanoSight NS300 仪器配备 405-nm 激光器（Malvern Instruments，Malvern，英国）
折光仪（Fisher Scientific）
巴斯超声波仪（Covaris，型号：S220）

软件

Nanosight NTA 3.1 软件（马尔文仪器）
Excel（微软，2016 年）
GraphPad棱镜7
ImageLab软件 v4.0
PEAKS Studio X+
Vsn R 包

程序

第一部分：电动汽车净化

质粒构建
将 pcDNA3 APEX-nes 的细胞周期蛋白 D1 和 APEX 的 PCR 片段克隆到 XPack CMV-XP-MCS-EF1α-Puro Cloning Lentivector 中。
使用以下引物从 mESCs 的 cDNA 中 PCR cyclinD1 ：
CyclinD1-F: acgGGATCCCATGGAACACCAGCTCCTG
CyclinD1-R: acgGAATTCGATGTCCACATCTCGCACG
通过BamHI和EcoRI将cyclinD1 PCR片段插入pcDNA3 APEX-nes，得到pcDNA3 cyclinD1-APEX-nes质粒。
使用以下引物从上述载体 PCR cyclinD1-Flag-APEX：
acgCTCGAGTATGGAACACCAGCTCCTG
acgGGATCCtGATGTCCACATCTCGCACG
将cyclinD1-Flag-APEX PCR片段通过XhoI和BamHI插入XPack CMV-XP-MCS-EF1α-Puro，得到XPack CMV-XP-cyclinD1-Flag-APEX-EF1α-Puro质粒。
使用 Sanger DNA 测序（加州大学伯克利分校 DNA 测序设施）确认载体。

慢病毒包装和转染
载体转染
将 293T 细胞在早期传代（我们实验中的 P1）上接种到 10 厘米培养皿并培养以获得 60-70% 的汇合度。
混合 6 µg 转移载体（XPack CMV-XP-cyclinD1-APEX-EF1α-Puro）、3.9 µg psPAX 和 2.1 µg pMD2.G 在 0.5 ml OPTI-MEM 中（总 DNA 12 µg）。
在另一管中，将 36 µl lipofectamine 混合在 0.5 ml OPTI-MEM 中。
混合 DNA 和 lipofectamine，并在室温下孵育 20 分钟。
将培养基更改为 5 ml OPTI-MEM。
将 DNA 和脂质体混合物 (1 ml) 添加到培养皿中。
8 小时后，取出 OPTI-MEM 介质并丢弃到 100% 漂白剂中。
在新鲜生长培养基（见配方 1）中孵育细胞 2 天。
收获病毒
将培养基在4°C 下以 1,000 × g离心5 分钟。
将含有 cyclinD1-APEX 慢病毒的培养基缓慢通过 0.45 µm 过滤器过滤到 15 ml 猎鹰管中。
用慢病毒转导 50% 汇合 N2A 细胞
将 1.5 ml cyclinD1-APEX 慢病毒添加到 35 mm 培养皿中的 N2A 细胞中并培养 24 小时。
用含有 5 µg/ml 嘌呤霉素的生长培养基（见配方 1）替换培养基。
在 5 µg/ml 嘌呤霉素中培养细胞 4 天，以选择稳定表达 cyclinD1-APEX 的 N2A 细胞。

细胞培养和分化
细胞培养
文化 cyclinD1-APEX 在 30 ml 细胞培养生长培养基中的四个 15 cm 培养皿中稳定表达 N2A 细胞（参见配方 1），直到细胞达到 80% 汇合（细胞数为每培养皿约 3 × 10 7 个细胞）。
注意：这些培养皿中可用于细胞生长的表面为 151.9 平方厘米。用于这些培养皿的细胞培养基的总体积为每盘 30 毫升。
细胞分化
将四个 15 cm 培养皿中的细胞拆分为总共 14 个 15 cm 培养皿，每个培养皿包含大约 8 × 10 6 个细胞，并在含有 1% 外泌体耗尽 FBS 的 30 ml RA (10 µM) 培养基中孵育（参见配方 2 ）。
注意：每个时间点可在以下步骤中处理的最大培养基体积为 420 毫升。
孵育细胞 6 天。每 3 天用含 RA 的培养基（参见配方 2）喂养细胞。然后在第 6 天收集培养基。

收集条件培养基和沉积物 EV
将 14 个 15 厘米板中的条件培养基收集到单独的容器中。
注意：应收集大约 420 毫升的总条件培养基。
使用带有 F14S-6X250y FiberLite 固定转子（或等效离心机）的 Sorvall RC 6+ 离心机在 250 ml 试管中以 1,000 × g在 4°C下以 1,000 × g离心条件培养基15 分钟，以去除漂浮细胞（低转速）。
离心机完成后立即将上清液部分倒入新容器中。
注意：重要的是要记住不要打扰颗粒。
使用 Sorvall RC 6+ 离心机（配备 F14S-6X250y FiberLite 固定角转子）在 4°C 下以 10,000 × g离心上清液15 分钟，并沉淀大 EV 和细胞碎片（中速旋转）。
离心机停止后，立即小心地将上清液倒入新容器中。
注意：重要的是要记住不要打扰颗粒。
将 32 毫升收集的上清液转移到一个 38.5 毫升的超清管中。继续转移，直到装满 12 个 38.5 毫升的超透明管。
使用 SW-28 和 SW32 Ti 转子，以 ~100,000 × g (28,000 RPM) 在 4°C 下以最大加速度/制动离心 1.5 小时。
通过在 200 µl 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中移液 2 到 3 次，轻轻去除上清液并重悬沉淀部分。
将重悬的沉淀部分移入新的 5 ml 超清管中。
注意：合并 12 个管中的颗粒部分后，可以收集约 3 ml 的重悬颗粒。
用 PBS 将上述步骤的重悬液稀释至总体积约为 4.8 ml。
使用 SW-55 转子以大约 150,000 × g (38,500 RPM) 的速度离心样品1 小时 4°C 和最大加速度和制动。
轻轻去除上清液。向管中加入 100 µl PBS，室温孵育 30 分钟。
通过轻轻移液重悬沉淀。
添加 900 µl 60% 蔗糖。彻底混合直到制成均匀的悬浮液。
注意：蔗糖溶解在缓冲液 C 中（参见配方 3）。使用折光仪测量蔗糖浓度。折射计的读数应为 60。
首先，小心地加入 2 ml 40% 蔗糖，然后小心地将 1 ml 20% 蔗糖放在上面。非常缓慢和平稳地添加蔗糖培养基，以避免干扰垫子之间的层。三个不同密度的蔗糖应该是明显的。
注意：此步骤需要格外小心。将蔗糖慢慢分配到透明管的一侧，让它沿着管壁滴下。
使用 SW-55 转子以大约 150,000 × g (38,500 RPM) 的速度离心样品16 小时，温度为 4°C，且加速度最小，无制动。
注意：减速时不要刹车很重要。刹车可能会导致梯度中断。
一旦离心停止，从上到下吸出 ~0.8 ml 上清液。将 20%/40% 蔗糖界面（图 1）（此步骤的总体积约为 1 毫升）收集到新的 5 毫升超透明管中。
注意：注意不要破坏 40%/60% 蔗糖界面的第二个梯度。

图 1.过夜离心后 20%/40% 界面处的 EV

在 5 ml 超清管中稀释至 4.8 ml 的 PBS。
在SW-55 旋转器中以 ~150,000 × g (38,500 RPM)在 4°C 和最大加速和减速条件下离心1 小时。
轻轻倒出上清液，向管中加入100 µl PBS，室温孵育 30 分钟。
通过轻轻移液重悬 EV 颗粒。

NTA EV 测量
使用配备 405 nm 激光器的 NanoSight NS300 仪器估算 EV 尺寸和数量；以分散模式分析数据。
如上所述（D21）用过滤的 PBS 以 1,000 倍稀释收集的囊泡。
使用 Nanosight NTA 3.1 软件在 5 次重复 60 秒捕获期间以恒定流速自动将样品引入腔室，并在散射模式下在相机级别 13 下将样品引入腔室。
使用 Nanosight NTA 3.1 软件估计检测阈值处的 EV 大小，然后导出“实验摘要”和“粒子数据”（图 2）。

图 2. 用 RA 处理 6 天的 N2A 细胞的 420 毫升培养基的大小分布和纯化 EV 数量的纳米粒子跟踪分析。

从粒子数据中计算每个尺寸类别中的粒子数，并使用 Excel 合并、合并和计数轨道长度 >3 的“真实”粒子。
注意：~5 × 10 8到~2.5 × 10 9每 1 µl 粒子数通常在步骤 D21 EV 样本中计数。

第二部分：EV 中的 APEX 生物素化标记

孵化生物素-苯酚 (500 μM) 和 ~1 × 10 10纯化的 EV（参见第 I 部分中的步骤 D21），在 Eppendorf 管中总体积 <50 μl 的混合物中，在 37°C 下持续 30 分钟。在这一步准备两个样品。
注意：保持小体积以确保淬灭剂溶液洗涤后生物素-苯酚残留较少。
将混合物转移到两个 13.2 毫升的超透明管中。
通过添加 1 mM 启动 APEX 标记 (0.003%) H 2 O 2在一管中。
注意：对于另一根管子，进行如下相同的处理，但不要添加H 2 O 2 。这用作阴性对照。
1 分钟后，立即加入 12 毫升淬灭剂溶液（参见配方 4）。
在SW-41 转子和4°C 下以~110,000 × g (31,500 RPM)离心1 小时，最大加速度和制动。
使用猝灭剂溶液（见配方 4）沉淀和清洗 EV 一次。停止后，吸出上清液并加入 12 ml 猝灭剂溶液（参见配方 4）。
在SW-41 转子中以 ~110,000 × g (31,500 RPM) 在4°C 和最大加速和减速条件下离心1 小时。
轻轻倒出上清液部分。向管中加入40 µl PBS，室温孵育 30 分钟。
通过轻轻移液将 EV颗粒部分重悬在 40 µl PBS 中。
将两个 EV 样品转移到新的 Eppendorf 管中。
添加 4 × SDS 上样缓冲液（参见配方 5）以准备用于 SDS PAGE 和链霉亲和素-HRP 印迹的样品。
在 95°C 下孵育样品 10 分钟。
负载15 μ每泳道样品的升在10％Tris-甘氨酸凝胶的迷你。
在 150 V 的恒定电压下运行凝胶 1 小时。
将蛋白质从凝胶转移到 PVDF 膜上，恒定电流为 0.6 A，持续 1.5 小时。
在冷藏室 (4°C) 中，用 TBST 中的 5% BSA 封闭膜过夜。
将膜与链霉亲和素-HRP (1:10,000) 在室温下孵育 1 小时。
用 TBST 洗涤 3 次，每次洗涤 8 分钟。
按照制造商的规格添加 HRP 基材。使用 Chemidoc 成像系统开发信号。
注意：在证明 APEX 生物素化标记在 EV 中运行良好后，剩余的 EV 可用于以下步骤。

第三部分：细胞中的 APEX 生物素化标记

接收 mES 细胞中的 APEX 反应
准备两个 35 毫米的 ES 细胞培养皿，密度为 4 × 10 4 -5 × 10 4 /cm 2 。
将 cylinD1-APEX EV 与 MESC 在 N2B27 培养基（参见配方 6）中以 ~5 × 10 9 EV/ml 培养基的浓度孵育 2 天.
在 37°C 下预热 N2B27 培养基（参见配方 6）30 分钟，然后加入 2 将微升生物素-苯酚原液 (500 mM) 加入 2 ml N2B27 培养基中，制成 500 μM 生物素-苯酚溶液。
将上述溶液与细胞在 37°C 下孵育 30 分钟。
临用前，稀释 1 mM (0.003%) H 2 O 2进入每道菜的培养基中，在室温下进行 1 分钟的标记反应。使用没有 H 2 O 2的另一道菜作为阴性对照。
立即用室温淬灭剂溶液彻底清洗细胞 3 次以淬灭反应（参见配方 4）。
注意：确保使用淬灭剂溶液而不是纯 DPB 进行洗涤。
在补充有 10 mM 抗坏血酸钠、1 mM 叠氮化钠和 1× 蛋白酶抑制剂的 1 ml RIPA（参见配方 7）中裂解细胞。
在冰浴超声仪中对细胞裂解物进行超声处理 10 分钟，然后在 4°C 下以 10,000 × g离心10 分钟。
添加 40 微升将浓缩的链霉亲和素琼脂糖珠加入上清液部分 (800 μl)，然后将混合物在 4°C 下旋转过夜。
注意：用 1 ml RIPA清洗 40 μl链霉亲和素琼脂糖珠一次。
在 4°C 下以 3,000 × g离心上述样品10 分钟。丢弃上清液部分。
注意：确保以下所有缓冲液和样品都保存在冰上。
向链霉亲和素-琼脂糖珠中加入 1 ml RIPA 缓冲液（参见配方 7），并在 4°C 下旋转混合物 10 分钟。
在 4°C 下以 3,000 × g离心上述样品10 分钟。丢弃上清液部分。
注意：10 到 11 的过程在以下步骤中称为珠子洗涤。
用 RIPA 缓冲液再次清洗珠子（参见配方 7）。
用缓冲液 D 清洗珠子一次（参见配方 8）。
通过在补充有 2 mM 生物素和 20 mM DTT 的 4× SDS 加载缓冲液（参见配方 5）中在 95°C 下加热样品 10 分钟，从珠子上洗脱生物素化蛋白质。
负载15 μ每泳道样品的升在10％Tris-甘氨酸凝胶的迷你。在 150 V 的恒定电压下运行 1 小时。
Ponceau S 染色凝胶在室温下 3 分钟（图 3）。

图 3. cyclinD1-APEX EV 与 mESC 孵育后的链霉亲和素-HRP 印迹

注意：用 H 2 O 2 (B+H) 或不 (B)用生物素-苯酚处理 EV 预孵化 mESC 。通过使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶 (SA-HRP) 进行印迹检测生物素化蛋白。同一膜的 Ponceau S 染色（面板左侧）用作加载控制。

用 ddH 2 O清洗凝胶 3 次。
通过使用链霉亲和素-HRP 进行印迹评估生物素化蛋白质（图 3）。
注意：与第二部分，步骤 11 从 d 到 h 中的程序相同。

质谱 (MS) 分析
将第 III 部分步骤 A16 中的样品在 10% Tris-甘氨酸微型凝胶中电泳加热约 3 分钟。
用考马斯染色蛋白质，用新鲜的刀片从凝胶上切下染色带。
将样品提交到光谱分析设施（我们使用哈佛医学院的 Taplin Mass）进行蛋白质的凝胶内胰蛋白酶消化，然后根据其标准进行液相色谱和质谱分析。
质谱数据分析
获取原始 MS 数据后，通过 Proteome Discoverer 数据库使用默认设置在 Peaks Studio X+ 平台上执行肽识别、定量和过滤。
使用 R/Bioconductor-package Vsn 中的 justvsn 函数实现方差稳定归一化 (Vsn)，以归一化量化的蛋白质数据。
执行 T 检验分析以检查两个不同组之间蛋白质丰度的显着变化。

数据分析

使用 ImageLab 软件 v4.0 将免疫印迹图像导出为 .tif 格式。
使用 ImageJ 打开和处理免疫印迹图像，包括在必要时旋转、裁剪、调整亮度和对比度。
使用 GraphPad Prism 或首选程序准备数字（图 2）。

食谱

DMEM + 10% FBS（500 毫升）
50 毫升 FBS
450 毫升 DMEM
RA (10 μM) + DMEM 中的 1% 外泌体耗尽 FBS（500 ml）
5 ml 去除外泌体的 FBS
RA (10 μM)
添加DMEM至 500 毫升
缓冲液 C
20 mM Tris-HCl pH 7.4
137 毫米氯化钠
淬火液
10 mM 抗坏血酸钠
5 mM Trolox
10 mM 叠氮化钠
在 DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水）中
4 × 上样缓冲液（20 毫升）
将 1.6 g SDS 溶解在 6 ml ddH 2 O 中
添加 5 ml 1 M Tris-HCl pH 6.8
添加 1.23 克 DTT。溶解
加入8毫克溴酚蓝
加入8毫升甘油
添加 ddH 2 O 到 20 毫升
制作 1 ml 等分试样。储存在-20°C
N2B27 培养基（1 升）
475 毫升 DMEM/F12
475 毫升
20 毫升 B27
10毫升氮气
10 毫升 L-谷氨酰胺 (200 mM)
10毫升非必需氨基酸（100×）
1 ml 0.1 M β-巯基乙醇
RIPA
50 mM Tris，pH 7.4
150 毫米氯化钠
1% 海卫 X-100
0.5% 脱氧胆酸盐
0.1% SDS
1 mM Trolox
1 毫米 DTT
缓冲器 D
1 M氯化钾
0.1 M Na 2 CO 3
2 摩尔尿素
10 mM Tris-HCl，（pH 7.4）
TBS-T
0.1% 吐温 20 (v/v) 在 1× TBS 中

致谢

我们感谢 Alice Ting 教授实验室的技术建议。我们感谢现任和前任 Schekman 实验室成员，他们在本协议的开发过程中提供了技术建议。我们感谢霍华德休斯医学研究所的资助。我们也承认加州大学伯克利分校唐家的奖学金。该协议改编自宋等人。（2021 年；Doi：10.1083/jcb.202101075）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Budnik, V.、Ruiz-Canada, C. 和 Wendler, F.（2016 年）。细胞外囊泡完善了神经系统中的交流。 Nat Rev Neurosci 17(3): 160-172。
Christianson, HC, Svensson, KJ, van Kuppevelt, TH, Li, JP 和 Belting, M. (2013)。癌细胞外泌体依赖于细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的内化和功能活性。 Proc Natl Acad Sci USA 110(43): 17380-17385。
Chen, CL 和 Perrimon, N. (2017)。用于活细胞蛋白质组学分析的邻近依赖性标记方法。 Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 6(4)。
De Jong, OG, Kooijmans, SAA, Murphy, DE, Jiang, L., Evers, MJW, Sluijter, JPG, Vader, P. 和 Schiffelers, RM (2019)。细胞外囊泡给药：从想象到创新。Acc Chem Res 52(7): 1761-1770。
Hung, V., Udeshi, ND, Lam, SS, Loh, KH, Cox, KJ, Pedram, K., Carr, SA 和 Ting, AY (2016)。使用工程化过氧化物酶 APEX2 在活细胞中空间解析蛋白质组图谱。国家议定书 11(3): 456-475。
Lobingier, BT, Hüttenhain, R., Eichel, K., Miller, KB, Ting, AY, von Zastrow, M. 和 Krogan, NJ (2017)。时空解析活细胞中蛋白质相互作用网络的方法。单元格169(2)：350-360.e312。
Raposo, G. 和 Stoorvogel, W.（2013 年）。细胞外囊泡：外泌体、微囊泡和朋友。J Cell Biol 200(4): 373-383。
Shurtleff, MJ, Temoche-Diaz, MM, Karfilis, KV, Ri, S. 和 Schekman, R. (2016)。Y-box 蛋白 1 需要在细胞和无细胞反应中将 microRNA 分选为外泌体。Elife 5：e19276。
Song, L.、Tian, X. 和 Schekman, R. (2021)。来自神经元细胞的细胞外囊泡通过 cyclinD1 促进 mESCs 的神经诱导。J Cell Biol 220(9)：e202101075。
Temoche-Diaz, MM, Shurtleff, MJ, Nottingham, RM, Yao, J., Fadadu, RP, Lambowitz, AM 和 Schekman, R. (2019)。microRNA 分选到癌细胞衍生的细胞外囊泡亚型的不同机制。 Elife 8：e47544。
Van Niel, G.、D'Angelo, G. 和 Raposo, G.（2018 年）。揭示细胞外囊泡的细胞生物学。Nat Rev Mol Cell Biol 19(4): 213-228。

版权所有 © 2021 作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。 1