材料和试剂

96孔低调裙边PCR板（Thermo Scientific，目录号：AB0800W）
细长聚球藻PCC 7942 WT（野生型菌株，在本机位点具有一个 RuBisCO 操纵子拷贝）
细长聚球藻PCC 7942 Syn02（具有两个 RuBisCO 操纵子拷贝的工程菌株：一个在天然位点，另一个在中性位点；Garcia等，2021）
RNeasy Protect Bacteria Mini Kit（QIAGEN，目录号：74524）
脱氧核糖核酸酶I，扩增级（Invitrogen，目录号：18068-015）
SuperScript TM IV 第一链合成系统（Invitrogen，目录号：18091050）
Q5 ®高保真DNA聚合酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0491）
PowerUp TM SYBR TM Green Master Mix（Applied Biosystems，目录号：A25742）
琼脂糖，LE，分析级（Promega，目录号：V3125）
SYBR TM Safe DNA Gel Stain（Invitrogen，目录号：S33102）
牛血清白蛋白（BSA）标准品（Lee BioSolutions，目录号：100-10-0.25）；浓度 [µg/ml]: 25, 125, 250, 500, 750, 1,000, 1,500, 2,000
Pierce TM BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23225）
Tris（Thermo Fisher Scientific，目录号：PRH5131）
过硫酸铵，APS（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
TEMED（Bio-Rad，目录号：1610801）
30％丙烯酰胺/双溶液（Bio-Rad，目录号：1610158）
Precision Plus Protein TM双色标准品（Bio-Rad，目录号：1610374）
Revert TM 700 Total Protein Stain（LI-COR Biosciences，目录号：926-11011）
兔抗 RbcL 抗体（Agrisera，目录号：AS03 037）
脱脂奶粉（LabScientific，目录号：M0841）
IRDye ® 800CW 山羊抗兔 IgG 二抗（LI-COR Biosciences，目录号：926-32211）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
连二亚硫酸钠/连二亚硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：157953）
无水甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
Tween ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
乙二胺四乙酸，EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：ED）
来自鸡蛋清的溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L4919）
蛋白酶 K（QIAGEN，目录号：19131）
甘氨酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：PRH5073）
十二烷基硫酸钠，SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
截距® （TBS）封闭缓冲液（LI-COR Biosciences公司，目录号：927-60001）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
无水乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：443611）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
硝酸钠，NaNO 3 （Thermo Fisher Scientific，目录号：BP360-500）
七水硫酸镁，MgSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：230391）
二水氯化钙，CaCl 2 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
磷酸二氢钾，K 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
碳酸钠，Na 2 CO 3 （Supelco，目录号：SX0395）
柠檬酸一水合物，C 6 H 8 O 7 ·H 2 O（JT Baker，目录号：0115-01）
柠檬酸铵铁（III），C 6 H 11 FeNO 7 （Sigma-Aldrich，目录号：F5879）
乙二胺四乙酸二钠盐，Na 2 EDTA·2H 2 O（Alfa Aesar，目录号：A15161）
硼酸，H 3 BO 3 （JT Baker，目录号：0084-01）
四水氯化锰（II），MnCl 2 ·4H 2 O（JT Baker，目录号：2540-01）
七水硫酸锌，ZnSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251）
二水钼酸钠，Na 2 MoO 4 ·2H 2 O（JT Baker，目录号：3764-01）
五水硫酸铜（II），CuSO 4 ·5H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C8027）
硝酸钴（II）六水合物，Co（NO 3 ）2 ·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：239267）
BG-11 培养基（见配方）
变性裂解缓冲液（见配方）
Laemmli 样品缓冲液（见配方）
聚丙烯酰胺分离胶（见配方）
聚丙烯酰胺浓缩凝胶（见配方）
连二亚硫酸钠饱和溶液（见配方）
TAE 缓冲液（见配方）
TBS 缓冲液（见配方）
TBST 缓冲液（见配方）
TE 缓冲液（见配方）
TE 裂解缓冲液（见配方）
TGS 缓冲液（见配方）
转移缓冲液（见配方）

设备

250 毫升带海绵盖的玻璃烧瓶 (Thermo Fisher Scientific)
配备光源的受控环境室（Percival，型号：I36LLVLC8）
紫外-可见分光光度计（安捷伦，型号：Cary 60）
Heraeus Multifuge Centrifuge（Thermo Scientific，型号：X3 FR）
Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge（Thermo Scientific，目录号：75002431）
NanoDrop 2000c 分光光度计（Thermo Scientific，目录号：ND-2000C）
干浴数字加热块（基准，型号：BSH1002）
数字摇床（VWR，型号：5000）
模拟涡流混合器（Fisher Scientific，型号：02215414）
热循环仪（Applied Biosystems，型号：2720）
绝对 qPCR 板密封件（Thermo Scientific，目录号：AB1170）
实时热循环仪（Analytik Jena AG，型号：qTOWER 3 G）
微波
250 毫升烧杯
声波器（Qsonica，型号：Q125）
硝酸纤维素膜（Thermo Scientific，目录号：88018）
Mini-PROTEAN ® Tetra 垂直电泳细胞系统（Bio-Rad，目录号：1658004）
Mini Trans-Blot电泳转移细胞系统（Bio-Rad，目录号：1703930）
Odyssey ® Fc 成像系统（LI-COR Biosciences，型号：2800-03）
Oxygraph+系统（Hansatech Instruments，目录号：OXY1+）

软件

qPCRsoft（Analytik Jena AG，版本：3.1）
Image Studio TM (LI-COR Biosciences, version: 5.0)
Quantity One ®一维分析（Bio-Rad，版本：4.6.7）
OxyTrace+ (Hansatech Instruments)
微软 365 Excel

程序

总 RNA 分离和逆转录制备
在用海绵盖住的 250 毫升玻璃烧瓶内，在 50 毫升 BG-11 培养基中制备两种S. elongatus菌株（PCC 7942 WT 和 Syn02）的培养物。在受控环境室 (Percival) 中于 30°C下在所需的选定 CO 2浓度下孵育，在 80 μmol·m -2 ·s -1光照下缓慢搅拌。
注意：培养时间取决于需要测量 RuBisCO 表达的生长阶段。在这里，我们收集了早期指数期的细胞。
一旦培养物达到指示预期生长期的所需 OD 750值，收获细胞。
注意：为了使蓝藻数量和分离的 RNA 产量正常化，我们收获了 6 ml 的培养物，稀释到 ~OD 750 = 1.0。
将收集的培养物以 4,700 × g离心10 分钟。
注意：由于 mRNA 转换非常快，我们建议将细胞直接倒在 Falcon 管中的冰上，并在 4°C 下离心。在某些情况下，还建议在收获细胞前使用终止液（95% 乙醇、5% 苯酚—— 总体积的 1/5）。
倒出上清液并将沉淀的细菌重新悬浮在 2 ml TE 缓冲液中。
使用 RNeasy Protect Bacteria Mini Kit 提取 RNA，遵循 RNAprotect Bacteria Reagent Handbook – Protocol 4: Enzymatic Lysis and Proteinase K Digestion of Bacteria，进行多项调整以确保分离 RNA 的高产量，如下所述：
将 4 ml RNA Protect Bacteria Reagent 和 2 ml 细胞悬液（在步骤 A4 中制备）混合在 15 ml 锥形管中。
在室温下以 4,700 × g离心10 分钟。
倒出上清液，并在室温下以4,700 x g重新离心沉淀2 分钟，用移液器吸头丢弃残留的上清液。
注意：如有必要，颗粒可以在 -80°C 下冷冻以在另一天进行。
加入 200 µl 含有 15 mg/ml 溶菌酶和 100 µg/ml 蛋白酶 K 的 TE 缓冲液，并通过上下吹打重悬沉淀。
注意：在 TE 缓冲液中加入溶菌酶足以裂解蓝藻细胞，但加入蛋白酶 K 可以提取更多的总 RNA。
涡旋混合 10 秒，然后在室温下孵育重悬在 TE 裂解缓冲液中的细胞 10 到 20 分钟，同时在振荡器上不断摇动悬浮液。
笔记：
我们延长了原始 RNeasy Protect Bacteria Mini Kit 方案的孵育时间，以确保刚性蓝藻细胞壁充分分解。
洗脱总 RNA 后，使用 NanoDrop 测量其浓度并将 RNA 样品储存在 -80°C 或立即进行 DNase I 处理（下一步）。或者，使用 Qubit 荧光计 (Invitrogen) 代替 NanoDrop 来测量 RNA 浓度。Qubit 被推荐用于核酸的精确定量，但在本协议中未使用。
加入 700 µl RLT 缓冲液（每 1 ml RLT 缓冲液补充 10 µl β-巯基乙醇）并剧烈涡旋几秒钟。
加入 500 µl 96% 乙醇（分子级），上下吹打混合（不要离心）。
将 700 µl 裂解液转移到 RNeasy Mini Spin Column 中，置于 2 ml 收集管中，并在室温下以 10,000 × g离心 15 秒。
弃去流出液，加入剩余的裂解液，并按照上一步进行离心。
加入 700 µl Buffer RW1，室温10,000 × g离心15 s 洗膜，弃去流出液。
加入 500 μl 缓冲液 RPE（通过将 44 ml 100% 乙醇加入试剂盒中的 11 ml RPE 浓缩液制备），室温下以10,000 × g离心15 秒以洗涤膜，并丢弃流过液.
再加入 500 µl 缓冲液 RPE 并在室温下以 10,000 × g离心2 分钟。
将 RNeasy Mini 离心柱置于新的 2 ml 收集管中，并在室温下全速 (17,000 × g )离心1 分钟。
将离心柱置于新的 1.5 ml 收集管中，将 40 µl RNase-free 水直接加入膜中心，室温下17,000 × g离心1 分钟以洗脱总 RNA。
使用 NanoDrop 测量洗脱液中的 RNA 浓度。
将 RNA 样品储存在 -80°C 或立即进行 DNase I 处理（下一步）。
将 RNA 样品放在冰上，根据制造商提供的说明准备含有扩增级 DNase I 的反应，并进行一些实质性调整以提高分离 RNA 的纯度：
使用 4 U 的 DNase I (4 µl) 而不是 1 U (1 µl)。
注意：额外的 DNase I 应该有助于完全消除残留的 gDNA。
将总反应体积增加到 20 µl。加入 1 µg RNA 和 2 µl 10×DNase I Reaction Buffer 后，必要时加入不含 RNase 的水。
注意：提供足够体积的每个 RNA 样本用于逆转录（在阳性反应和阴性对照中；步骤 B2）。
在室温下将孵育时间从推荐的 15 分钟延长至 60 分钟。
注意：这是确保完全消除 gDNA 的另一个步骤（除了增加 DNase I 的量）。我们没有观察到增加 DNase I 浓度和孵育时间对 RNA 质量（稳定性）的任何实质性不利影响。
在 65°C 孵育 10 分钟之前，向每个反应中加入 2 µl 25 mM EDTA 以灭活 DNase I。
使用 NanoDrop 或 Qubit 荧光计测量 DNase I 处理过的样品中的 RNA 浓度（我们还建议在凝胶上运行 RNA 以确保其不会降解）。将样品储存在 -80°C 或立即进行逆转录。
注意：我们通常会获得 50-100 ng/ml 的最终浓度。

逆转录和 qPCR
使用 SuperScript TM IV 第一链合成系统对 RNA 样品进行逆转录 (RT)。根据试剂盒中提供的说明，准备将引物退火到模板 RNA 的反应。每个反应，使用：
1 µl 50 µM 随机六聚体
1 µl 10 mM dNTP 混合物
1 µl DEPC 处理水
10 µl RNA 样本
为每个 RNA 样品准备两个相同的反应，如步骤 B1 中所述。一个反应为阳性（添加逆转录酶以获得用于 qPCR 分析的 cDNA），另一个反应为阴性（不添加逆转录酶；因此，样品中应仅保留 RNA）。将反应在 65°C 下加热 5 分钟，然后在冰上孵育至少 1 分钟。
为步骤 B2 中获得的所有 RNA 引物样品准备逆转录 (RT) 主混合物。每个样本，使用：
4 µl 5×SSIV 缓冲液
1 µl 100 mM DTT
1 µl RNase 抑制剂
将 RT 主混合物分装到含有步骤 B2 中制备的 RNA 引物样品的管中；将 6 µl 混合物转移到每个 RNA 引物样品中。
将 1 µl 试剂盒中的 SuperScript IV 逆转录酶添加到步骤 B2 中制备的每个 RT 阳性反应中（总反应体积为 20 µl）。
在步骤 B2 中制备的每个阴性对照中加入 1 µl DEPC 处理过的水（总反应体积为 20 µl）。
依次孵育所有反应：
在室温下放置 10 分钟。
在 50-55°C 下保持 10 分钟。
在 80°C 下保持 10 分钟。
将反应储存在 -80°C 或立即进行步骤 B8。
通过 PCR 检查步骤 B7 中生成的 cDNA 模板的质量（表 1和2 ）。使用也将用于后续 qPCR的引物（表 4 ）。它们应该能够在正反应中产生预期大小的产物。评估 cDNA 模板的纯度。阴性对照不应产生 PCR 产物。否则，cDNA 模板可能会被 gDNA 污染。

表 1. 检查生成的 cDNA 模板质量的 PCR 样品组成

表 2.检查生成的 cDNA 模板质量的 PCR 参数

在 TAE + 2% (w/v) 琼脂糖凝胶中对 PCR 产物进行电泳。如果特定 PCR 产物仅在 RT 阳性反应中产生，而阴性对照中没有产物，则进行 qPCR（步骤 B10）。
为在步骤 B7 中获得并在步骤 B8 和 B9 中进行质量检查的每个 RT 阳性反应准备单独的 qPCR 主混合物。每个主混合物的总体积应足以测试每个 qPCR 样本所需基因数量的表达，一式三份（表 3 ）。
注意：我们准备了两个 qPCR 预混液（针对每个 WT 和 Syn02 菌株），足以进行 6 次反应，因为我们在三个技术重复中分析了两个基因的表达：rbcL 和 secA；表 4 )。

表 3. qPCR 样品的组成

表 4. qPCR 中使用的引物。F、前进；R，反转。

将 9 µl 的每个 qPCR 主混合物分装到 96 孔板中适当数量的孔中（取决于反应的数量）。
将 1 µl 每对 5 µM 引物（下表中列出的引物）添加到 96 孔板中的一式三份 qPCR 样品中。
在 96 孔板中制备 NTC（无模板控制）样品，类似于 qPCR 样品（步骤 B10-B12），但添加无核酸酶水而不是 RT 阳性反应。
使用配备 qPCRsoft 软件的实时热循环仪 qTOWER 3 G短暂旋转板并启动 qPCR（表 5 ）。

表 5. qPCR 参数

将 qPCR 结果导出到 Excel 电子表格（表 6 ），并使用双增量 Ct 方法（表 7 ）计算归一化为secA的rbcL （即平均倍数变化）的相对表达。

表 6. qPCR 获得的示例数据。样品（来自 WT 和 Syn02 菌株）以三个生物学重复制备。获得三个技术重复的循环阈值 (Ct)，然后取平均值 (Avg. Ct)。

表 7.使用双 delta Ct 方法计算相对rbcL表达式的示例。rbcL的相对表达被标准化为secA （ΔCt = Avg. Ct rbcL – Avg. Ct secA ）。计算 ΔΔCt 的示例：ΔΔCt Syn02#1 = ΔCt Syn02#1 – Avg. ΔCt WT 。

变性条件下的总蛋白提取
在用海绵盖住的 250 毫升玻璃烧瓶内，在 50 毫升 BG-11 培养基中制备两种S. elongatus菌株（PCC 7942 WT 和 Syn02）的培养物。在所需的 CO 2浓度下在 30°C、120 rpm 搅拌和 80 μmol·m -2 ·s -1光照下在受控环境室 (Percival) 中孵育。
注意：取决于需要测量 RuBisCO 表达的生长阶段。在这里，我们收集了早期指数期的细胞。
当培养物达到所需的 OD 750值时，收获培养物（标准化很重要，以确保在每个样品中处理相似数量的蓝藻以产生相似浓度的提取总蛋白；我们使用 OD 750 = ~1.0）。
在室温下以 4,700 × g离心收集的培养物10 分钟。
倒出上清液，并在室温下以4,700 x g重新离心沉淀2 分钟，用移液器吸头丢弃残留的培养基。
在加热块中将变性裂解缓冲液预热至 95°C。
使用微波炉在 250 毫升烧杯中煮沸去离子水。
向细菌沉淀中加入 500 µl 热变性裂解缓冲液。立即将带有沉淀物的管子浸入煮沸的去离子水中，并通过用力上下吹打几次来重新悬浮蓝藻细胞。
将细胞悬液转移到新的 1.5 ml 管中，并在 95°C 下加热 10 分钟。在孵化时间的中途短暂涡旋管子。
对获得的裂解物进行 3 × 10 s 超声处理，间隔为 10 s，振幅为 40%（无需在冰上孵育）。
在室温下以 17,000 × g离心裂解物10 分钟，并将上清液转移到新的 1.5 ml 管中。
使用 Pierce TM BCA 蛋白质检测试剂盒测量澄清裂解物中的总蛋白质浓度。
将裂解物储存在 -80°C，直到进行 SDS-PAGE。

SDS-PAGE 总蛋白分离和蛋白质印迹免疫检测
将制备的蓝藻细胞裂解物与 Laemmli 样品缓冲液混合，以获得含有 5 µg 总蛋白质的样品。
注意：SDS-PAGE 中使用的总蛋白量取决于通过蛋白质印迹获得的预期 RuBisCO 信号强度。我们建议用 RuBisCO 信号强度绘制校准曲线作为总蛋白质量的函数。这将允许估计总蛋白量的最佳范围，在该范围内 RuBisCO 的信号强度与总蛋白水平相关。
将步骤 1 中制备的样品上样到在 Mini-PROTEAN ® Tetra 垂直电泳槽系统中组装的 6% (v/v) 聚丙烯酰胺浓缩胶上，并置于 TGS 缓冲液中。
在 100-150 V 下运行电泳，直到样品迁移通过 12% (v/v) 聚丙烯酰胺分离胶。
使用 Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell 系统以 90 mA（恒定）在 4°C 下将凝胶中溶解的总蛋白质转移到转移缓冲液中的硝酸纤维素膜上，持续 16 小时。
注意：或者，在 4°C 下以 400 mA（恒定）传输 1 小时。更长传输时间的优点是它不会产生与 1 小时传输一样多的热量，这可能会导致更好的分辨率条带。
可选：将含有转移蛋白的膜在室温下干燥约 20 分钟。
注意：此步骤可能会增加膜中的蛋白质固定，从而可能在免疫检测过程中产生更清晰的目标蛋白带（背景信号也可能会增加）。
用去离子水简单冲洗膜。
将 3-5 ml Revert TM 700 Total Protein Stain 倒在膜上，使其均匀覆盖，并在室温下轻轻搅拌孵育 5 分钟，直至可见清晰的总蛋白染色条带。
用 3-5 ml 洗涤液在室温下轻轻搅拌 30 秒，从膜上洗掉多余的污渍。
在去离子水中简单冲洗洗过的膜，并使用 Odyssey ® Fc 成像系统在 700 nm 处获取图像。记录的信号代表总蛋白质染色以标准化 RuBisCO 蛋白质数量。
注意：据我们所知，在西方分析中没有使用特定的蓝藻蛋白作为通用参考（加载控制）。因此，蓝藻中蛋白质表达的分析通常涉及对总蛋白质染色的归一化。
用去离子水冲洗膜。
通过在室温下在 5% (w/v) 脱脂牛奶中的 TBS 中孵育 1 小时并轻轻搅拌来封闭膜。
注意：如果需要，孵化时间可以缩短 30 分钟。
在含有兔抗 RbcL 抗体的抗体溶液中孵育膜，该抗体溶液在 TBST 中以 1:5,000 稀释，含有 5% (w/v) 脱脂牛奶和 0.03% (w/v) 叠氮化钠，在 4°C 下轻轻搅拌过夜.
注意：或者，将膜在抗体溶液中在室温下轻轻搅拌孵育 1 小时。我们不建议在另一天（过夜或孵育 1 小时后）重复使用相同的抗体溶液。
丢弃抗体溶液并在 TBST 中短暂洗涤膜，然后在室温下在 TBST 中轻轻搅拌 1 × 15 分钟和 3 × 5 分钟洗涤。
将膜在 IRDye ® 800CW 山羊抗兔 IgG 二抗中孵育1 小时，该二抗在 Intercept ® (TBS) 封闭缓冲液中以1:20,000 稀释，并补充有 0.1% (v/v) Tween-20，在室温下轻轻搅拌，保护从光。
弃去二抗溶液并在 TBST 中短暂洗涤膜，然后在室温下轻轻搅拌在 TBST 中洗涤 1 × 15 分钟和 3 × 5 分钟。
在去离子水中冲洗膜并使用 Odyssey ® Fc 成像系统在 700 nm（以显示蛋白质质量标准）和 800 nm（以获取 RuBisCO 大亚基 RbcL 的信号，预期条带大小约为 55 kDa）下获取图像）。
注意：Garcia 等人，2021 年显示了免疫检测 RbcL 的示例。
使用适当的软件，如 Image Studio (LI-COR) 或 Quantity One (Bio-Rad)，对获得的蛋白质条带进行光密度分析。将 RbcL 信号标准化为相应的总蛋白染色信号（在步骤 D9 中获得）。将每个 Syn02 菌株复制培养的归一化 RbcL 信号强度与所有 WT 复制培养的平均归一化 RbcL 信号强度进行比较。Syn02菌株中RbcL表达水平可以表达WT表达水平的倍数变化。

光合析氧速率的测定
在用海绵盖住的 250 毫升玻璃烧瓶内，在 50 毫升 BG-11 培养基中制备两种S. elongatus菌株（PCC 7942 WT 和 Syn02）的培养物。在受控环境室 (Percival) 中在 30°C、120 × g （我们使用环境空气）和 80 µmol·m -2 ·s -1 的照明下在所需的 CO 2浓度下孵育。
注意：取决于需要测量 RuBisCO 表达的生长阶段。在这里，我们收集了早期指数期的细胞。
一旦培养物达到指示预期生长期的 OD 750值，收获细胞。
注意：为了使 Oxygraph+ 系统反应室中被分析的蓝藻数量正常化，我们收获了与 A 部分相同数量的细菌培养物。
在室温下以 5,000 × g离心收集的培养物10 分钟。
倒出上清液并在 1 ml BG-11 培养基中重悬细胞。
同时，组装由安装在电极盘上的克拉克型氧电极、氧电极室和由计算机操作的 Oxygraph+ 电极控制单元组成的 Oxygraph+ 系统。按照制造商提供的手册（Oxygraph+ 系统手册，2.0 版，Hansatech Instruments Ltd，2017 年）执行步骤。
注意：手册包含详细的图片，也可能有助于正确组装仪器。
使用液相校准过程校准 Oxygraph+ 系统。按照制造商提供的手册中的步骤操作（Liquid Phase Calibration Guide，第 2 版，Hansatech Instruments Ltd，2017 年）。
测量步骤 E4 中制备的细胞悬浮液的 OD 750值。
用铝箔包裹细胞悬浮液以保护它们免受光照，并在室温下轻轻搅拌孵育 15 分钟。
注意：在开始使用 oxygraph 进行测量时，缩短 15 分钟的孵育时间可能会导致更高的背景氧气水平。它还可能会引入更高的记录氧波动，这反过来又可能导致重复之间的偏差增加。
将菌悬液加入氧电极室的反应容器中。
注意：细菌悬液的总体积必须为 0.2-2.5 毫升。我们用了 1 毫升。
插入防止大气氧气扩散到反应容器中的气密柱塞组件。
打开搅拌（使用 OxyTrace+ 软件将搅拌器速度设置为 100）。
在测量过程中打开光源照亮反应容器。在实验过程中，光源与反应容器的距离必须保持恒定——氧气的产生严格取决于可用光的数量。使用高光强度。
开始使用 OxyTrace+ 记录析氧长达 10 分钟（信号可能在几分钟后才开始稳定增加）。
在连续三分钟内计算析氧率（表示为每毫升细菌悬浮液产生的 O 2纳摩尔数），同时产生的氧气水平稳定增长而不会中断（表 8）。
根据 Zavřel等人的协议，测量细菌悬浮液中叶绿素a的浓度。(2015)。
注意：我们使用以下公式计算叶绿素 a 的浓度：Chl a [µg/ml] = 12.9447 (A 665 – A 720 )。
规格化氧释放速率在蓝藻混悬剂其OD 750值在步骤E7测定叶绿素一个在步骤15中测量的浓度（表8 ）。
注意：作者通常使用所提出的方法之一进行规范化。以OD 750归一化的氧析出速率表示为μM O 2 ·min -1 ·OD 750 -1 ，归一化为叶绿素a – 表示为nmol O 2 ·h -1 ·μg 叶绿素a -1 。

表 8. 使用 Oxygraph+ 系统测量并标准化为 OD 750和叶绿素a含量的示例氧气析出率

在开始对另一个样品进行析氧速率测量之前，用去离子水彻底冲洗反应容器。在三个生物学重复中对每个菌株进行分析。

数据分析

除非另有说明，否则示例结果表示为至少三个独立的技术和生物学重复的平均值和样本标准偏差 (SD) 值。结果的显着性使用Microsoft 365 分析工具库加载项执行的双尾t检验进行统计分析。假设方差相等的未配对样本t检验用于比较不同蓝藻菌株获得的值。

食谱

BG-11 培养基（Rippka等，1979）
17.6 mM NaNO 3
0.3 mM MgSO 4 ·7H 2 O
0.24 mM CaCl 2 ·2H 2 O
0.23 mM K 2 HPO 4
0.19 mM Na 2 CO 3
0.031 mM C 6 H 8 O 7 ·H 2 O
0.021 mM C 6 H 11 FeNO 7
0.0027 mM Na 2 EDTA·2H 2 O
46 mM H 3 BO 3
9 mM MnCl 2 ·4H 2 O
0.77 mM ZnSO 4 ·7H 2 O
1.6 mM Na 2 MoO 4 ·2H 2 O
0.3 mM CuSO 4 ·5H 2 O
0.17 mM Co(NO 3 ) 2 ·6H 2 O
高压釜 K 2 HPO 4 、Na 2 CO 3和 C 6 H 11 FeNO 7与其他介质组分分开，以避免形成沉淀物。高压灭菌后合并，并将完成的培养基在 4°C 下储存长达数月。
变性裂解缓冲液
10 mM Tris，pH 8.0
1 mM EDTA
1% (w/v) SDS
Laemmli 样品缓冲液
50 mM Tris，pH 6.8
2% (w/v) SDS
10% (v/v) 甘油
5% (v/v) β-巯基乙醇
0.05% (w/v) 溴酚蓝
制备成 4 倍浓缩液，冷藏或在室温下储存长达数月。
聚丙烯酰胺分离胶
12% (v/v) 丙烯酰胺/双溶液
375 mM Tris，pH 8.8
0.1% (w/v) APS
0.1% (v/v) TEMED
聚丙烯酰胺浓缩凝胶
6% (v/v) 丙烯酰胺/双溶液
125 mM Tris，pH 6.8
0.1% (w/v) APS
0.1% (v/v) TEMED
连二亚硫酸钠饱和溶液
将 18.2 g 连二亚硫酸钠溶解在 100 ml 去离子水中。
TAE缓冲液
40 mM Tris，pH 8.6
20 mM 醋酸
1 mM EDTA
TBS 缓冲液
50 mM Tris，pH 7.5
150 毫米氯化钠
TBST 缓冲器
50 mM Tris，pH 7.5
150 毫米氯化钠
0.1% (v/v) 吐温® 20
TE缓冲液
10 mM Tris，pH 8.0
1 mM EDTA
TE 裂解缓冲液
30 mM Tris，pH 8.0
1 mM EDTA
15 毫克/毫升溶菌酶
10% (v/v) 蛋白酶 K
TGS缓冲液
25 mM Tris，pH 8.3
192 mM 甘氨酸
0.1% (w/v) SDS
传输缓冲区
25 mM Tris，pH 8.3
192 mM 甘氨酸
20% (v/v) 甲醇

致谢

我们感谢 Amanda Garcia、Katie McGrath 和 Arnaud Taton 的反馈；和 Susan Golden 提供野生型S. elongatus菌株。这项研究得到了美国国家科学基金会 (#1724090) 和 NASA 早期职业教师奖 (#80NSSC19K1617) 的支持。

利益争夺

作者没有利益冲突。

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