材料和试剂

Bullet 管，刻度 1.5 ml，天然（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
离心管，康宁 15 和 50 ml 锥形管（Millipore Sigma，目录号：430052 和 430290）
透析管，Spectrapor Standard RC，12-14 kD 截止值，16 mm 直径（Fisher Scientific，目录号：132678）
手套，无粉（钴，目录号：N-193）
Parafilm，4英寸（Fisher Scientific，目录号：13-374-12）
移液器吸头，Avant Premium Low Binding 1-200 μl（Midwest Scientific，目录号：AVR2）
注射器，Norm-Ject 1 ml Tuberkulin（Henke Sass Wolfe，目录号：4010-200V0）
注射器过滤器，Whatman Anotop 10，0.02 μm（Cytiva，目录号：6809-1022）
真空过滤系统，康宁 500 毫升，0.2 微米过滤器（Millipore Sigma，目录号：CLS431097）
称重盘，聚苯乙烯，67 mm（Fisher Scientific，目录号：02-202-101）
Pyrex 培养基储存瓶，1 L（Fisher Scientific，目录号：S14255）
Kimwipes（Fisher Scientific，目录号：06-666）
牛血清白蛋白，组分 V，RIA 和 ELISA 级（Millipore Sigma，目录号：126593）
乙醇，200 证明（Decon Labs，目录号：2716）
HCl，ACS（Carolina Biological Supply，目录号：867792）
Hellmanex III（Fisher Scientific，目录号：14-385-864）
KH 2 PO 4 （EMD Millipore，目录号：529568）
Na 2 HPO 4 （JT Baker 99.6%，目录号：3828-5）
NaCl（JT Baker Ultrapure，目录号：4058-07）
NaOH（固体）（Acros Organics，目录号：450580025）
10×PBS（1升）（见食谱）
PBS（1 L）（见食谱）

设备

分析天平，Mettler AE100（Mettler Toledo，不再生产，替代类似的分析天平）
离心机（Beckman Coulter Microfuge 18，不再生产，替代类似的高速微量离心机）
色谱系统，AKTA Pure 150（Cytiva Life Sciences，目录号：29046665）
计算机，Dell Precision 3431 工作站，Windows 10 操作系统（不再生产，替代同类计算机）
Cuvette，Malvern Pananalytical ZEN 2112（Fisher Scientific，目录号：NC9289172）
馏分收集器，F9-R（Cytiva Life Sciences，目录号：29011362）
冰箱，-86 至 -50°C，VWR 型号 40086D（VWR International，目录号：10002-786）
磁性搅拌棒，八角形，PTFE，1 英寸（Fisher Scientific，目录号：14-513-51）
磁力搅拌器，康宁 PC-17 （Millipore Sigma，目录号：CLS6795171）
粒度分析仪，Zetasizer Nano S (Malvern Pananalytical)
pH计，Thermo Scientific OrionStar A211（Fisher Scientific，目录号：13-645-519）
移液器，Gilson Pipetman，20 μl 和 200 μl（Fisher Scientific，目录号：F123600 和 F123601）
尺寸排阻色谱柱，HiLoad 16/600 Superdex 200 制备级（Cytiva Life Sciences，目录号：28989335）
分光光度计，贝克曼 DU650（不再生产，具有紫外吸收能力的替代分光光度计）
顶部装载天平，梅特勒托利多 XS4002S（梅特勒托利多，不再生产，替代类似的顶部装载天平）
真空干燥器，Nalgene 280 mm × 251 mm（Millipore Sigma，目录号：D2797）
粘度计，Lovis 200 M（可选）（安东帕）
水浴，Fisher Versa Bath（不再生产，替代同类浴）
水净化系统，Synergy UV-R 生产超纯（I 型）水 (EMD Millipore)

软件

Zetasizer 软件，版本 8.01（Malvern Pananalytical，https: //www.malvernpanalytical.com/en/ ）
SEDFIT，版本 15.36（Schuck，P.，http: //www.analyticalultracentrifugation.com/ ）
Excel 2016（微软，https://www.microsoft.com/zh-cn/）
SEDNTERP，版本 20130813BETA (赫顿, 2012; http://www.rasmb.org/sednterp/ )

程序

通过尺寸排阻色谱 (SEC) 纯化单体 BSA
除 66 kDa BSA 单体外，部分 V，冻干 BSA 还包含 BSA 二聚体和三聚体。它还含有 H 2 O 和其他未知的低分子量赋形剂。
为 SEC 制备粗 BSA
将 3 ml 0.154 M NaCl、5.6 mM Na 2 HPO 4和 1.06 mM KH 2 PO 4 ，pH 7.4 (PBS) 添加到 15 ml 锥形管中（参见食谱）。
使用分析天平在称重船中称取约 60 毫克 BSA。
将 BSA 添加到锥形管中。它很容易溶解。
用 BSA 溶液清洗称重船以收集更多材料。添加到锥形管中。
测量BSA的浓度
在 PBS 中进行 1/50 稀释。
读取 280 nm 和 320 nm 处的吸光度。
以 mg/ml 计算 BSA 的浓度：

其中b是光程长度，BSA使用 280 nm 处的消光系数ε 280为 0.678 (mg/ml) -1 cm -1 。乘以稀释因子得到未稀释 BSA 的浓度。它应该是大约 12 毫克/毫升。
将 8 英寸长的 SpectraPor 16 毫米直径透析管浸泡在 H 2 O 中约 30 分钟。
用大约 50 ml H 2 O冲洗管子，然后用 10 ml PBS冲洗一次。
将管子的一端打三个结，加入 3 ml BSA 溶液并在管子的另一端打三个结进行密封。
对 1 L PBS 透析 6 小时，然后在室温下对 1 L 新鲜 PBS 透析过夜。在搅拌板上使用覆盖有封口膜的 1 L 烧杯，搅拌棒旋转以轻轻旋转透析管。
透析完成后，用剪刀小心地剪开透析管的顶部，用移液管取出 BSA 溶液，加入 5 ml 试管中。
如上所述测量 BSA 浓度以检查材料损失。
BSA SEC
用 60 ml H 2 O、60 ml 0.5 M NaOH、60 ml H 2 O 和 375 ml PBS以 1 ml/min 的速度洗涤和平衡 Superdex 200 SEC 柱，所有这些都在室温下进行。
使用样品环以 1 毫升/分钟的速度加载 ~1.5 毫升 ~12 毫克/毫升 BSA。
将 45 ml 收集到单个馏分中，并以 1 ml/min 的速度收集 0.8 ml 馏分。
读取峰分数的 A 280/320 （图 1）。
将主峰的中央八个部分汇集到 50 ml 锥形管中。
如上所述，用分光光度法测量浓度。
通过添加 PBS SEC 缓冲液稀释至 0.53 mg/ml。
用分光光度法确认浓度。
将 0.5 ml 等分试样加入 1.5 ml 子弹管中，放入冷冻箱中，然后放入 -80°C 的冷冻箱中。

图 1. BSA 的 Superdex 200 SEC

动态光散射
Zetasizer Nano S DLS 仪器（图 2）使用 632.8 nm 氦氖红色激光器。它装有一个比色皿，可测量 173° 散射的光。它连接到运行 Windows 10 的计算机并由 Zetasizer 软件控制。比色皿中的散射体积是自动确定的，以允许大范围的粒子浓度。或者，用户可以手动指定位置。一个测量由几个平均归一化强度自相关衰减组成，称为运行，每个持续 10 秒。测量次数由用户指定。运行次数可以由软件根据散射光的强度自动确定，这取决于大分子的浓度和大小，也可以由用户手动输入。对于 0.53 mg/ml 的 BSA，运行次数通常约为 15。运行平均的方式在仪器文档中没有很好地描述，以产生单个 z 平均粒子半径和多分散指数。此外，该软件还会生成一个强度粒径，该粒径是使用用户指定的算法计算得出的，该算法可反转 Fredholm 积分（方程式 1）。14）。
在该协议中，冷冻 BSA 样品被解冻并准备通过超滤和高速离心进行分析，以去除可能的大干扰散射颗粒，如下所述。对等分试样进行四次测量的试验。用来自相同解冻子弹管的新鲜等分试样重复该过程，总共进行八次试验以评估由于等分试样引起的变化。此外，解冻另一个 BSA 样品并进行 8 次试验，每次进行 4 次测量，以评估由于冷冻、解冻和样品制备可能引起的变化。

图 2. Zetasizer Nano S 粒度分析仪。ZEN2112 比色皿显示在打开的样品室旁边。

仪器启动
打开电脑。
按下仪器背面的电源开关，打开 Zetasizer Nano S。
Zetasizer Nano S 上的状态指示灯最初为红色。
启动 Zetasizer Nano S 软件。
Zetasizer Nano S 上的状态指示灯将变为绿色。
选择Tools > Count Rate Meter ，选择 20°C 的温度，然后输入Set 。
在仪器中放置一个 ZEN2112 比色皿（图 2）以进行温度平衡。
等待至少 30 分钟，使仪器稳定并且温度达到平衡。
制定标准操作程序 (SOP)
Zetasizer Nano S 中的测量是根据用户创建的 SOP 进行的。SOP 指定 1) 温度和溶剂粘度，扩散速率取决于它们，并且是计算流体动力学半径（方程 4）所必需的，2) 溶剂折射率，这是计算散射矢量所必需的（等式11), 3) 测量次数，以及 4) 计算强度分布时使用的算法（等式）。 14）。可以使用 SEDNTERP 估计大多数常见缓冲液的粘度。或者，它可以使用粘度计测量。后者更可取，因为 SEDNTERP 无法识别由于准备缓冲区而导致的错误。接近生理离子强度的缓冲液的折射率与水相比仅略微增加，在 632.8 nm 激光波长和 20°C 下为 1.333。对于本协议中使用的 PBS，使用的值为 1.334。
选择文件>新建> SOP 。出现一个新的 SOP窗口（图 3）：

图 3. Zetasizer SOP 窗口

测量类型：选择尺码
材料：选择蛋白质。（对于流体动力学半径小于入射波长 5% 的粒子，此选择无关，就像 BSA 的情况一样。但是，选择蛋白质选项没有坏处。）
分散剂：分散剂是溶剂。将出现一个窗口，其中包含默认值、溶剂水或上次使用的分散剂（图 4A）。
1) 单击“...”（三个点）图标，将出现分散剂管理器窗口（图 4B）。
2) 选择现有溶剂。将出现一个窗口，其中包含温度、粘度和折射率。
3) 或者，通过选择添加... >简单分散剂或溶剂来添加新溶剂。将出现一个分散剂属性窗口（图 4C）。输入溶剂的名称、温度、溶剂粘度和折光率。介电常数无关紧要，但必须输入一个数字。输入 50。新溶剂将出现在Dispersants Manager窗口中。

图 4. 分散剂特性。(A) 默认分散剂窗口。(B) 分散剂管理器窗口。(C) 分散剂属性窗口。

常规选项：选择使用分散剂粘度作为样品粘度。（Mark-Houwink 参数与此分析无关。）
温度。
1) 通过选择分散剂来设置温度（见上文）。
2) 平衡时间：输入 30 秒，这对于室温下接近 20°C 测量温度的样品来说已经足够了。
细胞>细胞类型>石英比色皿选择ZEN2112 。
测量
1) 测量角度：选择173° 反向散射
2) 测量持续时间：选择自动
3) 测量次数：输入 4
4) 测量之间的延迟：输入 0 秒
5) 将测量编号附加到样品名称：选中该框
6) Artial 结果：不要选中此框
7) 测量持续时间>延长大颗粒的持续时间。输入否
8) 定位方式：选择Seek获得最佳位置
9) 自动衰减选择：输入Yes
数据处理>分析模型选择蛋白质分析
配置：选择显示范围 0.1 到 6,000，上下阈值 0.01 和 0.05（这些是默认值）。
使用File > Save as保存 SOP 。
注意：一定要添加扩展名 *.sop，程序不会自动添加。
将 SOP 放在文件夹 \Malvern Instruments\Zetasizer\SOP\Protein 中。此文件夹是程序查找 SOP 文件的默认文件夹。
在每次实验之前，通过选择File > Open > SOP > Protein并选择 SOP ，检查 SOP 的设置是否正确。
测量样品的制备
从 -80°C 冰箱中取出 0.5 ml 等分的纯化 BSA，并在 37°C 水浴中解冻 15 分钟。
取出Henke Sass Wolf 1 ml Tuberkulin 注射器的柱塞。
在注射器上放置 0.02 μm Whatman Anotop10 过滤器。
将 BSA 添加到桶中并过滤到 1.5 ml 子弹管中。
在室温下以 18,000 × g离心20 分钟。
取出顶部 0.45 毫升，然后移入新的 1.5 毫升子弹管中。
从 Zetasizer Nano S 仪器中取出比色皿。
将移液管尖端置于细胞底部，加入 20 μl 样品。不要完全排出内容物以避免气泡。这个体积将弯液面留在比色皿的观察窗中，这是令人满意的。如果弯液面不均匀也是可以接受的。
盖上比色皿并放入 Zetasizer Nano S 仪器中。
测量后（见下文），取出并驱散旧样品，重复提取一次。如果用相同的材料重复试验，只需添加 20 μl 的新鲜样品。如果加入含有不同大分子或浓度的溶液，用20μl新溶液洗涤细胞3次，如上所述提取洗涤液，然后加入20μl进行测量。
进行 DLS 测量
当 Zetasizer 软件启动时，会出现一个标题为“Example results”的窗口，其中列出了几条记录。通过选择File > Close 关闭窗口。最初，工具栏上Browse for SOP ...旁边的箭头是灰色的（图 5A）。
选择文件>新建>测量文件并为文件命名。将创建一个 .dts 文件。
将文件保存在文件夹 \Malvern Instruments\Zetasizer\Measurement Data 中。Browse for SOP...旁边的小箭头变为绿色（图 5B）。
单击绿色小箭头。将出现一个用于选择 SOP 的窗口。
导航到 \Malvern Instruments\Zetasizer\SOP\Protein 并选择适当的 SOP 文件。甲文档窗口出现（图5C）。输入样本的名称。如果出现底部没有 OK 的窗口，则选择 SOP 是错误的。重复以上步骤。
选择“确定”后，会出现一个带有绿色大箭头的窗口（图 5D）。单击它以启动一组测量。最初，当单击箭头时，测量在用户指定的平衡期之后开始。在重复试验时，会出现一条消息，指导用户插入单元格。插入单元格后，再次单击绿色大箭头，测量将开始。

图 5.进行 DLS 测量。(A) 初始浏览 SOP 窗口。(B) 创建新的测量文件后，浏览 SOP 窗口。(C) 文档窗口。(D) 大绿色开始箭头。

当一系列运行累积到测量中时，选择强度 PSD，会出现一个图表，将分布分析显示为强度与尺寸和累积量分析，显示 Z 平均直径和多分散指数图 6A。在运行完成时，计算分布函数，并绘制强度与尺寸的关系图。然后执行另一次运行，不断更新强度与尺寸图，直到运行完成，这构成了一次测量。
或者，在测量过程中，选择Multi-View ，会出现一个窗口，显示： 1) g 2 (τ)——1与衰减时间τ 的关系，随着运行的发展而更新；2）背景中描述的强度波动；和 3) 强度分布 (图 6B)。单分散蛋白质制剂的强度分布应该是单峰和对称的，如图 6A 和 6B 所示。多分散样品的一个例子如图 7 所示，它是通过将 BSA 与甲状腺球蛋白混合制备的。如果强度分布是多峰的，则应重复样品制备。

图 6. 测量窗口。(A) 强度 PSD。(B) 多视图。

图 7. 样品多分散性。BSA 和未经过滤的粗甲状腺球蛋白分别以 0.25 和 0.13 毫克/毫升的浓度混合。

测量完成后，测量窗口会显示消息Insert cell and press start when ready 。单击右上角的 X 关闭它。
通过输入文件>关闭或单击窗口右上角的红色 X 来关闭显示记录视图的窗口。
使用相同的 SOP 开始另一个试验。选择文件>新建>测量文件并输入新文件名。现有的 SOP 应该仍然存在。单击绿色小箭头。（注意：如果绿色小箭头不存在，则测量窗口可能尚未关闭。）出现 SOP 窗口时，更改样品名称并按上述方法选择 OK。应该会出现绿色大箭头以开始下一次试验。
关掉
退出 Zetasizer 软件（文件>退出）。
关闭 Zetasizer。
关闭电脑。
清洁 Zen2115 比色皿
戴上无粉手套。使用 200 μl 移液器和 200 μl 体积。
取出比色皿内容物。
用 H 2 O洗涤 5 次。
用 2% (v/v) Hellmanex III 洗涤 5 次。
用 H 2 O洗涤 5 次。
用 H 2 O:HCl:EtOH 2:1:1 (v:v:v)洗涤 5 次。
用 H 2 O洗涤 3 次。
用 200 标准乙醇洗涤 1 次。
在真空干燥器中干燥比色皿。

数据分析

Zetasizer 分析
完成一组测量后，选择“记录视图”选项卡。每个记录对应一个测量值。它列出了通过累积量分析获得的 Z 平均流体动力学半径R h（或直径，如果用户愿意）和多分散指数 (PdI)，以及与使用分布分析确定的峰相关的流体动力学半径（或直径）（图 8）。可以从单个测量中查看结果，也可以通过使用鼠标选择所有测量来查看结果。

图 8. 记录视图

通过右键单击测量文件并选择Edit Result来确保使用了正确的溶剂。将出现一个窗口，其中包含溶剂（分散剂）属性。如果使用了错误的溶剂，请通过修改 SOP 进行更正。
要以半径而不是直径的形式查看结果，请单击 d.nm 并更改为 r.nm。
要获得统计数据，请选择所有记录和均值，然后会出现一组测量值的样本标准偏差。
选择强度 PSD选项卡，它会打开一个表格，其中包括计数率、比色皿中的测量位置、衰减和尺寸信息、与测量相关的数据（图 9A）以及粒度分布图（图 9B） . 该卷PSD是不相关的测量蛋白质的扩散系数。该尺寸质量报告显然是主要面向商业应用。
复制 z 平均R h和 Pk1 平均强度R h值（图 8）并粘贴到 Excel 文件中以备后用。将有 32 个值对应于八等分试样的四次测量。

图 9. BSA DLS 测量结果。(A) 列表结果。(B) 粒度分布。

选择Correlogram (M) ，它会显示相关系数与时间的关系图（图 10A）。“相关系数”是数量g 2 (τ) –1 。时间是衰减时间τ 。
选择累积量拟合 (M) ，会出现一个图表，显示使用累积量分析拟合的 G1 相关函数与时间数据（图 10B）。G1 相关函数是归一化的场自相关函数g 2 (τ) 。请注意，数据仅适用于大于 0.1 的g1(τ)值。
选择分布拟合 (M) ，会出现一个图表，显示使用分布分析拟合的 G1 相关函数与时间数据（图 10C）。

图 10. DLS 衰减。(A) g 2 (τ) –1与τ 。(B) Zetasizer 累积量适合。(C) Zetasizer 分布拟合。

SEDFIT分析
将 Zetasizer 文件转换为 SEDFIT 兼容文件
Zetasizer 记录文件包含单次测量的结果，后缀为 .dts。它们可以转换为 SEDFIT 可以使用 Zetasizer 软件中的宏在Tools > Macros > Make DLSDAT-v1-0下读取的文件。
创建 .dlsdat 宏
转到www.materials-talks.com/blog/2015/10/28/new-macro-to-export-dls-data-to-sedfit/。选择方法一。
单击上述站点上的链接，下载并解压缩MakeDLSDAT-v1-0.zip。MakeDLSDAT-v1-0.zmac 出现在 /Downloads 文件夹中。将其移至桌面。
启动 Zetasizer 软件。
转到“工具” >“选项” >“宏” >“安装新宏” 。
从桌面选择MakeDLSDAT-v1-0.zmac。
重新启动 Zetasizer 软件。现在在Tools > Macros 下，Make DLSDAT-v1-0出现。
使用 dls.dat 宏
在 Zetasizer 软件中，选择文件>打开>测量文件并导航到包含所需 .dts 文件的文件夹。.dts 文件包含一组测量值，它们显示为单独的记录。每个测量值都可以转换为 .dlsdat 文件。
通过选择打开>测量文件打开一个 .dts 文件，并在“记录视图”下突出显示一条记录。右键单击宏> MakeDLSDAT-v1-0并输入文件名。该宏将生成一个扩展名为 .dlsdat 的文件，用于 SEDFIT。
.dlsdat 文件的属性
每个 .dlsdat 文件包含一个标题和大约 200 个数据对。图 11 显示了 .dlsdat 文件的标题和前几行的示例。

图 11. .dlsdat 文件的结构

在标题中，19.998910 是温度，1.334 是溶剂折射率，0.010018 是以泊为单位的溶剂粘度，173 是散射角，6.328e-07 是以米为单位的氦氖激光器的波长。SEDFIT 根据 Eq 计算散射向量11. 第一列数据是延迟时间，以秒为单位。第二列是g 2 (τ) –1 。
SEDFIT 累积量分析
运行 SEDFIT，选择数据>加载 DLS 数据并加载 .dlsdat 文件。SEDFIT 取.dlsdata 文件中g 2 (τ) –1的平方根以生成g1(τ) （它称之为 g(1) 场自相关）。SEDFIT 默认是绘制和拟合g1(τ)数据。相反，通过选择选项> DLS 工具 > 切换强度 <-> 场自相关 Fct来绘制和拟合g 2 (τ) –1数据，这会在“强度自相关函数”和“场自相关函数”之间切换 SEDFIT 图。
选择选项> DLS 工具 > 始终加载强度自相关 g(2) – 1 。
使用鼠标移动绿色垂直线以设置拟合限制。选择左拟合限制以包括第一个数据点。在数据接近零的右侧选择大约 1 log 的正确拟合限制（图 12）。选择更多数据不会改善拟合常数。

图 12. SEDFIT 拟合限制

选择模型>动态光散射>累积量分析。
选择Parameters ，然后出现默认的 Cumulant Analysis 窗口（图 13A）。“我TOT”指的值克2 （τ） -1在零τ 。mu1/S^2 = D z 是（等式15）。mu2 和 mu3 是矩μ 2和μ 3 （方程15）。S 是散射矢量的幅度（方程 11 中的q ）。参数的单位分别是 F、F^2 和 F^3，其中 1 F 是 1 Fick，等于 1 cm 2 s -1 。
通过选中复选框并输入初始猜测来拟合 I tot、Dz 和 mu2/S^4 和基线。未安装 mu3/S^4。输入高于预期值的 Dz 起始值。可以为 mu2/S^4 输入相同的值。输入 I tot 的值 1 和 Baseline 的值零。在实践中，拟合对于初始估计非常稳健，并且可重复地收敛到相同的值。初始估计如图 13B 所示。
选择运行。SEDFIT使用初始估计和方程计算g 2 (τ) –1 。15（图13D）。在此示例中，初始拟合在一定程度上遵循数据，但需要优化，这是通过使用 Marquardt Levenberg 算法的非线性最小二乘分析完成的。
选择选项>配件选项> Marquardt Levenberg。
选择适合。现在参数的优化产生了与数据的紧密拟合（图 13E）。（选择显示>更新以仅显示图形）。
选择参数以查看拟合常数（图 13C）。在本例中，D z为 6.03 F。
再次输入Display > Show Last Fit Info或键入“Ctrl o”，拟合信息将叠加在图形上，包括拟合的均方根偏差 (rmsd) 和多分散指数（图 13F）。在本例中，多分散性为 0.073。
显示的一些信息（图中未显示）是参考拟合沉积数据，无关紧要。
在 Excel 电子表格中记录D z值以备后用。将有 32 个值对应于八等分试样的四次测量。

图 13. SEDFIT DLS 累积量拟合。(A) 打开参数窗口。(B) 初始参数估计。(C) 拟合参数。(D)根据初始估计计算出的g 2 (τ) –1值。(E) 拟合曲线。

SEDFIT 连续 I(D) 分布分析
在 SEDFIT 中，按照上述数据分析 B.2 中的说明加载 DLS 数据，然后选择Model > Dynamic Light Scattering > DLS:Continuous I(D)-Distribution 。
与对g 2 (τ) –1值进行拟合的累积量分析相反，在此模型中必须对g1(τ)进行拟合。选择Options > DLS Tools > Toggle Intensity <-> Field Autocorrelation Fct并切换到“field autocorrelation function”。该图显示了g1(τ)与τ （未显示）的关系图。
选择参数。出现参数窗口（图 14A）。
有几种可能的起始参数估计组合。选择默认值equidistant log(1/tau) grid 、integral linear和等于 100 的分辨率。按照 www.analyticalultracentrifugation.com 的建议，将置信水平（F 比）保留为默认值 0.55。部分比容、缓冲液密度和缓冲液粘度无关。对低于和高于扩散系数估计值 10 倍的 D min 和 D max 进行初始初始估计。对于 BSA，选择 0.6 和 60 的值（图 14B）。
选择运行。该程序的一个明显特点是，与累积量分析相反，运行命令执行非线性最小二乘拟合。出现一个上部窗口，显示拟合（图 14C）。下方窗口显示拟合分布（图 14D）。正如在 Zetasizer 软件中一样，聚集体或杂质的存在会产生几个表明多分散性的峰（未显示）。
通过单击积分按钮（图 14D，右上角）并按照程序中的指示使用鼠标右键选择包含分布的区域，计算信号平均扩散系数。在此示例中，获得了 6.203 F 的信号平均扩散系数（图 14D，插图）。
在 Excel 电子表格中记录信号平均扩散系数值以备后用。

图 14. SEDFIT DLS 连续 I(D) 分布拟合。(A) 默认连续 I(D) 窗口。(B) 用户选择的连续 I(D) 值。(C) 拟合g1(τ)衰减曲线。(D) 拟合连续 I(D) 分布，将其积分以产生信号平均扩散系数。

Excel 求解器分析
在此示例中，Excel GRG 未加权非线性最小二乘回归算法用于将 BSA DLS 衰减的单个 Zetasizer 测量结果拟合到 Frisken 累积方程的前两个矩（方程 15)

此协议假定您熟悉 Excel 并且已安装 Solver 加载项。
运行 Excel 并将空白工作表命名为“Master Sheet”。
创建一个表格来计算单元格 I26:J32 中散射矢量的幅度（图 15A）。

图 15. Excel 求解器 DLS 累积量拟合。(A) 散射向量。(B) 参数起始估计。(C) 在运行求解器之前拟合参数。(D) 在运行 Solver 后参数拟合，显示 SEDFIT 拟合参数以供比较。(EF) 运行 Solver 之前和之后的 SSR。

在 I 列中，输入行标签（“WL (nm)”、“WL (cm)”等）。
在 J 列中，输入 DLS 激光波长、溶剂折射率和散射角的值（以度为单位）。将散射角转换为弧度。使用 Excel 函数定义名称并定义名称 WL、RI 和 theta_rad。计算散射矢量的幅度q （方程 11）：

使用定义名称的此方程的 Excel 代码为“4*PI()*RI*SIN(theta_rad/2)/W”。
在第 37 行的 A、B、C、D 和 E列中创建一组列名称 tau (s)、tau (usec) 、g2-1、g2 和 g2 calc（图 16）。

图 16. DLS 数据和 Excel Solver 累积量拟合。A 列，τ 的导入值；B列，τ到μs的换算；C列，g 2 (τ) –1 的导入值；D列，g 2 (τ) ；E 列，g 2 (τ)的拟合值。

通过选择Data > From Text/CSV ，然后Load导入包含g 2 (τ) –1 vs. τ数据的 .dlsdat 文件。数据将作为单列加载到新工作表中。
选择加载数据的列，然后选择Data > Text to Columns 、Delimited 、Space 。将创建τ和g 2 (τ) –1列。删除三个标题行。
从第 38 行开始，分别将τ和g 2 (τ) –1数据剪切并粘贴到主表的 A 列和 C 列中（图 16）。使用与 SEDFIT 累积量拟合相同数量的数据对。
通过将 A 列中的值乘以 1E6 并将这些值放在列 B 中，将τ从秒转换为微秒（以避免数值精度问题）（图 16）。
通过将 C 列中的值加 1 并将这些值放置在 D 列中来计算g 2 (τ) （图 16）。
从第 26 行开始制作参数起始估计表（图 15C）。在第 26 行的 Ficks 中输入扩散系数的起始估计值。在本例中，输入了 20 F 的起始估计值。通过乘以 1E-07转换为 cm 2 s -1的单位。计算的估计值的，并将其标记为伽玛EST使用等式的一阶矩形式。10：

输入多分散指数 (PDI) 的初始估计值。在此示例中，已输入起始值 0.4。计算二阶矩的估计值μ 2 ，并使用等式将其标记为Mu2 est 。17：

制作表格Parameter fits从第 26 行开始，表格扩散系数和 PDI从第 32 行开始（图 15D）。
将 Gamma_est 和Mu2_est的值复制到参数拟合表中。输入 1 以开始估计B和β 。为“参数拟合”表中的值定义名称：B_、beta、Gamma、Mu_2。图 15C 显示了规划求解运行之前的参数拟合表。
使用 Frisken 方程（方程 15）的前两个矩从初始估计值计算g 2 (τ )。此计算的 Excel 代码为：
B_+beta*EXP(-2*Gamma*B38)*(1+(Mu_2*B38^2/2))^2
其中 B38 表示第一行数据中τ的值。
制作一个名为Fit的表格，从第 26 行开始，其中包含行SSR和数据对。图 15E 显示了求解器运行之前的 SSR 值。
使用 Excel 中的 SUMXMY2 函数从 g2 和 g2 calc 列计算残差总和 (SSR)。在此示例中，g2 和 g2 计算值分别位于 D38:D101 和 E38:E101 行（图 16），Excel 代码为：
SUMXMY2(D38:D101,E38:E101)
使用 Excel COUNT 函数或通过手动输入来确定数据对的数量。
通过在求解器中使用 GRG 非线性算法拟合单元格 E27:E30 中的参数 B、beta、Gamma 和 Mu2 来最小化 SSR，方法是选择Data > Solver 、Set Objective SSR、To Min、By Change Variable Cells $E$27:$ 30 欧元（图 17）。在此示例中，SSR 在 Solver 运行后从 1.94E-04 降低（图 15F）。扩散系数和 PDI 的拟合参数和估计值出现在参数拟合和扩散系数和 PDI表中（图 15D）。均方根值已从 0.098 降至 1.74E-03（图 15D）。
剪切并粘贴 B、beta（在 SEDFIT 中称为“I tot”）、rmsd、D 和 PDI 的 SEDFIT 累积估计值以进行比较（对于 B，在 SEDFIT 拟合基线上加 1）。这些值非常一致（图 15D）。

图 17. Excel 求解器窗口

统计分析
通过方差分析的点估计和置信区间
该协议的目标是为 BSA 的扩散系数分配一个点估计和 95% 的置信区间，校正到 20°C，D 20,w水的标准条件。对样品进行四次测量（重复）的试验。用来自同一试管的新鲜等分试样重复该过程，总共进行八次试验。此外，解冻另一个 BSA 样本，并进行八次试验，每次进行四次测量，以评估由于冷冻和解冻可能引起的变化。
实验结果变化的可能来源来自： 1) 四次测量试验中的变化；2) 由于移除比色皿和重复分装而导致的试验之间的差异；3) 由于冷冻、解冻和样品制备而引起的变化。通过单向随机效应方差分析 (ANOVA) 评估由于复制和重复分装引起的变化，这产生了扩散系数的点估计和 95% 置信区间。尽管有许多来源描述了单向随机效应方差分析，但很少提供置信区间的推导。一个例子是 Brownlee (1965)，它为下面的描述提供了基础。
在单向方差分析中，有一组独立的样本（这里是等分试样），每个样本都有b 个测量值（重复）。方差分析模型是

其中X j,k是与组j的重复k相关的测量值，μ是所有组的测量值的总平均值，αj是组j的平均值，ε j,k是与组j内的测量相关的误差，测量k 。假设α j服从零均值和方差e 的正态分布，ε j,k服从零均值和方差的正态分布，。X的方差由下式给出

右边的项称为方差分量。在这个例子中，我们对 BSA 扩散系数的均值、μ （点估计）和置信限感兴趣。
在随机效应模型中检验的假设是

即，所有变异都是由复制引起的，没有变异是因为群体效应。等价于假设

结果使用方差分析表进行总结（图 18）：

图 18. 方差分析表

在表中，是样本总均值，是组重复的均值。假设H 0使用F统计量进行检验，其中

(19)
用一个-1，b -1自由度。组内方差的估计量为

(20)
的估计量为

(21)
均值方差的估计量为

(22)
同样，

(23)
为95％置信区间μ是从学生获得吨-配送与一个-1自由度。

( 24 )
其中是平均所有测量的，-吨0.975和吨0.975是的值吨-配送的量，面积所在的分布的每个尾部内的2.5％，并且是平均的标准偏差（也称为的估计均值的标准误）。可以使用 Excel 执行单向方差分析。此示例假定已安装数据分析加载项。
SEDFIT 累积分析统计
在 Excel 中创建一个新工作表，并为等分试样制作八列，为测量（重复）制作四行（图 19）。
从数据分析 B.2 中选择所有 32 个测量值，并使用 Excel AVERAGE 函数计算样本总平均值。这是D z的估计值。
使用“定义名称”功能为图 19 中的组数和重复数指定名称。

图 19. SEDFIT 累积量拟合

选择数据>数据分析>方差分析：单因素。
在出现的窗口中，选择包含 D 值 $B$17:$I$20$ 的单元格（图 20）。试验（等分试样）按列分组。

图 20. Excel 方差分析窗口

选择0.05 的Alpha 。这是 F 检验的显着性水平。
为输出范围开始的单元格选择 $L$21，然后选择确定。Excel 生成一个方差分析表（图 21A）。F 检验揭示了从图 19 的检查中可以明显看出的内容，即试验之间的变异大于测量（重复）之间的变异。因为等分试样取自同一个子弹管，所以变化不是由于移液错误造成的。可能的情况包括样品中出现小气泡、弯液面反射或在移除比色杯、添加新等分试样和更换比色杯的过程中比色杯位置发生变化。

图 21. SEDFIT 累积量方差分析。(A) 方差分析表。(B) z 均值D和 z 均值D 20w 的点估计和置信限。

计算置信区间
通过将组MS B （图 21）之间的均方除以测量总数n 来计算平均值的方差。
通过取该值的平方根来计算平均值的标准偏差。
使用 Excel 函数 T.INV(probability,deg_freedom)计算95% 置信区间的学生t密度函数值。此处，概率为 0.975，自由度为a – 1。由于a等于 8，因此有 7 个自由度，T.INV(0.975, 7) = 2.365。
使用等式计算置信区间的上限和下限。24.
使用公式计算D 20,w。5：

D和D 20,w的点z-平均估计示于图21B中。
SEDFIT 连续 I(D) 分布分析统计
在 Excel 中创建一个新工作表，并为等分试样制作八列，为测量制作四行，作为数据分析 D.2 （图 22）。

图 22. SEDFIT 连续 I(D) 拟合

插入来自数据分析 B.3的 SEDFIT 连续 I(D) 分布分析的测量值并计算总平均值。这是信号平均扩散系数。
构建一个方差分析表并按照数据分析 D.2 （图 23）中的描述计算置信限。

图 23. SEDFIT 连续 I(D) 方差分析。(A) 方差分析表；(B) z 均值D和 z 均值D 20w 的点估计和置信限。

Zetasizer 累积量分析统计
在 Excel 中创建一个新工作表，并为等分试样制作八列，为测量（重复）制作四行，如数据分析 D.2 （图 24）。

图 24. Zetasizer 累积量 Rh 拟合

插入来自 Zetasizer 累积分析数据分析 A的R h测量值并计算总平均值。
如数据分析 D.2所述，构建一个方差分析表并计算R h的置信限。使用斯托克斯-爱因斯坦方程（方程 4）将R h值转换为 z 平均扩散系数D和D 20,w 。结果如图 25 所示。

图 25. Zetasizer 累积量方差分析。(A) 方差分析表。(B) z 均值D和 z 均值D 20w 的点估计和置信限。

Zetasizer“蛋白质分析”分布统计
在 Excel 中创建一个新工作表，并为等分试样创建八列，为测量创建四行，如数据分析 D.2 （图 26）。

图 26. Zetasizer 蛋白质分析 Rh 拟合

插入来自 Zetasizer 蛋白质分析数据分析 A的R h测量值并计算总平均值。
构建ANOVA表并计算置信界限ř ħ如上述数据分析D.2 .Convert ř ħ值信号均扩散系数，d和d 20，W ，利用斯托克斯-爱因斯坦方程（方程4） . 结果如图 27 所示。

图 27. Zetasizer 蛋白质分析方差分析。(A) 方差分析表。(B) z-average和 z-average D 20w 的点估计和置信限。

测试由于冻融和样品制备可能引起的变化
解冻新样品并重复程序 B.3 中描述的样品制备步骤
对样品的八等分试样进行 DLS 测量和分析，如程序 B.4和数据分析中所述，每等分试样进行四次测量。
将结果与第一个解冻样品进行比较（图 28A）。结果显示所有四种分析方法的置信区间重叠，表明不存在由于冻融样品制备过程而导致的系统误差。
拟合方法总结及文献综述
图 28A 中的置信区间是精密度的量度，而不是测量和分析的准确度。该协议的目标是拥有一种测量和分析方法，该方法没有显着的系统误差，并产生一个置信区间，该区间接近于在 20°C 水中无限稀释时扩散系数的真实值 ( )。解决. 的含义很重要。虽然扩散系数不是在无限稀释时测量的，但球状蛋白质的值通常显示每毫升浓度的亚毫克变化可以忽略不计，就像本协议中的情况一样。这在 BSA 中特别体现出来 (Creeth, 1952)。如背景中所述，单一扩散系数的概念仅限于双组分系统，即大分子和溶剂水。由于蛋白质是聚电解质并带有随 pH 值变化的净电荷，因此尝试从缓冲盐溶液外推到水似乎是天方夜谭。然而，接近生理阴离子强度的溶液中的筛选效应往往会消除溶剂对扩散的特定影响，这也是 BSA 的情况 (Creeth, 1952)。
假设考虑一个 true 是现实的，那么根本问题就出现了，永远不可能知道所有系统误差的来源都已被消除。因此，测量精度通常是根据参考值来定义的 (Mandel, 1964)。例如，真空中的光速无法从实验中确切知道，而是被定义为 299,792,458 m/s。其他测量是相对于该标准进行的。在没有参考标准的情况下，与数值一样，准确度的评估变成了一种有根据的猜测（Mandel，1964）。有两种方法可以尝试做出合理的估计。第一个是尝试识别和估计所有可能的系统错误的大小，并产生一个被认为是真实值所在的范围。二是比较独立测量过程的结果。对于BSA的值，三种独立的方法是扩散法、DLS 和 Svedberg 方程的应用。在扩散测量中，Creeth 于 1958 年报告的测量值 (Creeth, 1958) 代表了该方法改进的演变，可以被认为是可用的最准确的测量值（图 28B）。
斯维德伯格方程（Eq. 18) 可以重新排列以产生作为沉降系数、气体常数、温度、摩尔质量、部分比体积和溶剂密度的函数的扩散系数：

其中，外推到 20°C 水的沉降系数的实验确定，以及部分比容的不确定性，是最重要的误差来源。在不进行正式的误差分析传播的情况下，使用4.44 S的测量值（Parker 和 Lollar，2021 年），= 0.733 ml/g，使用 BSA 氨基酸组成和 SEDFIT 中的部分比容计算器，M = 66,365 g/ mol 和ρ 20,w = 0.9982 g/ml，产生 6.05 F 的扩散系数（图 28B），它在 Creeth 的扩散测量置信区间内。
在本协议中的数据分析方法中，连续 I(D) 方法和蛋白质分析方法产生的置信区间不如累积方法精确。SEDFIT 累积量置信区间比 Zetasizer 累积量分析更好地涵盖了扩散测量和 Svedberg 方程的估计，后者产生较低的值。SEDFIT 累积量分析也更可取，因为它拟合的方程是 Frisken 方程，使用 Excel 求解器独立验证。将数据拟合到 Frisken 方程代表了对早期方法的改进，因为它使用非线性最小二乘回归而不是对数转换g 2 (τ)并执行线性回归。相比之下，软件文档中没有描述 Zetasizer 累积量方法。它在g 2 (τ) –1 的低值处截断数据集，这可能是由于对数变换必须避免拟合在零附近变化的值。

图 28. BSA。(A) 点估计 (Pt. est) 和 z 平均值的 95% 置信限本协议。(B) 文学价值。

答：参考。(Akeley and Gosting, 1953)，扩散池，Gouy 干涉法，0.01 MK 醋酸盐，0.15 M KCl，pH 4.59，杂质校正
b：参考。（Wagner 和 Scheraga，1956），扩散池，Gouy 干涉测量法，0.5 M KCl，pH 5.14；杂质校正
c：参考。(Creeth, 1958)，扩散池，瑞利干涉法，0.01 MK 醋酸盐，0.15 M KCl，pH 4.59，杂质校正
d：参考。(Harvey et al. , 1979)，DLS，累积量分析，SEC 分馏 BSA；0.1 M 氯化钠，0.07 M 磷酸盐，pH 7.0
e：参考。（Oh 和 Johnson，1981），DLS，累积量分析，SEC 分馏 BSA，0.1 M NaCl，0.02 M 醋酸钠，pH 4.7
f：参考。（Gaigalas等人，1992）、DLS、累积量分析、NIST 标准 BSA、各种缓冲液
g: Svedberg 方程 (Eq. 18，见正文）
报告的范围是指未定义的置信区间或误差估计。

食谱

10×PBS（1升）
1.54 M 氯化钠
56 mM Na 2 HPO 4
10.6 mM KH 2 PO 4
称重：
对于 1.54 M NaCl (MW 58.44) 90. 0g
对于 56 mM Na 2 HPO 4 (MW=141.96) 7.95 g
对于 10.6 mM KH 2 PO 4 (MW 136.09) 1.44 g
将固体添加到1 L 烧杯中的~980 ml H 2 O
溶解后，在量筒中将体积调节至 1 L
使用 Corning 500 ml、0.22 μm 过滤装置过滤
4°C 保存
PBS (1 升)
0.154 M 氯化钠
5.6 mM Na 2 HPO 4
1.06 mM KH 2 PO 4 ，pH 7.4
使用 SEDNTERP 计算的 10×PBS 和 20°C 水的密度分别为 1.0684 g/ml 和 0.9982 g/ml。
将 100 ml 10× PBS 重量添加到 1 L Pyrex 瓶中（质量 = 密度 × 体积 = 106.8 g）
用 900 ml H 2 O 进行重量稀释（质量 = 密度 × 体积 = 898.4 g）
pH 值应为 ~7.15。使用 pH 计用 5 N NaOH 将 pH 调至 7.40
如上所述过滤
4°C 保存

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家心脏、肺和血液研究所的支持（奖号 U54HL141981 给 PL）。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。该协议描述了使用 Zetasizer Nano S 粒度分析仪测量 Parker 和 Lollar (2021) 中描述的蛋白质平移扩散系数的验证。

利益争夺

我们没有要申报的竞争利益。

伦理

本协议中没有描述人类受试者或动物研究。

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