材料和试剂

由纵梁制成的 2 mm 玻璃探头（Bullseye Glass，目录号：000147-0272-F-Tube）
½ ml Monoject 胰岛素注射器，29 G × ½”（Covidien，目录号：8881600350）
针 25 G（BD PrecisionGlide，目录号：14-826G）
1.5 ml MCT 分级混合管（Fisherbrand，目录号：05-408-137）
0.20 mm不锈钢昆虫针（Fine Science Tools，目录号：26002-20）
0.22 μm 注射器过滤器（Fisherbrand，目录号：09-719C）
100 mm × 15 mm 培养皿（VWR，目录号：25384-070）
方形塑料称量盘（Dyn-A-Med，目录号：80055）
电极存储（World Precision Instruments，目录号：E215）
VWR 微型盖板玻璃 24 × 50 毫米（VWR，目录号：48393081）
成年 C57Blk/6 小鼠（6 周以上，可以使用替代动物品系）
III型胶原酶（Worthington Biochemical Corporation，目录号：LS004180）
异氟醚，USP（Piramal Critical Care，目录号：400648037）
聚氨酯（Sigma-Aldrich，目录号：U2500）
氯胺酮（Henry Schein，目录号：056344）
甲苯噻嗪（Sigma-Aldrich，目录号：X1251）
定制的 Sylgard 涂层解剖盘（见程序 D）
SYLGARD TM 170 有机硅弹性体套件（DOW Inc.，目录号：4026157）
高真空润滑脂（DOW Corning，目录号：H051J89018）
氯化钠（Fisher Scientific，目录号：S642-500）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9541-1KG）
七水硫酸镁（Fisher Scientific，目录号：BP213-1）
二水氯化钙（Fisher Scientific，目录号：C69-500）
磷酸二氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：P5655-500G）
D-（+）-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528-1KG）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6297-1KG）
95% O 2 ，5% CO 2气体（Nexair，目录号：UN3156）
D-葡萄糖酸钾，99％（Alfa Aesar，目录号：B25135）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E-3889）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-250G）
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A9187）
GTP（Sigma-Aldrich，目录号：G9002）
用于电生理记录的人工脑脊液 (aCSF)（见食谱）
高镁低钙显微切割溶液（见食谱）
贴片电极溶液（见配方）

设备

手术工具
2.5 mm Vannas弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号：15002-08）
Wagner剪刀（Fine Science Tools，目录号：14068-12）
9 mm Castroviejo 显微解剖弹簧剪刀（Roboz，目录号：Rs-5658）
Dumont #5 镊子（精细科学工具，目录号：11251-20）
pH计（丹佛仪器，型号：UB-10）
渗透压计（Vapro，型号：5600 型）
磁力搅拌板（IKA Works USA，型号：CERAMAG Midi）
磁力搅拌棒（VWR，目录号：76006-400 ）
600 ml 烧杯（Pyrex，目录号：CLS1000600）

用于全细胞记录的记录设备
通常，有多种市售组件可用于从显微解剖的神经组织中进行视觉引导的全细胞记录。我们使用了一个包含 40 倍液浸物镜的直立显微镜，具有微分干涉对比和红外成像来增强图像。采用了传统的电生理记录方法，包括带有氧合 aCSF、空气表、带有电极支架的显微操作器、高阻抗低噪声膜片钳放大器、A/D 转换器和用于数据捕获的相关专业软件的实验室。各种评论中提供了详细信息。我们实验室使用的那些在最近的出版物（McKinnon等人，2019 年）中进行了描述，如下所列（图 1）。
立式DIC荧光显微镜（Olympus，型号：BX51WI）贴附低光相机（Olympus，型号：OLY-150）
立式电极拉拔器（Narishige，型号：PP-83）
Micro- forge（Narshige，型号：MF-9）
MultiClamp 700A 和 Digidata 1322A （Molecular Devices）
定制 Sylgard 涂层记录室和灌注系统
可控蓝光激光器（定制但也可商用；例如，Thorlabs S1FC473MM 多模光纤耦合激光器）
电刺激可以由市售刺激器提供（例如，AM Systems，型号：2200 Analog Stimulus Isolator）
使用 Masterflex 泵进行重力灌流以进行再循环（Cole Palmer，型号：77200-50）
灌注管（Masterflex，目录号：96412-16）
1.5 毫米外径丝状硼硅酸盐玻璃毛细管（World Precision Instruments，目录号：TW150F-4）
涂层银线（AM Systems，目录号：787000）
连接器插座 20-24AWG 金压接（Digi-Key，目录号：205090-1）
连接器 D-Sub 引脚 20-24 AWG AU（Digi-key，目录号：205089-1）
电极硅胶管（Masterflex，目录号：96410-10）
带塑料轴的棉签（Just The Basics，目录号：PINSB0300DLJB01）
快速固化环氧树脂注射器（JB Weld，目录号：50112）
4-Indent D-Sub 压接器 26-20 AWG（Paladin 工具，型号：PA1440）
多用途剥线钳和切割机（Klein Tools Inc.，型号：1010）
三通，带公鲁尔锁的旋塞阀，非无菌（Cole-Palmer，目录号：UX-30600-02）
5毫升带鲁尔锁的一次性注射器（BD，目录号：309646）
电工胶带（VWR，目录号：470020-186 ）
绝缘屏蔽铜线 20AWG 300V BLK 25'（CNC Tech，目录号：1430-20-1-0500-001-1-TS）
接地电极探针（WPI，型号：Ep2）
通信电缆（Belden，目录号：8441）
放大器的双香蕉插头连接器（Pomona Electronics，目录号：1330）
单香蕉插头（Pomona Electronics，目录号：1325）
精密螺丝刀（西向，型号：401L69）
Clorox 漂白剂（VWR，目录号：89501-620 ）

图 1. 用于制造吸入电极的材料。(A) 带鲁尔锁的三通旋塞阀。(B) 钝 25 G 针。(C) 硅胶管。(D) 绝缘铜线。(E) 通信电缆。(FG) 镀银线。(H) 玻璃电极。(I) 快速固化环氧树脂注射器。(J) D-sub 压接机。(K) 带塑料轴的棉签。(L) 双香蕉插头。(M) 单香蕉插头。(N) 连接器插座。(O) 连接器 D-Sub 引脚。(P) 剥线钳和切割机。

用于涉及多节段节前和节后复合动作电位的研究的记录设备
具有 0.8-5.6 倍变焦范围和 DFPL 0.5 倍物镜的立体解剖显微镜（奥林巴斯，型号：SZX7）
多通道差分放大器（定制但也可商用（例如，AM Systems，型号：1700 差分交流放大器）
恒流刺激器（定制但也可商用；例如，AM Systems，型号：2200 模拟刺激隔离器）
可控蓝光激光器（定制但也可商用；例如，Thorlabs、S1FC473MM 多模光纤耦合激光器）
带 3 轴手动显微操纵器控制的磁性支架（Kanetec，型号：MB-PSL）
重力灌流用 Masterflex 泵进行再循环（Cole Palmer，目录号：77200-50）
灌注管（Masterflex，目录号：96412-16）
Digidata 1322A （分子设备）
1.5 毫米外径丝状硼硅酸盐玻璃毛细管（World Precision Instruments，目录号：TW150F-4）
涂层银线（AM Systems，目录号：787000）。
连接器插座 20-24AWG 金压接（Digi-Key，目录号：205090-1）。
连接器 D-Sub 引脚20-24 AWG AU（Digi-key，目录号：205089-1）。
接地电极探针（WPI，型号：Ep2）
通信电缆（Belden，目录号：8441）
放大器的双香蕉插头连接器（Pomona Electronics，目录号：1330）
单香蕉插头（Pomona Electronics，目录号：1325）

用于钙成像的图像捕获设备
AC/DC 差分放大器（AM Systems，型号：51249）
Master 8 系统和 ISO-Flex 刺激隔离器（AMPI，型号：1955）
倒置显微镜（奥林巴斯，型号：IX70）
氙气灯罩（奥林巴斯，型号：U-ULS75XE）
电源（奥林巴斯，型号：AH2-RX-T）
中性密度滤光片（奥林巴斯，目录号：Chroma ND-50）
Uniblitz 快门（Vincent Associates，型号：VCM-D1）
400 nm 分色镜（奥林巴斯，型号：Chroma NC474265）
490-520nm 发射滤光片（奥林巴斯，型号：Chroma U-MF2）
CCD 相机（Stanford Photonics，型号：XR/ABF 带 XR/M 相机）
Trinitron 彩色视频监视器（索尼，型号：PVM-135MD）

软件

Clampex 软件（Molecular Devices，RRID：SCR_011323）
PCI 软件（日本静冈县滨松市中区砂山町滨松）
斐济（来自 NIH 的 ImageJ）

程序

我们描述了为体外小鼠模型开发的方法，用于对其特性进行生理表征。所提出的程序和所有实验均在成年（8 周以上）C57Bl/6 小鼠中进行，但该方法已用于出生后第 7 天的小鼠。与交通支、脊神经和腹根连续的胸链神经节是未从周围组织解剖。相反，它们会粘附在胸腔上以防止神经损伤。在小鼠中获得交流 rami 是困难的，因此通过刺激腹侧根来实现节前轴突的募集。紧密配合的玻璃抽吸电极的专业制造能够稳定地记录复合动作电位的细胞外记录。
图 2 显示和描述了节前投射到 tSPNs 的解剖组织。为了进入交感神经节和连接腹根进行记录，以下一系列程序很重要：（1）必须去除腹膜；(2) 为便于记录，链条应与包埋的棕色脂肪组织小心分离，分离时容易切断节间神经或支，需小心；(3) 由于神经节本身被胶原蛋白鞘包裹，单个 tSPN 进一步包裹在胶质覆盖物中，需要进入单个神经元进行全细胞记录的制剂需要在胶原酶中预孵育和使用补丁对胶质外壳进行机械破坏电极形状的毛细管连接到显微操作器或玻璃探针。
实验研究的准备工作首先包括通过胸腔进行横向切口来解剖脊柱。使用虹膜显微切割剪刀、镊子和细尖玻璃探针的组合，剥离腹膜。虽然全细胞记录需要胶原酶，但我们在没有它的情况下进行了人群研究（Blum等，2020）。尽管如此，胶原酶处理后群体抽吸电极记录的密封质量和信号分辨率是优越的。如果使用胶原酶，则允许脊柱在充满持续充氧的人工脑脊液 (aCSF) 和胶原酶溶液的加热室中孵育（Blum等，2020）。清除链条上剩余的脂肪和结缔组织。腹侧椎体切除术暴露脊髓和腹根。
一种体外方法提供给superfuse药剂，以评估在已知的剂量行动没有药物进入关注的能力（布莱克曼和帕维斯，1969;里奇曼等人，1980;索恩和非洲之角，1997;爱尔兰等，1998）。这在图 3 中显示，在应用六甲铵（一种神经节烟碱受体拮抗剂）后，tSPN 的募集受阻（Li 和 Horn，2006 年；Wehrwein等人，2016 年）。对于节段前轴突募集的研究，脊髓和背根被移除，只留下完整的腹根连接。

图 2. tSPNs 节前投射的解剖组织。(A)体外解剖和链神经节的鉴定。透明链神经节显示在右侧面板（箭头）中。(BC) 交感神经节前和节后神经元之间连接的解剖组织概述。节前轴突离开腹根并通过白色支进入交感神经链。那些支配椎旁神经节后神经元 (tSPNs) 的神经节通过节间神经中的 rostrocaudally 投射侧枝在几个链神经节内进行。其他神经节前轴突不支配链神经节内的 tSPN，但可能会在离开前沿神经节间神经行进以支配椎前神经节（未显示）。

图 3.离体解剖可以研究多节段的节前作用。(A) 实验配置。放置在腹根（绿色箭头）和 IGN（红色箭头）上的喇叭形玻璃电极可实现稳定的细胞外记录（左）。刺激和记录部位之间的神经节用黑色箭头表示。右侧显示的面板 B 和 C 的实验配置方案。(B) 腹侧根刺激后神经节前轴突的募集和诱发突触 tSPN 反应。ChAT::CHR2 转基因小鼠 T10 腹侧根神经节前轴突的电（左）和光遗传学（蓝色激光；右）强度依赖性募集示例。在这里，记录抽吸电极从直接尾端到 T12 链神经节的切断神经节间神经捕获直接和突触诱发的群体反应。招募中的刺激强度差异显示为持续时间保持不变（电为 200 毫秒；光学为 5 毫秒）。蓝色垂直线和条代表各自的刺激时间。波形是标记强度下三个事件的平均值。显示了分别具有电（早期）和最慢传导（晚期）轴突与光遗传学刺激的最快传导轴突的优先强度依赖性募集。在来自 ChAT::ChR2 小鼠的胶原酶处理组织中进行了招募概况。(C) 使用神经节阻滞剂区分神经节前和神经节后活动。下图显示了在应用烟碱受体拮抗剂六甲铵 (100 µM) 后突触招募的节后 (tSPN) 活动的块。两个面板中的阴影区域突出显示了这种损失。

有关组织准备的说明，请参见视频 1。文中提供了各个步骤的视频时间戳。

视频 1.交感神经链解剖。所有动物程序均按照埃默里大学机构动物护理和使用委员会的规定进行，并符合协议 # PROTO201700855 (exp 3/26/2023)下的实验动物护理和使用指南。

用于记录多节段节前和节后复合动作电位的实验的离体小鼠解剖。
A1. 组织准备
用吸入异氟醚麻醉小鼠。用氨基甲酸乙酯维持（腹腔注射，体外电生理为 2 g/kg ）。通过缺乏捏诱发足撤退反射和眨眼反射确认麻醉深度。
使用 25 G 针将动物固定在解剖盘中，背侧朝上。
捏住尾巴附近的皮肤, 用剪刀剪开中线, 去除背侧皮肤, 露出脊柱的背面。可见的背表面包括覆盖脊柱和背脊突的肌肉。使用镊子去除多余或松散的头发（视频 1。交感神经链解剖 0:00-1:18）。
要移除胸椎和附加链，请在离 L3 椎骨附近的中线 5 毫米处开始横向切口。将肌肉和胸腔切入 T1 椎骨，确保剪刀与中线平行。在另一侧重复切口。捏住柱子并在 T3 下方进行横向切割。抬起脊柱以分离和切割内脏。在 T1 上方进行横向切割以移除胸椎（视频 1。交感神经链解剖 1:20-2:40）。
快速冲洗含氧高 Mg 2+ (6.5 mM)/低钙2+ (1.2 mM) aCSF（见配方 1）中的分离组织，以去除多余的血液和脂肪。
进行胶原酶处理（如果需要）。将组织放入装有 20 mg III 型胶原酶每 1 ml aCSF 的连续充氧溶液的 1.5 ml 试管或培养皿中（参见配方 2），在 36 ° C 下保持 1 小时。如有必要，修剪组织以适应胶原酶治疗管（视频 1。交感神经链解剖 3:13-3:24）。

A2。复合动作电位记录的组织稳定和电极放置
如果使用胶原酶处理，从 1.5 ml 管中取出组织并在含氧 aCSF 中快速冲洗（参见配方 2）以去除消化的组织。
在室温下, 在充满含氧高镁低钙显微切割液的灌注解剖盘中, 将脊柱背侧向上固定。使用剪刀去除多余的脂肪和肌肉以暴露中线。（视频 1. 交感神经链解剖 3:26-3:46）
使用剪刀, 沿中线从头端到尾端切割脊柱。（视频 1. 交感神经链解剖 4:08-5:08）
翻转组织和销，使背侧朝下。使用 microdissecting 弹簧剪刀, 沿中线切割脊柱, 以暴露脊髓。（视频 1. 交感神经链解剖 5:09-7:30）
小心地将组织的两半分开以暴露脊髓根。使用 Vannas microscissors，切割靠近脊髓的腹根。切割靠近脊柱的背根。一旦所有的根都被切断，取出带有背根的脊髓并丢弃。（视频 1. 交感神经链解剖 7:59-11:23）
在电极放置之前，确保组织被牢固地固定。使用玻璃探针或镊子，小心地剥离任何剩余的腹膜，让组织静置 30 分钟。设置和定位电极所需的时间是让组织休息的理想时间（视频 1。交感神经链解剖 11:24-12:12）。
此时，椎旁链的单个神经节应该是可见的。玻璃吸引电极可以放置在腹根和感兴趣的神经节上。要放置电极，请将电极操纵器靠近记录盘。使用操纵器的刻度盘将电极移近预期的神经或腹根，使电极的尖端接触神经或腹根的切割端。轻轻吸力以稳定初始状态。一旦所有电极都以类似方式放置，请施加更多吸力以稳定。
如果浴持续充氧并且浴温保持在 22 ° C ，样品可以提供至少 12 小时的稳定记录。尚未系统地探索高温下的生存能力。
图 4 详细介绍了电生理装置和灌注系统。

图 4. 记录椎旁交感神经链神经节细胞外群体潜能的实验总体设置。左：电生理设备的图片。右图：照片中显示的电生理装置示意图。接线图以红色显示。浴灌注系统以蓝色显示。

用于全细胞膜片钳记录或钙成像的离体小鼠解剖
B1. 组织制备和胶原酶处理
如程序 A1.1 所述麻醉小鼠。
在解剖盘中将动物固定在背侧朝上。
用剪刀去除背部皮肤并暴露下面的脊柱。
要移除胸椎和附加链，请在离 L3 椎骨附近的中线 5 毫米处开始横向切口。将肌肉和胸腔切入 T1 椎骨，确保剪刀与中线平行。在另一侧重复切口。在 T1 和 L3 上方进行横向切割以去除胸椎。
通过沿背侧和腹侧脊柱中线切割将脊柱减半。取出脊髓并为下一步保留脊柱的两半。
在含氧高镁低钙显微切割液（参见配方 1）中快速冲洗孤立的脊柱，以去除多余的血液和脂肪。
将组织放入装有 20 mg III 型胶原酶的连续充氧溶液的 1.5 ml 管或培养皿中，每 1 ml aCSF（参见配方 2）在 36 ° C 下保持 1 小时。

B2. 全细胞膜片钳记录或钙成像的准备
从 1.5 ml 管中取出组织并在含氧 aCSF 中快速冲洗（参见配方 2）以去除消化的组织和残留的胶原酶。
在室温下，在充满含氧高镁低钙显微切割溶液（见配方 1）的灌注解剖盘中将脊柱腹侧向上固定。
使用玻璃探针或镊子，小心地剥离任何剩余的腹膜。
使用显微剪刀切断 rami （视频 1. Sympathetic Chain Dissection 12:36-15:20）以移除链条。
使用镊子和昆虫针，将链条固定在一个透明的 Sylgaard 记录盘上，通过该盘持续灌注循环的含氧 aCSF（参见配方 2）。如果组织被用于钙成像的地方，记录室中的链子在底部装有玻璃盖玻片。在棉签上沾取一些高真空油脂并将其涂抹在录音室的底面。将玻璃盖玻片压在油脂上，将玻璃固定到录音室并形成防水密封。
在任何电极放置之前，让组织休息 30 分钟。设置和定位电极所需的时间是让组织休息的理想时间。
对于钙成像，使用倒置的奥林巴斯望远镜从下方对细胞进行成像。对于全细胞膜片钳，可以使用带有弱光相机的直立显微镜识别细胞。微分干涉对比 (DIC) 显微镜可用于可视化 tSPN，而适当的荧光照明可用于识别荧光标记的 tSPN（例如，依赖 Cre 的报告小鼠）。有关全细胞膜片钳 (图 5B) 和钙成像 (图 5C) 实验视野的代表性示例，请参见图 5 。

图 5. 遗传方法可以研究分子上不同的 tSPN 亚群。(A) 大部分 tSPN 表达神经肽 Y (NPY)，如 NPY::tdTomato 小鼠所示（6 周龄小鼠的 T8 交感神经节）。(BC) NPY+ tSPNs 活性研究。(乙)。NYP::tdTomato 小鼠中荧光识别的 NPY+ tSPN 的全细胞记录显示了对一系列去极化电压或电流步骤的神经元反应特性。(C) NPY::GCaMP6f tSPNs 中的Ca 2+信号在 T7-T8 整个胸神经节中由节间神经刺激引起。显示的是用 10Hz、5 脉冲序列进行电刺激后活动的变化。

确定 tSPN 后，使用填充有 aCSF 的电极轻轻冲洗该区域，轻轻清洁膜。然后用充满细胞内溶液的电极替换电极，逐渐接近 tSPN 以 0.2cc 正压，当电极接近细胞膜时降低到 0.05-0.1cc。
一旦电极接触膜，释放正压并施加 0.1cc 负压并将电极保持在 -80mV。这允许膜在电极尖端周围形成 GOhM 密封。在电阻稳定在 GOhm 范围和 ~-10 nA 注入电流后, 快速应用 1cc 注射器吸力或口吸脉冲以突破膜。
如果浴液持续充氧并且温度保持在 22 ° C ，样品可以提供至少 12 小时的稳定记录。

玻璃吸电极和贴片电极的喇叭形尖端的制造（图6）
将玻璃毛细管放置在垂直拉拔器 (Narishige, PP-83) 上。加热中心并允许毛细管的两端被拉开 1-2 毫米而不断裂。
让拉伸的毛细管达到室温。不调整加热线圈，加热毛细管直到两半分开。用球根状尖端保留一半。
使用载玻片的边缘在球状尖端下方对电极进行评分。在载玻片上轻敲电极尖端以去除分数标记上方的部分。
将电极放在装有弯曲灯丝的 microforge (例如, Narishige MF-9 Microforge) 中。放置电极时，电极尖端的颈部与灯丝的弯曲边缘等距。
使用中等热量设置加热灯丝以吹响电极的颈部。喇叭形状可促进紧密贴合、稳定的录音。电极的大直径口允许整个神经（有时是神经节）进入电极，而小直径颈部将神经锁定到位。
从硼硅玻璃毛细管（外径 1.5 毫米，内径 1.2 毫米，垂直拉拔器上的丝状硼硅玻璃毛细管）中拉出贴片电极，目标电阻为 4-7 MΩ。用贴片电极溶液填充电极（参见配方 3）。

图 6.喇叭形玻璃吸电极。(A) 用于记录和刺激的电极尖端的放大视图。(BJ) 吸引电极的制造。有关详细说明，请参阅“程序 C”。(B) 玻璃毛细管位于垂直拉拔器上。(C) 管子加热形成 1-2mm 的颈部。(D) 加热管以分开两半，使下半部分与球状尖端保持一致。(EF) 玻璃载玻片用于在球状尖端下方得分并打破尖端。(G) 用 U 形灯丝放置在 Microforge 中的电极。(H) 尖端位于灯丝的中心。(IJ) 加热前后 Microforge 中的电极视图。

Sylgard涂层解剖盘的制造
取一个 100 毫米塑料培养皿的下半部分，并将其放在平坦的表面上。
按照 SYLGARD TM 170 有机硅弹性体套件中的说明在一次性塑料称重盘中混合 40 毫升密封剂。
将密封剂慢慢倒入培养皿中，直到培养皿装满一半（大约 35 毫升的密封剂）。快速倾倒会产生气泡和用于解剖的不平整表面。
在工作台上轻轻敲击培养皿以释放密封剂中的气泡。
将盘子放在不受干扰的位置，让密封剂在室温下固化 24 小时。

吸引电极的制造（图1）
将一段绝缘屏蔽两线电缆切割成所需长度。长度将根据放大器与记录盘的距离而有所不同。额外的长度将有助于电极电缆松弛并防止在记录过程中出现拉扯问题。
使用剥线钳在每个切割端剥去 1.5 英寸的 PVC 外护套，露出编织屏蔽层。
切掉一端的编织屏蔽层，露出绝缘铜缆（通常为黑色和红色）。在另一端，从一对铜缆上解开屏蔽线材料并重新扭成一个点。将电缆放在一边。
剪下 5 英寸长的绝缘铜线。使用剥线钳剥去两端 0.5 英寸的绝缘层。
将步骤 E4 中铜线的一端与步骤 3 中的尖头屏蔽层拼接在一起。用电工胶带固定并绝缘拼接区域。
使用精密螺丝刀将铜线的另一端固定到单个香蕉插头上，松开插头中的螺丝夹，使铜线进入，然后拧紧以固定电线。
保持在通信电缆的同一侧，使用剥线钳从红线和黑线剥去 0.5 英寸的绝缘层。使用步骤 E6 中的相同程序将红色和黑色电线固定到双香蕉插头上。
返回到切断编织屏蔽层的通信电缆一侧。现在使用剥线钳从红线和黑线剥去 0.5 英寸的绝缘层。使用 D-sub 压接工具，将一个 D-Sub 针压接到每根电线上。输入电缆现已完成，可以放在一边。
要构建电极支架，首先从棉签的塑料轴上切下 1.5 英寸的一块。使用 25 G 针，轻轻地在轴的中间戳一个洞，注意不要戳穿另一端。
剪下 4 英寸长的镀银线，从外面穿过塑料轴上的孔，然后穿过 3 英寸。使用环氧树脂密封孔并牢固地固定电线。注意不要用环氧树脂填充轴，因为这会阻止您对电极施加吸力。
环氧树脂固化后，切下 1 英寸的硅胶管并将其连接到银线伸出的塑料轴末端。玻璃电极将放置在电极架的这一端。
接下来，切割 1 英尺的硅胶管并将其连接到塑料轴的另一端。将钝的 25 G 针连接到硅胶管的末端，并用环氧树脂密封任何间隙。将三通旋塞连接到 25 G 针。将 5 毫升一次性注射器连接到旋塞的末端。
切割 4 英寸长的镀银线。使用打火机，烧掉两端 0.5 英寸的塑料涂层。对步骤 10 中的环氧树脂银线执行相同操作。如果获得类似 DC 的事件，则顶部裸露的涂层线可提供更稳定的记录。例如，可以最大限度地减少由浴液体积的微小变化引起的伪影。
使用压接工具将连接器插座压接到步骤 E13 中切割的镀银线和步骤 E10 中的镀银线的一端。
通过将末端浸入 Clorox 漂白剂中 24 小时，对银线的未卷曲末端进行化学氯化。

笔记

使用 MultiClamp 700A 放大信号并使用 Digidata 1322A 和 Clampex 软件（Molecular Devices，RRID：SCR_011323）以 10 kHz 的频率进行数字化。

食谱

高镁2+ /低钙2+显微切割溶液
127.99 毫米氯化钠
1.90 毫米氯化钾
6.5 mM MgSO 4 ·7H 2 O
0.85 mM CaCl 2 ·2H 2 O
1.20 mM KH 2 PO 4
9.99 mM 葡萄糖
26.04 毫米碳酸氢钠3
在室温下用气体（95%O 2 、5%CO 2 ）饱和后将pH调节至7.4 。
为该协议准备的推荐体积为 250 毫升。
用于电生理记录的人工脑脊液 (aCSF)
127.99 毫米氯化钠
1.90 毫米氯化钾
1.30 mM MgSO 4 ·7H 2 O
2.40 mM CaCl 2 ·2H 2 O
1.20 mM KH 2 PO 4
9.99 mM 葡萄糖
26.04 毫米碳酸氢钠3
在室温下用气体（95% O 2 ，5% CO 2 ）饱和后，将 pH 调节至 7.4 。aCSF 可以用 HEPES 或碳酸氢盐缓冲。
为该协议准备的推荐体积为 500 毫升。
贴片电极溶液
140.0 mM 葡萄糖酸钾
11.0 mM EGTA
10 毫米 HEPES
1.32 mM CaCl 2
使用 KOH 将 pH 值调节至 7.3。目标渗透压为 290 mOsm。在大多数记录（25/39 个细胞）中，添加了由 4.0 mM ATP 和 1.0 mM GTP 组成的支持溶液。
为该协议准备的推荐体积为 3 毫升。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款 5R01NS102871 和国防部拨款 SCI-30225 的支持。
与全细胞记录相关的程序如 McKinnon等人所述。(2019)。“通过全细胞膜片钳记录显示显着增强的胸交感神经节后兴奋性和整合能力。” eNeuro 6(2)：ENEURO.0433-0418.2019。

利益争夺

没有竞争的利益。

伦理

所有动物程序均按照埃默里大学机构动物护理和使用委员会的规定进行，并符合协议 # PROTO201700855 (exp 3/26/2023)下的实验动物护理和使用指南。

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