材料和试剂

12孔板
6孔板
24孔板
Sylgard 184有机硅弹性体套件（Fisher Scientific，目录号：NC9285739）
昆虫针（Fine Science Tools，目录号：26002-20）
肝素（Millipore Sigma，目录号：H3393）：以 50 mg/ml 重悬在水中，等分，并储存在 -20°C）
脱氧胆酸钠（VWR，目录号：0613-100g）：使10%原液5g溶于30ml水中，加水至50ml，室温避光保存。
显微镜载玻片（Denville Scientific INC，目录号：M1021）
蜡笔（矢量，目录号：H-4000）
显微镜盖玻璃（Fisher Scientific，目录号：12-545-M）
安装介质（Electron Microscopy Sciences，目录号：17985-01-02-03）
山羊抗mVEGFR3（研发系统，目录号：AF743）
大鼠抗 mCD31（BD Pharmingen，目录号：553370）
兔抗PROX1（AngioBio Co.目录号：11-002）
大鼠抗 mNRP2（研发系统，目录号：AF567）
山羊抗 hPROX1（研发系统，目录号：AF2727）
山羊抗mVEGFR2（研发系统，目录号：AF644）
山羊抗 mLYVE-1（研发系统，目录号：AF2125）
羊抗 mFOXC2（研发系统，目录号：AF6989）
兔抗 mClaudin 5（ThernoFisher，目录号：34-1600）
CY3-结合的小鼠抗兔（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：711-165-152）
Alexa488-结合驴抗山羊（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：705-545-147）
CY5-结合驴抗大鼠（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：712-175-150）
CY3-结合的驴抗羊（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：713-165-147）
大鼠抗 mCD144（BD Pharmingen，目录号：550548）
20×PBS（见食谱）
20%多聚甲醛（PFA）（见配方）
10% 海卫 X-100（见食谱）
PBST（见食谱）
PBST/20% DMSO（见食谱）
10% 吐温 20（见食谱）
10% NP40（见食谱）
PTTDND（见食谱）
1 M甘氨酸（见食谱）
PTDG（见食谱）
阻塞缓冲区（见食谱）
PTWH（见食谱）
PTWH/5% DMSO/3% 驴血清（见食谱）
PTWH/3% 驴血清（见食谱）

设备

镊子（精细科学工具，目录号：11252-00）
台式摇杆
弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号：15000-08））
尼康显微镜
蔡司共聚焦显微镜

程序

样品制备
按照制造商的说明准备 sylgard 板。一旦制成了 sylgard 板，它就可以无限期地使用。
从子宫中解剖 E14.5-E18.5 胚胎，并用镊子在冰冷的 1× PBS 中去除多余的胚胎膜。
打开胚胎的腹部，将它们固定在 1% PFA 中，在 12 孔（E14.5 到 E16.5）或 6 孔（E17.5 到 E18.5）板中在 4°C 下过夜。
用 1× PBS 在冰上清洗胚胎 3 次，每次 30 分钟（图 1A）。
用弹簧剪刀从耳朵到前肢下方做切口 (图 1B)。
用镊子小心地去除皮肤，并尝试尽可能少地取出底层组织（图 1C）。
将皮肤固定在 sylgard 板上, 用镊子去除结缔组织 (箭头) (图 1D-1G)。
从 sylgard 板上取下皮肤，放入 24 孔板中进行整体免疫染色。

图 1. 皮肤准备。A. E16.5 胚胎固定在 PFA 中并准备进行背部皮肤解剖。B. 背部皮肤上的切口勾勒出将被解剖的区域。C. 去除背部皮肤后的胚胎。请注意，下面的组织没有被解剖显着损坏。当用最少量的附着组织解剖出皮肤时，后续的清洁步骤被最小化。D. 将皮肤样品固定在 sylgard 板上，内侧朝上。箭头指向附着在皮肤上的胶原纤维。例如。通过剥离去除结缔组织（箭头）的同一皮肤样本，而不会损坏下面的皮肤。G 中的箭头表示可以丢弃的结缔组织。

整体免疫组化
用 1 ml PBST 清洗样品两次，每次 30 分钟。
在含有 20% DMSO 的 1 ml PBST 中孵育样品 4 小时。
在 1 ml PTTDND 中孵育样品过夜。
用 1 ml PBST 清洗样品两次，每次 30 分钟。
将样品在 1 ml 1 PTDG 中孵育 4 小时。
在 300 µl 封闭缓冲液中封闭过夜。
用 1 ml PTWH 洗涤两次，每次 30 分钟。
在含有 5% DMSO 和 3% 驴血清的 300 µl PTWH 中用一抗孵育过夜。
用 1 ml PTWH 洗涤四次，每次 30 分钟。
在含有 3% 驴血清的 300 µl PTWH 中用二抗孵育过夜。
用 1 ml PTWH 洗涤四次，每次 30 分钟。
用 1 ml 1× PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。
用蜡笔在显微镜载玻片上画正方形（图 2A 和 2B）。
在正方形中间添加足够的安装介质（图 2B），并将皮肤放入安装介质中（图 2C）。让皮肤的内侧朝上，并将背部皮肤的前端（耳朵）朝向载玻片的前端。
用弹簧剪刀从皮肤上取下耳朵（图 2D）。
用盖玻片覆盖样品，并使用镊子的背面轻轻按压皮肤以抚平皱纹（图 2E）。
在荧光显微镜下用指甲油和图像密封幻灯片的边缘（图 2F 和 2G）。

图 2. 真皮皮肤成像。A. 幻灯片上的虚线表示将通过用蜡笔勾勒出的腔室的大致位置。B. 用蜡笔勾画轮廓后，将一滴镶嵌介质放在腔室中间。C. 免疫染色的背部皮肤浸入封固剂中，皮肤内侧朝上。D. 小心去除耳朵的样品。E. 用盖玻片覆盖样品并轻轻按压以去除气泡和皱纹。FG。根据所描述的协议处理的样品的较低和较高的放大倍数图像。VEGFR3+CD31+ (F) 和 VEGFR3+CD31+Prox1+ (G) 结构是淋巴管。F 中的 SMA+ CD31+ 血管是动脉和静脉。G 中的 CD31+ 血管是毛细血管。

笔记

所有洗涤和孵育步骤均使用台式摇杆在室温下进行。
步骤 B2 可以缩短为 4 小时。
此程序可能不适用于所有抗体。例如，高浓度的去污剂可能会破坏某些细胞连接分子的表位。用户必须进行初步实验，以确定该协议是否适合他们的需要。表 1 中提供了有关我们使用的抗体的信息。无法与 iDISCO 协议配合使用的抗体以红色突出显示。

表 1. 可以或不可以与 iDISCO 协议一起使用的抗体和条件列表。与所述协议一起使用时未提供良好信号的抗体以红色突出显示。其余的抗体提供了极好的结果。

食谱

20×PBS
称量 160 g NaCl、4 g KCl、28.8 g Na 2 HPO 4和 4.8 g KH 2 PO 4 。转移到 1 L 玻璃烧杯中。加水至 900 毫升。用 NaOH 混合并调节 pH 值至 7.4。用水补足 1 L。高压釜。
20% 多聚甲醛 (PFA)
称取 200 g PFA 并转移到 1 L 玻璃烧杯中。加入 500 毫升水，并在通风橱中的热板上用磁力搅拌器搅拌。将 PFA 悬浮液加热至 55-60°C（切勿超过 60°C）。滴加 5 N NaOH，直至悬浮液变清。将溶液冷却至室温。加入 50 ml 20×PBS 并通过逐滴加入 5 N NaOH 将 pH 值调节至 7.4。用水补足 1 L。用 50 ml falcon 管分装溶液并储存在 -20°C。将 2.5 ml 20% PFA 添加到 47.5 ml PBS 中，制成 1% PFA。
10% 海卫 X-100
将 10 毫升 Triton X-100 与 90 毫升水混合。
PBST（1× PBS，含 0.2% Triton X-100）
将 50 ml 20× PBS 和 20 ml 10% Triton X-100 混合在 1 L 圆筒中。用水补足 1 L。
含 20% DMSO 的 PBST
将 5 ml 20× PBS、2 ml 10% Triton X-100 和 20 ml DMSO 混合在 100 ml 圆筒中。用水定容至 100 毫升。存放在琥珀色玻璃瓶中长达 4 周。
10% 吐温 20
将 10 毫升吐温 20 与 90 毫升水混合。
10% NP40
将 10 毫升 NP40 与 90 毫升水混合。
PTTDND（1× PBS，含 0.1% Tween-20、0.1% TritonX-100、0.1% 脱氧胆酸盐、0.1% NP40 和 20% DMSO）
将 5 ml 20× PBS、20 ml DMSO、1 ml 10% Triton 100、1 ml 10% Tween 20、1 ml 10% NP40 和 1 ml 10% 脱氧胆酸钠在 100 ml 圆筒中混合。用水定容至 100 毫升。存放在琥珀色玻璃瓶中长达 4 周。
1 M 甘氨酸
将 75 g 溶于 800 ml 水中，加水至 1 L，并用 0.45 μm 过滤器过滤。
PTDG（1× PBS，含 0.2% Triton X-100、20% DMSO 和 0.3 M 甘氨酸）
将 5 ml 20× PBS、2 ml 10% Triton 100、20 ml DMSO 和 30 ml 1 M 甘氨酸混合在 100 ml 圆筒中。用水定容至 100 毫升。存放在琥珀色玻璃瓶中长达 4 周。
封闭缓冲液（1× PBS，含 0.2% Triton X-100、10% DMSO 和 6% 驴血清）
通过混合 4.1 ml 1× PBS、0.1 ml 10% Triton 100、0.5 ml DMSO 和 0.3 ml 驴血清制备 5 ml 溶液。每次都新鲜。
PTWH（1× PBS，含 0.2% Tween-20 和 10 µg/ml 肝素）
将 25 ml 20× PBS 和 10 ml 10% Tween 20 混合在 500 ml 圆筒中。用水定容至 500 毫升。添加 0.1 ml 50 mg/ml 肝素。充分混合并在玻璃瓶中储存长达 4 周。
含 5% DMSO 和 3% 驴血清的 PTWH
要制备 5 ml 溶液，请将 0.15 ml 驴血清、0.25 ml DMSO 与 4.6 ml PTWH 混合。每次都新鲜。
含 3% 驴血清的 PTWH
要制作 5 毫升溶液，请将 0.15 毫升驴血清与 4.85 毫升 PTWH 混合。每次都新鲜。

致谢

这项工作得到了 NIH/NHLBI（R01HL131652 和 R01HL133216 到 RSS）、NIH/NIGMS COBRE（P20 GM103441 到 XG；PI：Rodger McEver 博士）和俄克拉荷马成人干细胞研究中心（4340 到 RSS）的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

根据 OMRF 的 IACUC 批准处理小鼠。

参考
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