材料和试剂

一次性的
珀（1.130±0.005克/毫升）（GE保健生物科学AB，CA talog号：GE17-0891-01 ）。保持无菌并在 4°C 保存
10 × Hank's 缓冲盐溶液，不含钙，不含镁，不含酚红（Gibco，Thermo Fisher Scientific，目录号：14175053 ）。保持无菌并在 4°C 保存
1× Hank氏缓冲盐水溶液的w / o的Ca，W / O的Mg，W / O型酚红（Gibco公司，赛默飞世尔科技，CA talog号：14175095 ）。保持无菌并在 4°C 保存
Dulbecco氏米odified鹰米edium（赛默飞世尔科技，CA talog号：12440061 ）。保持无菌并在 4°C 保存
Iscove氏改良的Dulbecco培养基（Gibco，赛默飞世尔科技，CA talog号：12440061 ）。保持无菌并在 4°C 保存
庆大霉素50毫克/米升（GIBCO，赛默飞世尔科技，CA talog号：15750037 ）。保持无菌并在 RT 中保存
无菌热-灭活的胎牛血清（Gibco公司，赛默飞世尔科技，CA talog号：10082147 ）。保持无菌。分装并储存在 -20°C
Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GIBCO，赛默飞世尔科技，CA talog号：14190359 ）。保持无菌并在 4°C 保存
冻干分散酶II（Roche Diagnostics公司，CA talog编号：4942078001 ）。4°C 保存
DNA酶I，II级（罗氏诊断，CA talog号：10104159001 ）。重悬在10毫克/米升，并储存在-20℃下
4 L至8 L的NaCl 0.9％（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：9265.2 ）。保持无菌并在 4°C 保存
Nunc公司200米升锥形离心管（赛默飞世尔科技，CA talog号：376813 ）
15米升离心管（格雷纳生物一个国际公司，CA talog号：188261 ）
50米升离心管（格雷纳生物一个国际公司，CA talog号：227261 ）
5米升血清移液管（格雷纳生物一个国际公司，CA talog号：606180 ）
10米升血清移液管（格雷纳生物一个国际公司，CA talog号：607180 ）
20米升注射器（格雷纳生物一个国际公司，CA talog号：474203 ）
50米升注射器（格雷纳生物一个国际公司，CA talog号：475203 ）
钝端 16 G 针（VWR International，CA talog号： POPR7938 ）
康宁40μm的一次性细胞过滤器（康宁，CA talog号：431750 ）
细胞培养塑料。用胶原蛋白或层粘连蛋白涂层是没有必要的，但更好的结果可以通过使用预处理的塑料诸如高级TC产物获得（格雷纳生物一个国际公司，CA talog号：665980 ）

非一次性消毒材料
一盘的不锈钢（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：0376.1 ）
一对大剪刀的（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：YE80.1 ）
一对小剪刀（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：HEY6.1 ）
一个镊子直（卡尔·罗斯有限公司+公司KG ，CA talog号：2802.1 ）
一个大的圆孔筛（卡尔·罗斯有限公司+公司KG ，CA talog号：8101.1 ）
一个小圆孔筛（卡尔·罗斯有限公司+公司KG ，CA talog号：8096.1 ）
一个漏斗（卡尔·罗斯有限公司+公司KG ，CA talog号：0166.1 ）
一个扁平的玻璃容器（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：HX16.1 ）
一个500米挡板烧瓶与螺旋封闭件（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：PK17.1 ）
一个500米升带挡板的烧瓶，直颈（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：LY96.1 ）
一个1升烧杯（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：X695.1 ）
一个2L烧杯（卡尔罗斯GmbH的+ Co. KG的，CA talog号：X696.2 ）
一个不锈钢试验筛，孔径200μm的（Retsch公司，CA talog号：60.106.000200 ）
一个不锈钢试验筛，孔径100μm的（Retsch公司，CA talog号：60.106.000100 ）
一个不锈钢测试筛，孔径 40 µm（Retsch，CA talog号： 60.106.000040 ）

设备

移液器控制器
真空机
桶
4°C 冷藏离心机，配备适用于 15 ml试管、50 ml试管和 200 ml离心管的适配器
用夹子站立
手术灯（冷光）
层流罩
常温加湿培养箱
规模
37°C振荡水浴
荧光显微镜和照相机

程序

不连续 Percoll 梯度制备
在层流罩下准备所有解决方案和梯度。
通过将 19.8 ml的 Percoll (100%) 与 2.2 ml的 10 × HBSS混合，制备一种 90% Percoll 溶液。
如表 1所示，在 15 ml管中制备以下稀释液。将溶液短暂离心并将其储存在 4°C。Percoll 稀释液可以在隔离程序前几天准备好。

表 1. 不连续梯度的 Percoll 稀释液的制备

在50μm的升管，微妙地脱落3米升每种稀释液的，层-层，开始于70％稀释液。为促进该过程，使用 5 ml血清移液管，移液管控制器设置为被动模式，让溶液非常缓慢地下降。
将梯度保持在 4°C，以实现细胞的最佳分离。它必须在隔离当天新鲜制备。

胎盘收集
仅包括在足月（妊娠 37-41 周）从严格正常的单胎妊娠中取出的胎盘，没有任何胎儿（生长受限、畸形、基因组异常或感染）、胎盘（独特的脐动脉、前置胎盘或胎盘植入），或母亲（慢性疾病、妊娠糖尿病、先兆子痫、药物、酒精或药物）并发症。
剖宫产后立即在冰上收集材料，并在一小时内进行消化。

组织准备
将胎盘放入不锈钢容器中，用一把大剪刀粗略剪下羊膜。
将胎盘切成 2 × 2厘米的碎片，并将它们放入 2 L 烧杯中（图 1A）。
通过加入500洗净组织米升的NaCl的0.9％。混合均匀，然后将放在桶上的大筛子中的碎片沥干（图 1B）。
重复此操作，直到洗涤液保持清澈（需要 4 L 至 8 L）。

图1. w ^灰化步骤。A.切割胎盘成片后，将它们放在2升烧杯中，并添加500米升的NaCl的0.9％。B.摇动烧杯大力和漏筛组织。重复此操作数次。加入 4 到 8 L 0.9% NaCl 后，碎片必须变成浅红色，洗涤液必须保持清澈。

将这些碎片放入玻璃容器中，并用纸巾轻轻擦干纸巾（图 2A）。
与所述一对小剪刀和镊子，取出大血管（图2B）中，绒毛膜板和剩余的羊膜（白侧）（图2C和2 d），蜕膜（珍珠色相反侧），和血液凝块以促进消化并减少碎片量。

图 2. C倾斜步骤。准备消化的碎片。A. 用纸巾擦干后， B. 去除大血管和 CD。绒毛膜板。这一步可能很耗时，但减少碎片量可以提高消化和协议产量。

使用秤称重 72 克组织并用一把大剪刀切碎碎片（图 3A）。

酶消化
在水浴中，预热300米升1 × HBSS在500米升带螺纹闭合挡板烧瓶。
将 720 个单位的冻干分散酶 I 溶解在预热的 1 × HBSS 中，以获得 2.4 个单位/毫升的溶液。
将切碎的胎盘组织加入分散酶溶液中，并在强烈晃动下在水浴中孵育 1 小时（图 3B）。
添加1.2米升DNA酶I 10毫克/米升到消化的组织以获得的100个单位/ m的最终浓度升。
在水浴中在强烈摇动下再孵育 15 分钟。

图 3. D消化步骤。将 720 单位的 dispase I 溶解在 300 ml l预热的 HBSS 中。A. 用一把大剪刀切碎，将果肉转移到带挡板的烧瓶中。B. 在强烈摇晃下，在水浴中孵育混合物 1 小时。添加预先溶解的 DNAse I 并再孵育 15 分钟。

细胞分离和纯化
使用放置在 1 L 烧杯上的小筛子对悬浮液进行预过滤（图 4A）。
用夹具将三个测试筛按递减顺序（孔径：200 µm-100 µm-40 µm）固定在支架上。
放置不锈钢漏斗和500米升折流瓶中以一个过滤器下方直颈。
让悬浮液通过过滤系统。如果过滤困难，请搅动测试筛以移动碎屑并吸入空气。或者，也可以使用瓷勺去除堵塞的污垢（图 4B）。

图4. ˚F iltration步骤。A. 消化后，先用小筛对悬浮液进行预过滤。B. 然后将悬浮液通过三个测试筛，按递减顺序固定在支架上。滤液最后离心；粒料含有红细胞，淋巴细胞，碎片，和滋养细胞。

将滤液分成两个离心瓶，并用 IMDM 或 DMEM 培养基补充庆大霉素（终浓度 50 µg/ ml ）。这将在程序的其余部分称为“洗涤介质”。
500 × g离心 20 分钟。
吸出上清液。沉淀中含有红细胞，淋巴细胞，碎片，和滋养细胞。小心不要吸入颗粒，因为它在程序的这个步骤中是易碎的。
重悬，用10微米的沉淀升洗涤介质和传输到一个新的价值5000米升管。
完成到50米升与洗涤介质和离心5分钟，在500 ×克。
吸出上清，重悬在6沉淀米升洗涤介质。
微妙放下这6米升与渐变的表面上的移液管控制器（图5A和5 B）。

图 5. G辐射步骤。所述6米升含有碎片，红血细胞，淋巴细胞的混合，和滋养细胞。不连续的 Percoll 梯度允许按密度分离细胞类型。A. 梯度是在分离当天新鲜制备的，并在 4°C 下储存直至使用。B. 过滤步骤后，细胞悬液小心地沉积在梯度表面。然后离心分离不同层之间的细胞。

1200 × g离心 20 分钟，不带刹车。
离心后，将梯度放在手术灯（冷光）前，以可视化细胞。的细胞滋养细胞形成12.5之间局部的厚层米升和25米升，其对应于1.048-1.062克/米的密度升（层45％-40％-35％）（图6）。这之前已经用密度标记珠确定了。碎片必须位于低密度层，而淋巴细胞可以在细胞滋养层下方可见。在细胞滋养层内可能会观察到一些红细胞，但其中大部分应位于管的底部。

图 6.离心后的不连续 Percoll 梯度。细胞形成12.5和20 m之间的紧凑云升。碎片（红色）在上面，而红细胞在管的底部形成一个小球。在 12 ml l刻度附近可以观察到一些淋巴细胞。

用 50 ml注射器和钝端15 G 针头吸出与碎片相对应的上层。
用新的20米升注射器，而另一平端15号针，吸出细胞层对应于细胞滋养层，并把它们在一个最新50米升管。
完成容积至50米升与洗涤介质和离心5分钟，在300 ×克。
细胞滋养层小号形成在管的底部的白色沉淀。偶尔可以观察到一些红细胞。
除去上清液，并用6彻底重悬沉淀米升的0.05％胰蛋白酶。
在水浴中手动搅动管子 1 分钟，并立即将管子放在冰上停止反应。
迅速加入洗涤介质至50米升，并在300离心5分钟×克。
去除上清，重悬细胞沉淀10米升洗涤介质。
用 40 µm 一次性细胞过滤器过滤溶液。
完成容积至50米升与洗涤介质，并继续计数。

细胞计数和培养
用 260 µl洗涤介质稀释 60 µl细胞悬液。
加入100μ升的0.4％的台盼蓝。
用血细胞计数器 (Bürker) 计数细胞并确定存活率。
将细胞悬液以 300 × g离心 5 分钟。
在完全培养基（IMDM-10% FBS ，庆大霉素 50 μg/ ml ）中重悬沉淀。从现在开始，细胞滋养层必须用 IMDM 培养。
将细胞以 4.0 × 10 5细胞/cm 2的密度铺板以实现立即汇合（例如，12 孔板中的1.5 × 10 6细胞/孔）。
将细胞置于 21% O 2 -5% O 2下的大气控制加湿培养箱中。
第二天，用预热的 1 × DPBS清洗细胞以去除碎片、合胞结和未附着的细胞。
吸出 DPBS 并加入预热的培养基。每 24 小时更换一次培养基。
细胞可以培养几天（最多 21 天）。一些合体已经可以在24小时后可观察到，并且最大syncytialization被分离后达到72-96小时。
我们建议检查荷兰国际集团的文化的纯洁前几次的协议是执行ED （补充文件）。

致谢

该协议最初由 Frédéric Debiève 开发，并在过去几年由 Christophe Depoix 和 Arthur Colson 在 Séverine Gonze 的技术支持下进行了优化。作者特别感谢圣吕克大学医院产科的医生和助产士提供新鲜胎盘。这项技术的发展得到了慈善机构 Fetus for Life 的全力支持。AC 是比利时农业研究基金会 (FRIA) 的博士研究员。

伦理

我们实验室的工作是在鲁汶天主教大学伦理委员会和圣吕克大学医院（比利时布鲁塞尔）的批准下进行的，参考文献 2018/23OCT/397。知情同意是从所有的患者。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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