材料和试剂

猎鹰6孔透明平底板（Corning，Ç atalog号：353224）
培养皿（15 × 100mm）上（北卡罗来纳州，Ç atalog号：741251）
7.5厘米3内部容积不透明的PVC管，带螺纹的端部（美国塑料公司，1/4" × 6"的表80 CPVC乳头，Ç atalog号码：30207）
具有1/8”螺纹盖孔中钻出的（FNPT尼龙带螺纹的盖，中心美国塑料公司，1/4" Ç ：62164 atalog数）
快速连接男性和女性的配件（LI-COR公司，Ç atalog号码：300-07124和300-07125）
Balston滤波器（LI-COR公司，Ç atalog号码：300-01961）
橡胶密封件（LI-COR公司，Ç atalog号码：167-07256）
石蜡膜中号实验室膜（亚马逊，Ç atalog数：PM999）
BEV-A线1/4 '' OD15米管（LI-COR公司，Ç atalog号：8150-250）
快速连接，阴隔板接头（LI-COR公司，Ç atalog号码：300-07126）
快速连接，插头舱壁（LI-COR公司，Ç atalog号码：300-07127）
快速连接直联盟（LI-COR公司，Ç atalog号码：300-03123）
铝箔（亚马逊，任何品牌）
燥石膏（LI-COR公司，Ç atalog号码：622-04299）
拟南芥种子 (ABRC., https://abrc.osu.edu )
含有维生素的Murashige & Skoog（MS）培养基（Grainger，目录号：M70800-50.0）
蔗糖（VWR，目录号：BDH9308-500G）
氢氧化钾（KOH）（VWR，目录号：BDH9262-500G）
的Phytagel（西格玛- Aldricht，Ç atalog号：71010521）
无水乙醇100％（VWR，Ç atalog号：71006012）
的Triton X-100（菲舍尔科学，Ç atalog号：AC327372500）
次氯酸钠8％（次氯酸钠消毒漂白，Ç atalog号：CLO32260）
1 / 2 MS液体培养基 pH 5.7（见配方）
漂白溶液（见配方）

设备

轨道摇床（THERMOLYNE更大的法案，Ç atalog号：M49235 ）
LI-850 CO 2 / H 2 ö分析仪（LI-COR公司Ç atalog编号：）
带有 Windows 10 和 USB 端口的计算机，用于运行 LI-COR 软件
珠浴（实验室护甲，Ç atalog号：74300-714 ）
无菌柜（Thermo Scientific，目录号：13-261-221）
高压釜（Steris Amsco Century，目录号：SG-120）
金属珠（实验室护甲，Ç atalog号：42370-004）
计时器/秒表（Big Digit Timer，目录号：ML5004）
压缩空气除尘器（Blow Off Duster，目录号：152-112-226）
实验室天平（梅特勒托利多，目录号：ME103TE）
用于植物处理的弯曲尖端钳（Epredia，目录号：1631）
植物处理剪刀（亚马逊，任何品牌）

软件

LI-8x0 v1.02（LI-COR, Inc. ，https: //www.licor.com/env/support/LI-850/software.html ）
R工作室（R 核心团队，https://www.r-project.org/）

程序

幼苗生长
首先，灭菌拟南芥通过在加入100％乙醇种子种子Ë ppendorf管1分钟，翻转荷兰国际集团的管以混合。移液管在1米升漂白溶液（见ř ecipes）。颠倒混合 5 分钟。除去在无菌卫生署漂白溶液和重悬种子2 O，混合荷兰国际集团1分钟。重复的WA与卫生署SH 2 ö三次以上，重悬种子在无菌0.01％琼脂中。在含有固体二分之一强度 MS-phytagel 培养基的培养皿中传播种子。将板移到黑暗的冷室 (4°C) 中，将种子分层 2 天。将板置于光照下 5 天以允许发芽。转印发芽苗猎鹰6孔培养板，每孔含有约30米升液体的二分之一强度1/2 MS液体培养基（见配方）。乙EFORE测量，一个llow幼苗生长（22℃，12小时光照/黑暗），用于在SLO轨道摇床（放置在植物生长室的内部）的附加18天瓦特速度（图1）。

图1 。23 天（12 小时光/暗）后，幼苗在 1/2 MS 液体培养基中的生长

呼吸测量准备
1.通过将带螺纹的 PVC 管连接到用橡胶密封件密封的快速连接配件，组装轻巧且密封的定制呼吸室。使用直管接头在样品和 LI-850 流入方向之间连接Balston 过滤器。隔板连接器位于连接 LI-850 的管道末端（图 2）。检查连接，以确保有是没什么漏气水ubmerging和检查荷兰国际集团的气泡，或轻轻地吹在室内，检查荷兰国际集团的CO 2的室水平不增加。使用封口膜或凡士林修复可能干扰仪器测量的任何泄漏。

图 2. 定制呼吸室组件。（一）。Ç由一个（1）ustom呼吸室螺纹PVC管和（2）的螺纹与（3）的橡胶密封件密封快速连接管接头帽。(B - G) 。特写视图显示了公快速连接接头的顺序组装顺序。

2.开启珠浴并设置为 23 °C ，让温度变得均匀。
3.打开 LI-850 并连接到计算机 USB 端口。打开“LI-8x0”软件，让机器预热到 51 °C的工作温度（大约 10 分钟）。选择每秒一次读数的数据记录速率和制表符分隔的.csv 文件输出类型。
4.随着该室排空，将其连接到LI-850，掩埋室在胎圈浴（图3）中，为在LI-850软件控制读取，然后按“启动”到日志文件名腔室中的CO 2浓度。在按“停止”记录之前启动计时器并记录 2 分 30 秒（图 4）。个是应该生成稳定的CO 2浓度作为检查，以确保设备正确设置（由CO在实时时间水平线2图）。

图 3. LI-850 和定制呼吸室组件。(A) LI-850通过 USB (1)连接，数据记录到运行“LI-8x0”软件的笔记本电脑。腔室(2)通过管道(3)连接到 LI-850。Balston 过滤器(4)使用直管接头安装在腔室和 LI-850 流入方向之间。隔板(5)位于连接 LI-850 的管道末端。（B）Ç hamber连接到LI-850 。（C和d）对于呼吸作用measuremen TS，T他室盖被移除并且样品置于其内。该腔室被再关闭和埋设在胎圈浴（6）。

图 4.射击呼吸数据收集和分析。(A) 将LI-850连接到运行“LI-8x0”软件的笔记本电脑。（B）小号选仪器默认选项。(C 和 D) S选择文件输出读数。（E）š AVE文件，并开始测量。（F）导出LICOR.txt文件然后批次中的R处理以计算CO的速率2积累在腔室和，因此，的呼吸。

新鲜生物量和暗呼吸数据收集
在CO 2通量测量之前，将含有生长植物的整个 6 孔培养板包裹在铝箔中 1 小时。对于拍摄暗呼吸，请在带有补充光合作用非活动黄色 LED 灯的暗室中操作。
小心地将芽材料与根材料分开。记录鲜重的使用分的转印之前枝条米到光描述的和气密腔室在步骤B1 （见表S1为例如小号的鲜重记录小号）。
记录鲜重（步骤B1）后，连接含有枝条材料到LI-850的腔室立即。键入的样品名称到的LI-850软件，然后按“启动”登录CO 2在腔室中的浓度。在按下“停止”之前启动计时器并记录CO 2数据 2 分 30 秒。”如果设备设置正确，则在此期间应观察到可检测到的 CO 2积聚在腔室中（CO 2图的实时时间呈正斜率）。由于芽材料已从整株植物中分离出来，因此不建议呼吸测量时间超过 10 分钟。
将腔室与 LI-850 断开连接，并使用压缩空气除尘器从腔室中清除所有植物材料。850 LI-连接到填充有燥石膏样品间至少一分钟，以除去一个腔室的任何湿气accumulat版。保证是在LI-850现场CO 2的读数已经下一个样品连接之前恢复到大气水平。
对剩余的样品重复步骤 5 和 6。
每个样本将生成一个包含随时间变化的原始 CO 2浓度测量结果的“.TXT”文件。将所有生成的 LI-850 输出文件传输到一个文件夹进行数据分析。

数据分析

在 R 中，运行“ LI850_respiration.R ”代码文件（参见补充文档）并将 R 工作目录设置为包含生成的 LI850“.TXT”文件副本和包含所有芽重“ShootFreshWeight”的芽鲜重文件的文件夹.CSV 。”
或者，将代码中的死区值从 60 s 的默认参数更改为在呼吸测量稳定之前过滤掉值。在这里，2 分 30 秒读数的前 60 秒被删除，因为 LI-850 测量 CO 2通量率稳定。
按照代码计算文件夹中所有样本的特定芽呼吸速率 (nmol CO 2 gfw -1 s -1 )。枝条特异性呼吸速率小号是使用CO的线性回归计算2通量速率，并然后将该值是由总射击鲜重划分（参照表S1）。
使用RStudio绘图窗格中的向前和向后箭头浏览每个样本的线性回归图，并确保所有样本都具有正斜率。
将处理后的数据另存为“.CSV”文件。

笔记

该协议最好由两个人在几个小时内执行。在我们的案例中，处理10 个样品 5-6 次重复需要3-4小时。在我们的实验设置中，一位研究人员使用天平处理样品并测量鲜重，而另一位研究人员使用 LI-850处理 CO 2通量测量。操作多台 LI-850 机器的其他研究人员可以增加样品吞吐量。该协议还可以广泛地应用于其它组织类型，如植物的根部，用于测量电荷兰国际集团呼吸速率。

食谱

1 / 2 MS 介质 pH 5.7
Murashige & Skoog (MS) 培养基，含维生素2 克
蔗糖3 克
卫生署2 ö800米升
将 pH 值调整为 5.7
用 dH 2 O填充容器至 1 L
如果此时准备固体培养基，则添加 8克琼脂
121°C 高压灭菌 15 分钟
漂白液
1:1 漂白剂和 dH 2 O
0.02％Ť瑞通X-100

致谢

这项工作得到了 Noble Research Institute, LLC 的支持。该协议源自 Fonseca等人。（2020 年）（doi：10.1104/pp.20.00950）。

利益争夺

作者声明没有财务和非财务竞争利益。
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