材料和试剂

玻璃漏斗平原（60 °角和短杆）（Borosil，目录号：6140077 ）
皮氏培养皿（3.9”和5.9”直径）（Borosil，目录号小号：3165A77 [ 3.9” ] ; 3165081 [ 5.9” ]）
锥形瓶中用螺丝帽（250米升容量推荐）（Borosil，目录号：5021024）
塑料托盘（最好是聚丙烯）（Tarsons ，目录号：240090 ）
纤维素膜透析管（14 kDa 截止值）（Sigma-Aldrich ，目录号：D9652）
蒸汽指示带（3M，目录号：1322）
干热指示条（HiMedia Laboratories，目录号：LA812）
来自Laminaria digitata的海带多糖（Sigma-Aldrich ，目录号：L9634）
虾的几丁质粉末（HIMEDIA实验室，Ç atalog号：RM1356）
（NH 4 ）2 SO 4 （HiMedia Laboratories ，目录号：GRM1192）
KH 2 PO 4 （HiMedia Laboratories ，目录号：GRM2951）
K 2 HPO 4 （HiMedia Laboratories ，目录号：GRM168）
ÿ东提取物粉末（HIMEDIA实验室，目录号码：RM027）
中号ALT提取物粉末（HIMEDIA实验室，目录号码：RM004）
ģ lucose（HIMEDIA实验室，目录号码：GRM016）
NaCl（HiMedia Laboratories ，目录号：GRM3954）
琼脂糖（HIMEDIA实验室，Ç atalog号：MB002）
用MgSO 4 · 5H 2 O（西斯科研究实验室，Ç atalog号码：85611）
FeSO 4 · 7H 2 O（Sisco Research Laboratories ，目录号：97868）
ZnSO 4 · 5H 2 O（Sisco Research Laboratories ，目录号：35243）
的Tinopal CBS-X 99％纯（AksharChem ，Ç atalog号：AKSHAR1979）
37％w / w的盐酸（默克大号IFE小号cience ，Ç atalog编号：1003172011）
65/35 涤棉混纺 280 GSM LCCM（从当地市场购买的通用品或从旧实验室外套中收集）
蒸馏水（内部制备）
海带多糖注入琼脂糖凝胶（见食谱）
Tinopal CBS-X OFB 染色溶液（见配方）
甲壳素酸浆（见配方）
CCMS肉汤培养基（见食谱）
注意：所有材料均在室温下保存，避免过度潮湿。

设备

微波炉（三星，型号：MS23F301TAK/TL ）
抗生素Zonescale（HiMedia Laboratories，目录号：PW297）
带有固定穿孔板 6 英寸直径的釉面瓷或塑料布氏漏斗（瓷器：Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：FB966J ；塑料：Cole-Parmer，Dynalon TM ，目录号：WW-06128-10）
用于布氏漏斗的橡胶适配器（可选与真空泵一起使用）（通用）
真空泵（可选）（Toshniwal Instruments (Madras)，型号：TDC6）
磁力搅拌器和圆磁力搅拌棒用PI VOT环8 × 65毫米（REMI销售和工程有限公司，磁力搅拌器：米Odel等：1ML ;磁性搅拌棒：Tarsons，目录号：4115）
高压锅或高压锅灭菌（高压锅：Osworld，型号：JRIC-39 ；高压锅：TTK Prestige.，型号：Popular 16L）
玻璃搅拌棒和塑料刮刀
带喷嘴和手柄的塑料烧杯 2 L（Sigma-Aldrich，Brand TM ，目录号：BR41012）
布氏烧瓶（推荐容量 > 2 L）（Sigma-Aldrich，Pyrex TM ，目录号：SLW1170/14D）
载物台千分尺和目镜刻度（Erma Inc.，型号：ESM11）
显微镜（奥林巴斯，型号：CX41）
瓷研钵和研杵（Sigma-Aldrich，Coors TM ，目录号：Z247499）
水蒸馏系统（Borosil，目录号：3361-1.5 L）

软件

Java 运行时环境（Oracle ，https://www.java.com/en/）
斐济 (ImageJ)（美国威斯康星大学麦迪逊分校光学和计算仪器实验室。https://imagej.net/Welcome）

程序

安全说明：CC 制备的初始步骤使用浓无机酸 (HCl)。必须佩戴护目镜和手套并采取其他安全措施。在通风橱或通风良好的区域执行涉及浓酸的步骤。

使用基于 LCCM 的过滤装置制备 CC 和 CFS
A1. CC的制备
在 250 毫升玻璃烧杯中称取 10 克虾甲壳素粉，并将其与 100 毫升 37% w/w HCl 混合。使用玻璃棒缓慢但彻底地混合。确保没有几丁质粉团。会形成很稠的浆液，慢慢变成褐色。
将烧杯转移到装满冷冻水或冰的塑料托盘中。这将减少由于添加浓酸而产生的热量。
保持每 5 分钟将浆液与玻璃棒混合 30 分钟。
在该过程的最后阶段，浆液的粘性会明显降低。
在酸水解步骤后，将酸浆与 2 L 冷冻蒸馏水缓慢混合，同时混合。在此步骤中使用磁力搅拌器。会立即形成白色蓬松物质。让这种悬浮液混合至少 15-20 分钟。更长的混合时间提高了悬浮液的均匀性。
组装基于 LCCM 的过滤装置，如图 1A 和视频 1 所示。 LCCM 的单层足以过滤 CC。使用橡皮筋将 LCCM 紧紧固定到位。恩相信大多数漏斗的穿孔板的表面是在与LCCM接触。将过滤装置放在托盘内，以收集由于芯吸而可能从 LCCM 滴落的任何液体。

图 1. 基于实验室外套服装材料 (LCCM) 的过滤装置。（A）P胶态壳多糖的赔偿（CC）。（B）ç ELL自由上清液（CFS）。一块 LCCM 取自旧的实验室外套。

视频 1.组装基于 LCCM 的过滤装置和制备 CC

将酸性 CC 悬浮液缓慢倒入布氏漏斗中。在这个阶段，该溶液仍然是相当酸性的。处理时要小心。
澄清的滤液将收集在布氏烧瓶中，而 CC 被截留在 LCCM 中。可以任选地使用真空泵来加速该过程。
将所有悬浮液倒入漏斗中。让水从困在 LCCM 中的厚 CC 糊中排出。如果没有真空泵，这可能需要 30-45 分钟。
小心地从过滤装置中取出橡皮筋，并从漏斗中取出 LCCM。将 LCCM 放在平坦的表面上。将所有浓稠的 CC 糊刮掉并转移到装满蒸馏水的 2 L 烧杯中。使用磁力搅拌器将该悬浮液混合 15-20 分钟。
如果您打算重复使用，请用自来水清洗 LCCM 并擦干。干燥步骤可以避免，但根据我们的经验，它大大提高了过滤率。重新组装的过滤装置按照步骤6，重复过滤过程（小号TEPS 7-11）。
这个过程必须重复，直到 CC 浆液的 pH 值接近中性。通常情况下，3-5次重复的过滤过程中需要得到接近中性的蛋糕。可以通过允许水从CC膏（漏极更多的时间被减少的重复次数小号TEP 9）。每个过滤周期大约需要2小时才能完成。
收集 CC 糊并在高压釜或压力锅中在 121°C 下灭菌 15 分钟。使用蒸汽指示带验证灭菌过程。
将已灭菌的 CC 储存在 4°C 下，直至使用密闭容器中。在此条件下，产品可存放至少 6 个月。

A2。粮安委的准备
此过程是最适合于真菌，放线菌的是显示出粒料的增长。
在高压釜或压力锅中在 121°C 下对 LCCM 和锥形瓶盖进行消毒 15 分钟。在 170°C的热风烘箱中对锥形瓶和玻璃漏斗进行消毒45 分钟。使用适当的指示带/条来验证灭菌过程。
在层流室内的无菌条件下组装图 1B 所示的 CFS 过滤装置。使用无菌镊子将 LCCM 推入漏斗。
不需要使用橡皮筋将 LCCM 固定到漏斗上。
本研究使用在胶体几丁质矿物盐培养基 (CCMS) 中生长的Streptomyces rimosus AFM-1 的液体培养物。培养物表现出颗粒生长。将发酵肉汤的内容物倒入用 LCCM 包裹的漏斗中。等待漏斗中的液体过滤到烧瓶中，然后再加满。
用盖子关闭玻璃烧瓶并储存在 4 °C 直至进一步使用。
自行收集，处置的细胞团按要求。处置或清洁之前净化细胞质量和LCCM ，分别。

Streptomyces rimosus AFM-1海带多糖酶的提取和平板检测
B1. AS降水
如果有的话，使用粉末状的 AS ，或者使用研钵和研杵将颗粒研磨成精细的稠度。粉末状 AS 很容易溶解在 CFS 中。
AS 与 CFS 的混合应在 4°C 下进行，以避免蛋白质变性。如果没有冷藏室设施，请使用碎冰。
称量所需量的粉末状 AS。将小部分添加到 CFS。使用磁力搅拌器低速搅拌。恩确保先前添加部添加下一个之前完全溶解。高混合速度或大量 AS 会导致起泡和随之而来的蛋白质损失。
在低温下继续搅拌 CFS 至少 30 分钟。
以4 , 032 × g离心30 分钟以沉淀沉淀的蛋白质。必须针对不同的蛋白质优化离心参数。
倒出上清液并将蛋白质沉淀溶解在少量 50 mM 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5) 或您选择的任何其他缓冲系统中。该溶液的酶含量可直接通过海带多糖-注入琼脂糖平板测定法进行分析。
类似沉淀实验可以用不同浓度的进行（即，30-90％的饱和度）。此类实验可用于优化沉淀所需的 AS 饱和度，同时降低污染蛋白质的水平（图 2）。

B2. 使用含有 OFB 染色的海带多糖琼脂糖板测试酶溶液
制备的0.8％琼脂糖和在50 0.15％昆布多糖溶液mM磷酸钾缓冲液（pH为6.5 ）通过熔化在该溶液中一烤箱微波倒入一个干净的P ETRI菜。等待凝胶凝固。
使用软木钻孔器，在琼脂糖凝胶中切出直径为6毫米的孔。
将 20-50 µl 海带多糖酶或 AS 沉淀样品倒入孔中。使用任一普通的缓冲器或热的相同体积-灭活酶溶液作为一个阴性对照。请参阅该作进一步说明注释部分。
放置P在培养箱组ETRI培养皿在37℃下。在运行全面实验之前，为您的应用标准化孵育时间和温度。
同时，在蒸馏水中制备 0.15% 的 OFB Tinopal CBS-X 溶液。在避光的容器中新鲜制备此溶液。
4 小时的孵育时间后，用 OFB 溶液淹没琼脂糖凝胶的表面。在黑暗中孵育板 15 分钟。丢弃 OFB 溶液并用蒸馏水脱色一次 20 分钟。
观察P下365nm的UV光（图2A和2B）ETRI菜。建议使用抗生素区域刻度或校准刻度尺来测量水解区域。

图 2. 基于海带多糖琼脂糖平板检测优化硫酸铵 (AS) 浓度。(A) AS 沉淀海带多糖酶的热变性 (1) 和天然(2)样品。(B) 酶沉淀物 (30-90% AS 处理)。30% (1); 40% (2); 50% (3); 60% (4); 70% (5); 80% (6) 和 90% (7)。(C) 提高选择性的建议性沉淀方案。

LCCM的平均弗雷德孔径测定（小号EE视频2）
根据制造商的建议，将刻度放在显微镜的目镜中。
将载物台测微计置于显微镜中并使用4 ×物镜聚焦。
将千分尺和刻度上的标记对齐。拍照 (P1)。此图片将用于 ImageJ 软件的“定义比例”功能。
取下载物台千分尺并小心地放置一块 LCCM，而不会干扰焦点设置。
轻推 LCCM 使其成为焦点。使用 LCCM 对焦 (P2) 拍照。该图片将用于测量 LCCM 中的平均 Feret 孔径。
下载最新的 Java 运行时环境 (JRE) 并安装。
下载斐济软件并解压 zip 文件(Rueden et al. , 2017) 。该软件作为便携式应用程序提供，因此无需安装。
双击位于解压文件夹内的 ImageJ 应用程序文件。
“分析”菜单对这项工作很重要。此处使用的大部分功能都在此菜单下（即“设置比例”和“测量”）。
在 ImageJ 中打开 P1。选择直线工具。从千分尺标记的左端画一条线到舞台千分尺和刻度上的线彼此对齐的位置（图 3A）。

图3的ImageJ用于弗雷德平均孔径的决心。（A）在绘制的ImageJ一条直线。舞台微米和目镜刻度彼此对齐。（B）设置测量刻度（“集规模”功能）。计数标记的数量上的阶段用千分尺上的标记即对准的目镜刻度。（C）使用椭圆选择工具选择在LCCM的孔。（d）的ImageJ的'结果'窗口。注意所选区域的尺寸参数。

请注意与刻度标记对齐的载物台千分尺中的标记数量。例如，在图 3A 中，它位于阶段 micrometer 的第三个标记处，相当于 300 微米。
打开“设置比例”选项并在“已知距离”菜单中输入 300。在“长度单位”菜单中输入“ u m ”。ImageJ 会将其识别为μ m 。单击“全局”复选框，然后按“确定”（图 3B）。
ImageJ 现在已校准以执行测量操作。在不退出软件的情况下打开 P2。
选择椭圆或手绘选择工具。在 P2 中选择一个孔（图 3C ）。
单击“测量”选项。将打开一个新的“结果”窗口，其中包括 P2 中所选区域的所有尺寸参数（图 3D）。
记下 Feret 的直径。
选择另一个孔和重复小号TEPS 14-16。根据要求分析 P2 中尽可能多的孔并将结果制成表格。计算平均值。这将是 LCCM 的平均 Feret 孔径。

视频 2. 使用 ImageJ 工具确定平均 Feret 孔径

数据分析

使用含有 OFB 染色的海带多糖琼脂糖板测试酶溶液
水解区域可以使用标尺或抗生素区域标尺测量。
可以包括重复样本以提高精度。
计算平均值，如果需要，该区域的直径的标准偏差。
此任务不需要特殊的数学/统计工具。
请参阅 Koteshwara等人。（2021 ）（补充材料）了解更多信息。

LCCM平均Feret孔径的测定
使用至少三个不同的 LCCM 图片来确定孔径。
从 ImageJ 软件中制表 Feret 的直径值。
求 Feret 孔直径的平均值。还可以制作表示孔径分布的图表。
请参阅 Koteshwara等人。（2021 ）（补充材料）了解更多信息和图表。
此任务不需要特殊的数学/统计工具。

笔记

对于海带多糖板测定，如果试剂或缓冲系统的浓度与此处描述的不同，则运行一些试验实验。
试剂和设备下列出的大多数项目都可以使用具有成本效益的替代品。
此处描述的带有 OFB 染色的海带多糖注入琼脂糖凝胶方法可用于优化 AS 浓度和沉淀时间（有关更多信息，请参见Koteshwara等人，2021 年），而无需透析样品。来自优化实验的数据可用于减少污染蛋白质的数量（图 2B 和 2C）。
缓冲系统和海带多糖浓度可根据需要改变。改变昆布的体积-注入琼脂糖凝胶基于所述的直径P用于获取ETRI盘的所需的凝胶厚度。我们建议加入25 ml和65毫升，分别为3.9”和5.9”直径P ETRI菜肴。
使用叠氮化钠，以抑制在昆布微生物生长-注入琼脂糖凝胶（参见ř ecipe小号）。
在 100°C 下煮沸酶样品 20 分钟通常会使大多数蛋白质变性。运行实验以确认失活。变性酶样品可用作阴性对照。
真空泵可用于加速 CC 过滤。
压力锅最适合对小批量物品进行消毒。在过去的几年里，我们成功地使用了 16 升压力锅和液化石油气 (LPG) 炉。
可能还有其他方法可用于使用 ImageJ 确定平均 Feret 孔径，但此处描述的程序直接且简单。
该方法在这里描述的是简单，价格低廉，且容易在大多数研究实验室没有进行一对CC和CFS的编制大容量离心机。透析是在优化 AS 浓度和沉淀时间期间通常遵循的耗时程序，可以通过使用此处描述的海带多糖板测定来避免。

食谱

海带多糖琼脂糖凝胶
50 mM 磷酸钾缓冲液
0.15% 海带多糖
0.8% 琼脂糖
0.05% 叠氮化钠（可选）
酸碱度 6.5
溶解0.294克的K 2 HPO 4 ，0.451克KH的2 PO 4 ，0.15g的昆布多糖，0.05克叠氮化钠（可选）的，和将0.80g琼脂糖在100毫升蒸馏水中。热溶解，倒入P ETRI菜。
Tinopal CBS-X OFB 染色液
0.15% Tinopal CBS-X 99% 纯
将 0.15 g OFB 溶解在 100 ml 蒸馏水中。
甲壳素酸浆
10克虾甲壳素
37%w/w 盐酸
在 100 毫升 HCl 中缓慢混合 10 克几丁质。按照 A1 部分进行操作。
CCMS肉汤培养基
溶解 2.803 g K 2 HPO 4 、1.893 g KH 2 PO 4 、1.5 g NaCl、3 g 酵母提取物、0.5 g MgSO 4· 5H 2 O，0.01克的FeSO 4 · 7H 2 O，0.001克的ZnSO 4 ，25克湿润CC 1 ，000个毫升蒸馏水。调整到 pH 值 7.0。

致谢

这项工作得到了支持的生物技术部，科学技术部的，印度政府（项目编号：BT / PR10827 / AAQ / 3 /2014分之661），是以前的工作由Koteshwara主题等。(2021)。作者要感谢博士生 Gayam Prasanna Kumar Reddy 先生在录像方面的帮助。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

这项研究工作没有使用人类受试者或动物。

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