材料和试剂

感染HIV-1的感兴趣细胞
蛋白酶K（20mg/ml）（> 30U/mg）（Eurobio，目录号：GEXPRK01-B5）
AL缓冲液（QIAEN，目录号：19075）
苯酚 - 氯仿 - 异戊醇（Sigma-Aldrich，目录号：77617-100ml）
氯仿（Sigma-Aldrich）
纯水（Life Technologies，Gibco ）
绝对乙醇（Sigma-Aldrich）
3 M乙酸钠（pH 5.0）
DpnI Fast Digest限制酶和反应缓冲液（Fermentas，目录号：FD1704）
Platinium SYBR Green qPCR Supermix UDG（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11733-046）
qPCR引物
HIV-1（pNL4-3）和GAPDH（pGAPDH）的标准质粒

设备

离心机
无DNA罩
Speed-vac
热封机
qPCR机
96孔qPCR板（Eppendorf）
用于qPCR板的塑料膜（Eppendorf）
过滤提示

程序

收集在1.5ml Eppendorf管中感染HIV-1感兴趣的至少5×10 5个感兴趣的细胞，并在200×g离心3分钟。弃去上清液，并在1ml无菌PBS中洗涤沉淀一次。在200×g离心3分钟，然后将干燥的颗粒在-80℃下储存几个月。
打开一瓶新的无菌PBS。在180μlPBS中彻底重悬沉淀。加入20μl（12 U）的蛋白酶K和200μl的AL缓冲液。剧烈涡旋并在56℃下孵育1小时
加入400μl苯酚 - 氯仿。剧烈涡旋并在16,200×g离心5分钟。收集上层相并加入400μl氯仿。剧烈涡旋并在16,200×g离心5分钟。
收集上层相，加入800μl无水乙醇和40μl乙酸钠3 M（pH 5.0）。将管颠倒两次，在-20°C孵育1小时，以允许DNA沉淀
在冷离心机（4℃）中以16,200× g离心至少30分钟。弃去上清液，用500μl70％乙醇洗涤。弃去上清液，以速度真空干燥沉淀5分钟
打开一瓶新鲜的纯净水。在20μl纯水中彻底悬浮沉淀，将DNA提取液在-20°C下储存几周，或在-80°C下储存几个月。
通过DpnI快速消化限制性酶消化DNA提取物以消除可能的细菌质粒污染。添加4微升的快速消化10x缓冲液和1微升的酶到5微升的DNA提取物。在37℃孵育15分钟。
在95°C孵育样品10分钟，以加热灭活酶，并完全再溶解DNA。剧烈涡旋每个管至少1分钟
将一部分样品稀释在40倍体积的纯水中，以防止快速消化缓冲液抑制随后的PCR反应。
在无DNA罩下，按如下（每个样品的量）制备反应混合物：1μl每种引物，10μlSYBR Green和3μl纯水。将反应混合物分配在96孔qPCR板的孔中，避免气泡。在罩外，加入5μl的模板DNA进行定量。作为阴性对照，加入5μl纯水代替DNA。对于绝对定量，使用已知浓度的标准（例如，范围从10×10至10×10 7个拷贝）。每个样品和每个标准品一式两份定量。为了定量"早期"HIV产物，使用以下引物：GGC TAA CTA GGG AAC CCA CTG和GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CTA A.为了定量"晚期"RT产物，使用：GGC TAA CTA GGG AAC CCA CTG和CCT GCG TCG AGA GAG CTC CTC TGG。为了定量细胞的量，用下列引物定量GAPDH的量：GGG AAA CTG TGG CGT GAT和GGA GGA GTG GGT GTC GTT。
用粘性塑料膜覆盖板，短暂离心并热封
使用以下程序定量"早期"RT产物（扩增子长度：183bp）：35个循环10秒95℃，10秒57℃，15秒72℃。对于"晚期"RT产物（扩增子长度：200bp）和GAPDH （扩增子长度：303bp），PCR程序为：35个循环，10秒95℃，15秒57℃，15秒72℃）。
为了将标准质粒的浓度（μg/μl）转换为拷贝数，使用下式：

为计算每个细胞的HIV-1 DNA的量，除绝对值 HIV-1 DNA的DNA拷贝每一半量的GAPDH拷贝（因为每个单元格包含两个GAPDH副本）。
拷贝数=浓度/（（以bp计的质粒大小×660）/6.02×1017 ）
"早期"和"晚期"RT产物的定量化的代表性实验可以在Roesch等人（2012）的图4D中找到。

笔记

所有移液步骤都使用过滤嘴。
准备等分的纯水，并将其存储在-20°C。对每个实验使用一个新的。
"早期"RT产物在5'LTR区域中扩增。 "晚期"RT产物在5'LTR区和gag 基因之间扩增。这些区域是高度保守的，因此所指示的引物允许定量许多不同菌株例如NL4-3的HIV-1 DNA。要知道特定菌株是否会被这些引物扩增，应该对齐菌株和引物的序列，并检查它是否相同。
除非另有说明，所有步骤在室温下进行
测量不同样品的DNA浓度不是绝对必需的，因为GAPDH标准化考虑了DNA提取效率的差异。

致谢

该协议改编自Roesch等人（2012）。

参考文献

Roesch，F.，Meziane，O.，Kula，A.，Nisole，S.，Porrot，F.，Anderson，I.，Mammano，F.，Fassati，A.，Marcello，A.，Benkirane， Schwartz，O。（2012）。热疗刺激HIV-1复制。 PLoS Pathog 8（7）：e1002792。