材料和试剂

1.培养皿，直径 100 mm（Greiner Bio- O ne，目录号：627102 ）
2. 12/24孔板中（Corning，目录号小号：3512 [ 12孔] ; 3527 [ 24孔] ）
3.琼脂糖包被的培养皿（自制）：直径10厘米，直径6厘米（格雷纳生物ø NE，目录号小号：627102 [直径10厘米] ; 628102 [直径6cm ] ）和6-孔板（罗斯，目录编号：ATCO.01）。对于涂层, 在 ERM (medaka) 或 E3 (斑马鱼) 中使用 1% 的琼脂糖。塑料板底部应覆盖琼脂糖；1-2毫米厚就够了。
4.细胞保护小贴士 (200 μ l)（Biozyme，目录号：729051 ）
5.硼硅玻璃毛细管，外径 1.2 mm ×内径0.94 mm（注意这些与注射针不同。它们不应包含内部细丝。HARVARD仪器，型号：30-0016 GC120T-10 或 GC120T-15）
6.剃刀刀片（切开硼硅酸盐针）（Schreiber Instrumente，目录号：11-0240）
7.自制（空气）移植装置
管接头，注射器嘴（Narishige，型号：CI-1）
铁氟龙管（Narishige，型号：CT-1）
手柄探针（WPI，目录号：2505）
针架（2 MM Press Port 1.2 MM，WPI 目录号：MPH412）
环氧树脂灌封（灰色，WPI，目录号：4886）
1毫升注射器（BD Plastipak，目录号：REF300013）
8.玻璃巴斯德吸管（WU Mainz，目录号：200760）
9.玻璃巴斯德移液器，打开的吸头
10.玻璃板（直径40毫米；Roth ，目录号：T937.1）
11.镊子（Dumont No. 5 或 No. 55）
12.长提示 – 处理去绒毛膜后的青鳉胚胎（Eppendorf，型号：5242956003，机架中的微型装载机20 µl ）
13.砂纸 (240/180)
14.塑料巴斯德吸管（Biosigma ，目录号：390512）
15.过筛洗斑马鱼胚胎
16.收集青鳉女性的网（自制）
17.钩取青鳉胚胎（自制，详见图1）

图 1.钩子收集青鳉胚胎。接种环架（Roth，KL97.1），长21厘米；电线 1.4301：长 2厘米，宽 2.5 厘米。

18.玻璃烧瓶（100毫升，500毫升）
19. 100 ml烧杯（Schott，目录号：211062402）
20.低熔点琼脂糖（Roth，目录号：6351.5）
21.链霉蛋白酶（Roche，目录号：10165921001）
22.孵化酶 (HE) medaka（自制，可在 NBRP Medaka 订购：https ://shigen.nig.ac.jp/medaka/strain/hatchingEnzyme.jsp;jsessionid = 8F08DDE7593CDD7D1BFA32E6382E7E0F ）
23.移植模具（我们使用自制模具；见图 2。类似的商业模具可以在：https : //www.wpi-europe.com/products/pumps-and-microinjection/oocyte-injection/z-molds找到。 aspx )
24. Ë mbryo ř抽穗米edium为青鳉（ERM）（见配方）
25.斑马鱼培养基（见食谱）
26. 20 × Tricaine （Sigma-Aldrich，目录号：A5040-100G）（见配方）

图 2.移植模具。为了制作移植板，将模具自上而下插入 1.5% 琼脂糖中（见 B1 部分）。( A)在水中装满 1.5% 琼脂糖的培养皿，约。60°C。( B-B')具有将形成井的结构的详细视图的移植模具。（C）ţ ransplantation模具放置在含有琼脂糖的培养皿，但面向琼脂糖的孔中。( D)移植模具留在培养皿中，直到琼脂糖形成稳定的凝胶。( E)当移植模具被移除时，琼脂糖凝胶包含放置胚胎的孔。移植板就准备好了。

设备

1.斑马鱼饲养系统（配备 3.5 升水箱的 Tecniplast ZEBTEC）
2.斑马鱼交配箱（自制 5 L 箱；见图 3。或者，我们使用 Tecniplast 的繁殖箱 – 0.8 或 1.7 L，倾斜水箱）

图 3. 斑马鱼交配盒。斑马鱼交配盒的横向视图（顶部）和顶部视图（底部）。此设置最多可容纳五对夫妇。

3. Medaka 住房系统（Tecniplast ZEBTEC 配备 3.5 L 储罐和 Müller & Pflege，配备 4 L 储罐）
4.培养箱，23°C（无需 CO 2控制）（粘合剂，型号：9020-0339）
5.培养箱，28°C（无需 CO 2控制）（Rumed，型号：200330160）
6.培养箱，32°C（无需 CO 2控制）（粘合剂，型号：9010-0081）
7.微量移液器拉拔器（我们使用水平拉拔器，Sutter Instrument CO，型号：P-97）
要拉出哈佛仪器 GC120T – 10 根毛细管，我们使用以下程序：Heat 505；拉25；250 级；时间 10)
7.移植装置（自制空气系统；见图 4。我们也成功使用了 Eppendorf CellTram R Air/Oil 系统）

图 4. 设置移植。主要部件：(1)显微操作器和带光源的立体镜；(2)移植针插入持针器；(3)附在针头和注射器上的管子（气密）；(4)注射器（体积 1 毫升）附在桌子上。

8.带光源的立体镜（奥林巴斯，型号：SZX7）
9.显微操作器（Eppendorf，型号：InjectMan NI 2）
10.移液器（吉尔森20-200微升，200- 1000微升）
11.荧光体视显微镜（Nikon，型号：SMZ18，Lumencor 太阳能光引擎）
12.微波炉

程序

请考虑图 5 ，了解完成协议所采取的步骤顺序和使用的相应温度设置。

图5 。种间移植时间表

A.设置鱼产生胚胎
鳉
1.鳉十字架
Medaka 被保存在各自的繁殖组中，以便在第二天进行早期繁殖。没有必要在前一天将雌性和雄性分开。可以每天为每个雌性收集胚胎，每个雌性产下大约 20 个卵。受精后，胚胎会附着在母亲身上几个小时。请注意，与斑马鱼雌性相比，您需要使用更多的青鳉雌性。
2.上午 9:00 - 9:30 –胚胎收集
在实验的早晨 (~ 9 : 00 am), 确定一个雌性窝藏胚胎并用渔网轻轻捕获它 (图6 )。

图6 。青鳉和斑马鱼杂交和胚胎收集的设置

使用薄金属钩 (图 1) 收集胚胎, 从雌性的腹部轻轻地刷它们。将雌性放回水箱中。
将胚胎从网或从钩子转移到装有 ERM的10 厘米培养皿中。
将青鳉胚胎置于 32°C 的 ERM 中。这有助于胚胎更快地发育以赶上斑马鱼囊胚（Furutani-Seiki 和 Wittbrodt，2004）。
3. 2:00 - 3:00 pm –孵化青鳉胚胎
一种。青鳉胚胎的孵化最好在 256-512 细胞阶段（下午 2 点）进行。年轻的胚胎更脆弱；如果较早孵化，死亡率会增加。
湾从鱼培养基中取出青鳉胚胎，用手指在砂纸（240 粒）上轻轻滚动，去除绒毛膜上的毛发。
注意：目标是在绒毛膜的外部打孔，以利于孵化酶从内部降解绒毛膜。我们使用去除毛发作为有效创建孔的代理。
在立体显微镜下检查胚胎以监测脱毛情况。重复滚动步骤，直到所有头发都消失了。
在继续之前丢弃死胚胎。
C。在 ERM 培养基中冲洗胚胎
d. 使用巴斯德吸管将胚胎转移到玻璃管中，并除去所有液体。
使用已切掉吸头的塑料巴斯德吸管
每管不要放置超过 20 个胚胎。
e. 用孵化酶 (HE) 覆盖胚胎并在 28°C 下最多孵育 30 至 60 分钟。
使用尽可能少的 HE，仅覆盖胚胎。
始终用封口膜覆盖管以避免 HE 蒸发。
孵化时间取决于：a) HE 的质量，尤其是在使用自制 HE 时，以及 b) 管中的胚胎数量。
笔记：
1)增加 HE 体积与胚胎的比例会导致更快的孵化。
2) ii) 如果脱毛效率低下，孵化需要更多时间，甚至可能完全失败。
每 10-15 分钟在立体显微镜下检查 HE 反应的进度。
F。当胚胎在绒毛孔，仔细地洗他们四次与ERM。
通过让 ERM 在管的一侧缓慢流动来冲洗胚胎。
请注意，胚胎在去除绒毛膜时非常脆弱。
重要的是在 28°C 下使用 ERM 以避免热休克。
G。将胚胎转移到琼脂糖涂层培养皿中 - 按照图7 中的步骤操作。
用 ERM 完全填充玻璃管。
将一根手指放在上面，完全密封管子 - 避免气泡。
缓慢倒置，将管子顶部置于琼脂糖涂层培养皿中的培养基表面下方。
松开手指，让胚胎下沉。

图7 。去除青鳉胚胎的步骤

斑马鱼
3:00 - 6:00 pm （第 -1 天）设置斑马鱼杂交（Westerfield，2007）
在移植实验前的下午，用一个大的繁殖池将雌性和雄性分开。
用 2:1 的鱼水: 去离子水填充养殖箱。
饲养箱由 2 个隔间组成，隔间由网孔隔开。将男性放在底部隔间，将女性放在上隔间。
一个十字架由 5 只雄性和雌性组成；根据您的实验，您可能需要设置多个交叉。
9:30 - 10:30 （第0天，移植日）：胚胎采集
一种。在实验的早上（9.30 am – 10:00 am），将雄性转移到上层隔间——它们现在与雌性在一起。
湾倾斜网格分离器以创建具有较浅和较深区域的斜坡（图6 ）。
注：斑马鱼通常在浅水区繁殖；你应该观察情侣在上肢交配。
C。让十字架不受干扰 20-30 分钟。
注意：之后您应该观察在水箱底部积累的胚胎。
d. 将鱼转移到鱼缸中并取下网状底部分离器。
e. 通过细筛子运行养殖箱水来收集鸡蛋。
F。将胚胎转移到直径为 10 厘米的培养皿中，并用斑马鱼培养基冲洗
G。将胚胎保持在室温 (~23°C)。
2:30 - 3:30 pm –在早期囊胚阶段孵化斑马鱼，258 到 512 细胞阶段（Westerfield，2007）
将斑马鱼囊胚转移到 100 毫升玻璃烧杯中。
取出斑马鱼培养基，加入 30 毫升新鲜斑马鱼培养基。
添加 1 毫升链霉蛋白酶 (30 毫克/毫升)。
注意：在使用前将 Pronase 解冻并放在冰上。
每 30 秒将烧杯转一圈，在立体镜下检查链霉蛋白酶的活性（图8 ）。
没有绒毛膜的胚胎最先在中心堆积。
时间范围为 3 到 7 分钟，具体取决于链霉蛋白酶的质量和每个烧杯的胚胎数量。预分装 Pronase 以避免多次解冻和冷冻循环，这会影响其质量并延长孵化时间。
当您看到几个没有绒毛膜的胚胎时，就该停止反应了。其他胚胎的绒毛膜将在洗涤过程中消失。

图8 。去除斑马鱼胚胎的步骤

丢弃链霉蛋白酶溶液并清洗斑马鱼培养基至少四次。
注意：每次洗涤都会去除相当数量的绒毛膜。
将刚孵化的胚胎转移到带涂层的培养皿中，并将它们保存在斑马鱼培养基中直至移植。

B. 2:30 - 4:00 pm准备移植设置
1.琼脂糖涂层培养皿和移植模具
涂层菜肴
在 ddH 2 O 中制备 1.5% 的琼脂糖溶液，并在微波炉中煮沸直至溶解。
琼脂糖溶液可以新鲜制备或预制储存：
使用1 L瓶并准备 800 ml 琼脂糖溶液。
在使用前将琼脂糖溶液保持在 65°C。
如果使用塑料盘子，用 1.5% 的琼脂糖涂上它们。
玻璃盘子不需要镀膜。
涂层：将琼脂糖溶液倒入10 厘米培养皿中，直到刚好盖住底部（约20 毫升）。
为每个基因型准备至少一个 10 厘米的培养皿，以在移植前保持 dechorionated 胚胎。
为移植的囊胚准备一个 10 厘米的培养皿或 6-/12-/24 孔板。
使用以上哪一种取决于实验设计。如果捐助者需要不断的筛选后（即，以检查遗传背景），较小的孔板是让捐助者和主机单独，允许最相关的嵌合体的鉴定。
使用青鳉时，每个共享体积的胚胎较少，因为相邻胚胎的死亡会影响存活率。在 24 孔或 12 孔板中每孔保留一个囊胚，或在 6 孔板中每孔保留大约三个囊胚。
使用斑马鱼时（如果未跟踪供体/宿主组合），10 厘米培养皿可提供良好的存活率。
移植板
将琼脂糖溶液倒入直径为 10 厘米的培养皿中，直到底部被覆盖。
将移植模具 (图 2) 放在琼脂糖的顶部。
威尔斯应该面朝下。
避免气泡。
移植模具不应被琼脂糖覆盖。
一旦琼脂糖变硬，就可以使用镊子去除霉菌。
准备好的板可以在冰箱中存放一天，但在使用前需要在室温下平衡。
2.准备移植针
用水平拔针器拉玻璃毛细管。
移植针应当是长且薄的（小号EE图9 ）。

图9 。移植针。图像示出了拉动从制造商（材料前针＃5），之后与针拔出器（在设备描述设置拉＃7 ），和之后用刀片（被打开B2一个）。

用刀片打开针
针的直径应大于细胞直径。由于囊胚细胞根据其发育阶段具有不同的直径，因此您需要根据您使用的阶段和要移植的细胞数量调整针头的开口。
小直径（1-1.5 ×细胞宽度）的针头单独吸收细胞，导致细胞在针头中的分散度更高，从而更好地控制移植细胞的数量。
直径较大的针可以用较少的液体移植更多的细胞，从而保持供体细胞的完整性。
针的边缘不应太锯齿。然而，轻微的倾斜有助于推动供体和宿主囊胚。
一根好的针头可以重复用于多次移植。要储存它，一定要在最后一次移植后多次服用 ERM/斑马鱼培养基来正确清洁它。
3.设置显微操作装置
使用具有 ~0.7-7:1 放大率的立体显微镜和连接到带有显微控制器和针架的 3 轴电动机械手的集成光源（参见图 4 中的设置）。
将管子连接到针架和注射器（体积 1 毫升）并密封。
用胶带将注射器固定在桌子上。
注意：这将允许您单手控制注射器，从而控制细胞进出移植针。
将移植针放入持针器中。
在视野中放置一个带有鱼培养基的盘子，并使用显微操作器将针尖浸入水中。
移动注射器柱塞并检查是否有介质进出针头。
注意：如果液体对柱塞的运动做出直接且可预测的响应，那么您就可以开始了。

C.下午 3:30以后–移植
检查两个物种的胚胎是否处于囊胚阶段（~下午 3 点）（Kimmel等人，1995 年；Iwamatsu等人，2004 年）。将板移动到显微注射设置，以避免随后的水运动。
1.将供体和宿主囊胚置于交替列中（图10 ）。
用宿主物种的培养基填充移植板。
使用玻璃巴斯德吸管将斑马鱼胚胎转移到各个井中。
Dechorionated 斑马鱼囊胚的直径略小于玻璃巴斯德吸管的直径。
用移液管从盘子中取出几个囊胚，然后将它们单独释放到移植盘中，将它们沿柱子放置，每孔填充一个胚胎。
捐助者应放在最左边的一栏中；主机应该放在第二到第五列。由于来自一个供体的细胞可以移植到多个宿主，因此可以方便地为每个供体安排多个假定的宿主。
容纳胚胎，细胞朝上。
胚胎通常在卵黄朝下的情况下落入模具中，不需要进一步重新定位囊胚。但是，如有必要，请用移液器拿起囊胚并重试，或使用如下所述的Microloader TM吸头。
单独转移青鳉囊胚，并使用细胞保护器提示将每个囊胚放在模具旁边。
将塑料 Microloader TM尖端的末端夹到 2-3 厘米。
使用尖端轻轻将囊胚推入模具，动物极（囊胚细胞）朝上。只接触动物杆上的细胞，不要用塑料尖端接触蛋黄细胞。

图10 。胚胎在移植板中的位置和方向。斑马鱼胚胎（A）可以用玻璃来处理P asteur吸管和容纳直接进入琼脂糖井。青鳉胚胎（b）是更大和需要被转移用塑料P asteur吸管入菜，然后处理到孔与中号icrol ö阿德TM尖端。

2.囊胚移植（图11 ）
校准移植针。
通过注射器施加温和的负压，在移植针中吸取少量培养基。使用它来调整自己以适应针内水流对施加压力的响应。
在尝试从供体中取出细胞之前，针的薄部分内的介质表面应通过立体显微镜可见，从而直接反馈所应用的流量。
将针尖接触宿主细胞。
囊胚细胞可以从任何位置取出，但必须小心靠近卵黄细胞的细胞，以避免吸吮卵黄。
在我们的设置中，我们使用最接近胚胎动物极的细胞；然而，当摄取外周区域的细胞时也观察到嵌合体。
施加负压以吸收细胞
根据移植实验的设置，您可以从供体中取出一个或最多一百个细胞。
当达到所需的细胞数时，对注射器施加温和的反作用力以停止流动。
从供体囊胚中取出针头并将其移至宿主囊胚。
将针头放在宿主的所需位置，并通过小心施加正压释放细胞。
细胞在宿主中的位置会影响供体细胞将贡献于哪些器官。一般而言，中央位置的细胞将被纳入前脑和视网膜等前部结构。
将针移至以下宿主并重复该过程，直到完成供体细胞。
一个囊胚可以作为多个宿主的供体，移植的细胞数量可以根据实验条件进行调整。具有多达约 150 个供体细胞的移植胚胎可以存活；然而，我们通常最多移植 50 个细胞。
在前往下一个供体囊胚之前清洁您的针头。
允许培养基进出针头以去除剩余的细胞。
避免移植盘中出现气泡；这会损坏囊胚。
根据需要对尽可能多的供体囊胚重复此过程。
移植完成后，从移植板上取出所有死亡和未移植的囊胚。

图1 1 。青鳉与斑马鱼卵裂球移植

3.移植胚胎的饲养
将移植的胚胎在移植板中保持在 28°C 过夜。
对于 Medrafish（斑马鱼宿主）
第二天将存活的胚胎转移到新鲜的培养皿中，并在当天下午再次更换斑马鱼培养基。
每天更换培养基并去除死胚胎。我们将胚胎保留到发育的第 5 天。
对于 Zebraka (medaka 主机)
使用细胞保护器提示将存活的胚胎单独放置在 1.5 ml ERM 中的涂层 24 孔板（琼脂糖 1.5%）中。或者，胚胎可以保存在玻璃培养皿（直径 2 厘米）或不同大小的多孔培养皿中。
每天更换 ½ 培养基，避免前 3 天的机械扰动。我们将胚胎保留到发育的第 9 天。

笔记

鱼的维护和交配
1.青鳉和斑马鱼均在 28°C 下保持 14 小时 - 10 小时夜间循环。
2.鳉养殖群：
每个繁殖组由一只雄性和两到三只雌性组成。
鱼养在同一个缸里；求爱行为从第一盏灯开始（上午 8:00 在我们的鱼室）。
每天从每个雌性收集胚胎。
3、斑马鱼养殖群：
每个繁殖组由五只雄性和五只雌性组成。
十字架的早晨不喂鱼。
每周最多使用一次繁殖组。

温度
1.鳉胚胎耐受高温范围；在我们手中，移植前 32°C 的温度（从 2 到 512 个细胞阶段）最能加速发育，而不会产生长期后果。较高的温度会导致发霉并增加蒸发，但在相应的设置中仍然可能。
2.斑马鱼仅能耐受较窄的温度范围，但胚胎在室温（~23°C）下正常发育，这会延迟发育足以在囊胚阶段与青鳉同步。

去除绒毛膜胚胎的处理
1.孵化的胚胎比完整的胚胎更脆弱。在原肠胚形成完成之前必须特别小心，因为蛋黄不会与塑料接触。
2.由于卵黄细胞较大，鳉胚胎比斑马鱼胚胎更脆弱。机械扰动，例如由水运动引起的扰动，足以导致蛋黄破裂并导致相应胚胎的死亡。特别是在移植后的前两天，胚胎应尽可能少受到干扰。
3. 去绒毛膜胚胎似乎对其周围环境的化学性质更敏感。这意味着在处理鱼培养基时必须格外小心，并且应从培养皿中取出死胚胎。
4.如果只有少数斑马鱼胚胎可用，请在立体显微镜下用细镊子（Dupont 55）将它们脱毛（Sk ip step A2c ）。如果选择正确，手动去绒毛比化学处理更温和，可以提高胚胎的存活率，但更耗时。您不能用镊子孵化青鳉胚胎，因为绒毛膜非常僵硬，尝试会损坏您的胚胎。但是，可以使用镊子在 HE 不完全孵化后取出部分打开的绒毛膜。

成像
1.每次转移到显微镜都会引起机械应变，从而降低成活率，应谨慎操作。
2.安装胚胎进行实时成像如下：
对于立体显微镜中的一般观察和成像，转移到 3% 甲基纤维素（在鱼培养基中）。
对于共聚焦实时成像，安装在 0.6% 的低熔点琼脂糖溶液中（安装前应 <40°C）。这优于甲基纤维素，因为甲基纤维素会产生荧光背景信号。
3.一旦胚胎开始移动，在相应培养基中用1 × (1 mg/ml) 三卡因麻醉去绒毛膜活胚胎（Neiffer等人，2009 年；Lischik等人，2019 年）。
4.在发育的所有阶段，如果供体有荧光标记，我们会使用荧光立体显微镜检查胚胎。这允许：
选择成功移植的胚胎。
报告大多数供体细胞的位置。
跟踪较大结构（例如神经元）的生长动态。
5.使用共焦（实时）成像，例如：
发现供体细胞的较小克隆。
识别细胞和亚细胞行为。
可视化捐助者 - 宿主相互作用。
6.脱毛斑马鱼胚胎早期在活体成像中存活；青鳉胚胎更敏感，在较老的阶段存活得更好。

食谱

青鳉胚胎培养培养基（10× ERM）
170 毫米氯化钠
4 毫米氯化钾
2.7 mM CaCl 2 ∙H 2 O
6.6 mM MgSO 4 ∙7H 2 O
170 mM HEPES
用去离子水填充至 10 L。
斑马鱼培养基
3 克红海盐在 100 毫升去离子水中
20× 三卡因
2 g 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸乙酯
5 g Na 2 HPO 4 ∙2H 2 O 在 500 ml 去离子水中
调节 pH 值 7.0-7.5

致谢

我们感谢 Centanin 小组的所有成员对本协议的重要投入以及他们帮助收集图片。我们感谢 Jochen Wittbrodt 分享仪器，感谢 A. Saraceno、E. Leist 和 M. Majewski 进行鱼类维护，以及 C. Loosli 准备孵化酶。Centanin 实验室的工作由 DFG 通过 SFB873 项目 A11 提供支持。此协议是一个扩展的适应的从了Fuhrmann等人。(2020)。

竞争利益

作者声明没有竞争利益。

参考

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2. Centanin, L.、Hoeckendorf, B. 和 Wittbrodt, J. (2011)。视网膜干细胞的命运限制和多能性。细胞干细胞9：553-562。
3. Neiffer, DL 和 Stamper, MA (2009)。鱼类镇静、镇痛、麻醉和安乐死：药物的注意事项、方法和类型。ILARĴ 。50：343-360。
4. Haas, P. 和 Gilmour, D. (2006)。趋化因子信号介导斑马鱼侧线的自组织组织迁移。开发单元10：673-680。
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7. Kretzschmar, K. 和 Watt, F. M. (2012)。血统追踪。单元格148：33-45。
8. Le Douarin, N. M. (1993)。胚胎神经嵌合体在大脑发育研究中的应用。趋势 Neurosci 16：64-72。
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10. Lischik, C. Q.、Adelmann, L. 和 Wittbrodt, J. (2019)。通过优化麻醉、荧光蛋白选择和色素沉着去除，增强了青鳉体内成像。PLoS O ne 14(3): e0212956。
11. Furutani-Seiki, M. 和 Wittbrodt, J. (2004)。Medaka 和斑马鱼，进化双胞胎研究。机械开发121：629-637。
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15. Fuhrmann, J. F., Buono, L., Adelmann, L., Martinez-Morales, J. R.和Centanin, L. (2020)。鱼类种间移植揭示的遗传发育时间。开发147(22):dev192500。

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