材料和试剂

20、200和 1,000 μl移液器吸头（无特定品牌）
Thermo Scientific TM螺帽微管（2.0 ml）（Fisher Scientific，目录号：21-403-202）
3 ml注射器（BD Biosciences，目录号：309657）
18 G 1.5 针（BD Biosciences，目录号：305196）
21 G 1.5 针（BD Biosciences，目录号：305167）
50 ml锥形管（Crystalgen，目录号：23-2263）
12 × 75 mm（5 ml）圆底聚苯乙烯管（Corning，目录号：352052）
培养皿（Falcon，目录号：351029）
铝箔
分散粉（Gibco，目录号：17105041）
ChAT的BAC -eGFP小鼠（B6.Cg-TG（RP23-268L19-EGFP）2Mik / J）（杰克逊实验室，目录号：7902）
200 Proof Ethanol（Koptec，目录号：V1001）
DNase I（Sigma，目录号：10104159001）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Boston BioProducts，目录号：BSS-220DM-C）
DMEM/F-12（Dulbecco's Modified Eagle 培养基/营养混合物 F-12）（ThermoFisher Scientific，目录号：11320033）
热灭活胎牛血清（FBS）（ThermoFisher Scientific，目录号：10082139）
Tyrode 溶液（含碳酸氢盐、HEPES和0.25% BSA，不含钙）（Boston BioProducts，目录号：PY-912）
来自木瓜乳胶的木瓜蛋白酶（Sigma，目录号：P3125）
L-半胱氨酸（Sigma，目录号：C7352）
Tyrode 溶液（含 HEPES和钙）（Boston BioProducts，目录号：BSS-355）
亮肽素三氟乙酸盐（亮肽素）（Sigma，目录号：L2023）
HBSS，1 ×不含钙、镁和酚红（Hank's Balanced Salt Solution）（Corning，目录号：21-022-CV）
EDTA (0.5 M)，pH 8.0。无RNase（Thermo Fisher，目录号：AM9260G）
TruStain FCX TM （抗小鼠CD16 / 32）一个ntibody（Biolegend公司，目录号：101320）
Pacific Blue抗小鼠CD45单克隆抗体（Biolegend，目录号：103126）
别藻蓝蛋白（APC）抗小鼠CD326（EpCAM）单克隆抗体（Biolegend，目录号：118214）
碘化丙啶（PI）（Sigma，目录号：P4170）
70% 乙醇（500 毫升）（见食谱）
分散溶液（见配方）
基于 DMEM 的停止解决方案（参见食谱）
含有木瓜蛋白酶的 Tyrode 缓冲液消化溶液（参见食谱）
基于 Tyrode 缓冲液的停止溶液（见配方）
FACS 缓冲液（流式细胞术洗涤缓冲液）（见配方）

设备

解剖剪刀（直）（Fisher Scientific，目录号：08-951-5）
镊子（直，锯齿）（Fisher Scientific，目录号：13-812-36）
移液器（P10、P200、P1000）（无特定品牌）
Fisherbrand TM Isotemp TM通用豪华水浴锅（Fisher Scientific，目录号：FSGPD05）
Fisherbrand TM Multiplatform Shaker（Fisher Scientific，目录号：88-861-021）
解剖显微镜（Leica，目录号：M165FC）
手术刀（No.10）（ThermoFisher Scientific，目录号：3120032）
Fisher Vortex Genie 2（Fisher Scientific，目录号：12-812）
100 μM Fisherbrand TM无菌细胞过滤器（Fisher Scientific，目录号：22-363-549）
Sorvall Legend X1R Centrifuge（ThermoFisher Scientific，目录号：75004261 ）
BD LSRFortessa TM流式细胞仪（BD Biosciences ）

软件

FlowJo v.8 (FlowJo, LLC, https://www.www.flowjo.com )
Prism 7（GraphPad 软件，https ://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

小鼠口鼻部的分离
使用的小鼠：ChAT(BAC)-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)，3-6 月龄男女。所有动物护理和程序均经布莱根妇女医院动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。
安乐死老鼠。用 70% EtOH 将皮毛喷在腹部（见配方 1）。用直剪刀做一个中线腹部切口, 打开腹腔, 通过腹主动脉穿刺给小鼠放血。允许鼠标流血 1-2 分钟，以便血液从头部流出，避免/最大限度地减少进一步裂解红细胞的必要性。
通过切断下颌骨并将头部与身体的其余部分分开来斩首鼠标。
使用直剪刀，切断鼻尖和前门牙。去除头部的皮肤并从周围的肌肉和脑组织中释放头骨。
切断颧弓 (图 1A )。取出顶骨。使纵向切口沿着额骨，从顶部（暴露鼻腔图小号1A-1C ）。

图 1. 用分散酶溶液进行第一次消化的鼻部准备的代表性图像。一个。小鼠头部，从周围组织和大脑中释放出来。双侧颧弓需要去除（黑线）。红色虚线代表沿额骨进一步切开的纵向线。乙。沿额骨纵向切口。Ç 。额骨和鼻骨抬起，鼻腔顶部暴露。d 。将鼻子放入装有预热分散酶溶液的 2 毫升管中。

鼻上皮细胞分离
预暖750微升的分散酶溶液（见配方2）在37℃水浴中在2ml管5-10分钟。将隔离的鼻子放入溶液中（图 1D ），并在室温下以 100 rpm 的速度在振荡器上孵育 30 分钟。用铝箔盖使管子避光。
加入 750 µl 的基于 DMEM 的冷终止液减少消化（参见配方 3）。将管子放在冰上 2-5 分钟。
从管中取出消化的鼻子，放在解剖显微镜下的培养皿上，上颚朝下。
去除构成鼻腔上壁的鼻骨。现在，您可以看到覆盖有粘膜的鼻腔（图 2A ）。通过沿上颚的纵向切口将鼻腔分成左右两半（图 2B ）。

图 2. 从孤立的鼻子鼻黏膜制备的单细胞制剂的代表性图像。一个。鼻腔侧壁示意图，红色表示鼻粘膜覆盖。乙。鼻腔在培养皿上分成左右两半。在解剖显微镜下用手术刀刮掉粘膜。红色轮廓代表要隔离的鼻粘膜区域。Ç 。将刮下的粘膜转移到 2 ml 管中。d 。用 750 µl基于Tyrode 缓冲液的消化液和木瓜蛋白酶冲洗培养皿。乙。停止消化并涡旋样品后，悬浮液用 18 号针头研磨 8-10 次，然后用 21 号针头研磨 15-20 次。˚F 。细胞悬液通过 100 µm 过滤器过滤到 50 ml 锥形管中。

用手术刀刮鼻粘膜，直到在解剖显微镜下除骨头外没有组织可见。将分离的粘膜与小的底层骨骼和软骨转移到 2 ml 管中（图 2C ）。
用 750 µl含有木瓜蛋白酶的Tyrode 缓冲液消化液冲洗培养皿（参见配方 4），并将冲洗过的液体转移到含有鼻粘膜的管中（图 2D ）。
将分离的鼻粘膜在基于 Tyrode 的消化缓冲液中在 37°C 下孵育 40 分钟，以 210 rpm 的速度摇晃。
以 300 rpm 的速度涡旋消化的组织 10 秒。通过添加冷的 Tyrode 缓冲液终止溶液（参见配方 5）并将样品置于冰上来终止消化。
涡流组织在1 ，000rpm下20秒。用连接到 18 号针头的注射器研磨溶液 8-10 次。去除剩余的骨头和软骨，以避免堵塞注射器。将注射器上的针头换成 21 号针头，再研磨 15-20 次（图 2E ）。
将悬浮液通过 100 µm 过滤器放入 50 ml 锥形管中（图 2F ）。添加 20-25 ml 冷 FACS 缓冲液（参见配方 6）。
在 4°C 下以 350 × g旋转管子15 分钟。检查管中是否有可见颗粒。在不干扰细胞沉淀的情况下丢弃上清液，将沉淀重悬在 1 ml FACS 缓冲液中，然后转移到 5 ml 聚苯乙烯管中。用 4 ml 的 FACS 缓冲液填充聚苯乙烯管。
在 4°C 下以 350 × g旋转管子10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬在 100 µl FACS 缓冲液中。
要阻断 Fc 受体，请使用 TruStain FcX TM （抗小鼠 CD16/32）抗体预孵育细胞悬液；在 100 µl 体积中，每 10 6 个细胞使用 1.0 µg 抗体，在冰上放置 5-10 分钟。此步骤后无需洗涤。
在冰上用抗体孵育细胞 45 分钟，避光。用于刷细胞鉴定的抗体组包括每100 µl 体积中每 10 6 个细胞0.25 µg 的太平洋蓝抗小鼠 CD45 单克隆抗体和每100 µl 体积中每 10 6 个细胞0.5 µg 的别藻蓝蛋白 (APC) 抗小鼠 EpCAM 单克隆抗体体积。
通过用 1 ml FACS 缓冲液重新悬浮m 来清洗细胞，并添加额外的 3.8-4 ml 冷 FACS 缓冲液。在 4°C 下以 350 × g旋转10 分钟。丢弃上清液，将沉淀重悬在 300 µl 冷 FACS 缓冲液中。
如果不打算在 FACS 机器上运行整个样本，请执行手动细胞计数。如果在机器上收集整个样本，则可以省略计数步骤。
在 FACS 前加入碘化丙啶 (PI) 5 µg/ml 以维持 2-3 分钟的活力。

数据分析

在使用此两步协议（见图形摘要）分离鼻粘膜和消化后，用 EpCAM 和 CD45标记细胞悬浮液。细胞是通过FSC-A / SSC-A选通以排除碎片和通过SSC-H / SSC-W和FSC-H / SSC-W来选择单个细胞（图3A ）。碘化丙啶（PI）被使用作为一个死细胞排除标记。用这种方法可以获得从 1.2 × 10 6到 3.1 × 10 6 的活细胞（图 3B ）。在我们的分析中，CD45低/阴性和 EpCAM高细胞占所有活细胞的 14-18%。刷细胞被定义为 EpCAM high和GFP +细胞，占 EpCAM high群体的14-24%和所有活细胞的 1.3%。这种方法允许每只小鼠分离 16,000-30,000 个 GFP +刷细胞。鼻刷细胞可以根据它们的大小进一步细分为 SSC低和 SSC高群体，分别代表微绒毛细胞和孤立的化学感应细胞。SSC低占大多数 GFP +细胞 (94%)，而 SSC高细胞占刷状细胞的 4%。

图 3. 鼻刷细胞的流式细胞术分析。细胞悬液用针对 EpCAM 和 CD45 的荧光偶联抗体染色，并通过流式细胞术检查。门控策略之前已发布（Ualiyeva等人，2020 年）。A.代表性流式细胞术门控策略。根据前向和侧向散射特征的大小和粒度对细胞进行门控。进一步排除双联体，并根据没有碘化丙啶染色来选择活细胞。CD45低/阴性根据它们的 EpCAM 表达进行评估。刷细胞被定义为 EpCAM高GFP +细胞，并在前向散射和侧向散射特征上进一步指定。SSC高群代表孤立的化学感应细胞，SSC低刷细胞对应于微绒毛细胞。B. C57BL6 小鼠细胞悬液的流式细胞术分析。将样品预选通单活细胞，和CD45低/负对他们的EpCAM表达细胞进行了评价。Ç 。从鼻粘膜中回收的活细胞数量和EpCAM高上皮细胞的频率，以活细胞的百分比表示。D.鼻刷细胞的频率表示为活细胞百分比、EpCAM高种群百分比和每个小鼠鼻子的鼻刷细胞数量。乙。˚F SSC的requency高（孤化学感受细胞）和SSC低（微绒毛细胞）群体，因为所有的EpCAM％的高GFP +细胞计数和。每个点代表一个单独的鼠标。数据来自 3 个独立的实验，每个实验有 2 只小鼠。

该协议已成功应用于分离鼻刷细胞以进行 RNA 测序和功能测定（Ualiyeva等，2020）。

食谱

70% 乙醇（500 毫升）
350 毫升 200 标准纯乙醇
150 毫升蒸馏水 H 2 O
搅拌均匀
该溶液易燃。
分散溶液，在分离前准备新鲜
16 U/ml 分散粉末
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
蒸馏水 H 2 O
20 微克/毫升 DNase I
准备 1 × PBS
将 16 U/ml 分散酶粉末和 20 μg/ml DNase I 溶解在 1 × PBS 中
将溶液存放在 4℃。在添加鼻子之前在水浴中预热至37°C 。
基于DMEM的终止液（DMEM，5％FBS）（525毫升）中（可被存储为在4长达2个月℃下）
500 ml Dulbecco's Modified Eagle 培养基/营养混合物 F-12 (DMEM)
25 ml 热灭活胎牛血清 (FBS)
在无菌生物安全柜中制备溶液并储存在 4 °C
含有木瓜蛋白酶的 Tyrode 缓冲液消化溶液（分离前准备新鲜）
Tyrode 溶液（含碳酸氢盐、HEPES和0.25% BSA，不含钙）
20 μl/ml 木瓜蛋白酶 (28 U/mg)
10 微升/毫升 L-半胱氨酸 (25 毫克/毫升)
在无菌生物安全柜中制备溶液并储存在 4 °C
基于 Tyrode 缓冲液的终止液，在分离前准备新鲜
Tyrode 溶液（含 HEPES和钙）
2 μl/ml 亮抑酶肽 (5 mg/ml)
FACS 缓冲液（用于流式细胞术的洗涤缓冲液），可在 4°C 下储存长达 1 个月
HBSS，1 ×不含钙、镁和酚红（汉克平衡盐溶液）
2% 热灭活胎牛血清 (FBS)
2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA，0.5 M，pH 8.0）
在无菌生物安全柜中制备溶液并储存在 4 °C

致谢

这个协议是适于与微小修改小号从一个发表先前的研究Ualiyeva等。(2020) 。该方法基于我们实验室使用的先前的气管刷细胞分离方案（Ualiyeva等，2019）。我们感谢布莱根妇女人类免疫学中心 Flow Core 的 Adam Chicoine 在流式细胞仪分选方面提供的帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院 R01 HL120952 (NAB)、R01 AI134989 (NAB)、U19 AI095219 (NAB、LGB)、K08 AI132723 (LGB) 和 T32 AI00730634 (SU) 以及美国过敏学会的支持、哮喘和免疫学 (AAAAI)/美国肺过敏性呼吸系统疾病奖 (NAB)，由 AAAAI 基金会教师发展奖 (LGB) 授予，Steven 和 Judy Kaye 青年创新奖 (NAB)，由 Joycelyn C. Austen 基金授予女性医师科学家 (LGB) 的职业发展，以及 Vinik 家族 (LGB) 的慷慨捐赠。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

在动物研究中进行的所有程序均由布莱根妇女医院 IACUC 协议 2016N000517 指导。

参考

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