材料和试剂

1. 10，20，和1 ，000微升移液管头（USA Scientific公司TipOne，目录号小号：1111-3800,1120-1810，和1111年至2820年）
2. 1.5 ml 管（Eppendorf，目录号：022363204）
3. 50 ml锥形管（Corning，目录号：352070）
4.凝胶加载提示（USA Scientific，目录号：1022-0000）
5.培养吨UBE（Fisher Scientific公司，目录号：14-961-31）
6. 10 ml注射器（BD，目录号：309604）
7. 0.22 μm注射器过滤器（Fisher Scientific，目录号：09-720-3）
8. Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白质凝胶，Tris-甘氨酸，8-16%（Bio-Rad Laboratories，目录号：4561106）
9. 4 × Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610747）
10. 10 × Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610732）
11. MIG（或 sfGFP）表达菌株（可根据要求提供）
12.的Tris，1.0M缓冲溶液，pH 7.5，0.2 - μ米过滤（阿法埃莎，目录号：J62993）
13.的Tris，1.0M缓冲溶液，pH 8.5，0.2 - μ米过滤（阿法埃莎，目录号：J61038）
14.甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229）
15.二水醋酸锌（Fisher Scientific，目录号：S25634）
16. LB肉汤基料（Difco，目录号：244610）
17. IPTG（Goldbio，目录号：12481C25）
18.氯霉素（Sigma，目录号：C0378）
19. MIG 缓冲液（参见配方）
20. 1 × Tris/甘氨酸/SDS 运行缓冲液（见配方）
21. 1 M 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（见食谱）
22. 25 mg/ml 氯霉素储备液（即. , 1 , 000 × ，参见配方）
23. LB 培养基（见配方）
24. 10 mM 醋酸锌溶液（见配方）

设备

细胞超声仪（加热系统，型号：XL-2020）
FB300电源（Fisher Scientific，目录号：S65533Q）
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels，4-gel（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658004）
Amersham Imager 600 （GE，目录号：29-0834-61）
P20 Pipetman（吉尔森，目录号：FA10003M）
P1000 Pipetman（吉尔森，目录号：FA10006M）
微量离心机（Eppendorf，目录号：5420000113）
离心机（Fisher Scientific，目录号：75005194）
台式冷冻摇晃我ncubator（Thermo Scientific的，目录号：SHKE4000）
软件

ImageJ（可在https://imagej.nih.gov免费下载的软件）

程序

蛋白EXP ression （图3）
在无菌条件下，通过接种含有 5 ml LB 培养基和 5 μl 25 mg/ml (1 , 000 × )氯霉素原液的培养管，制备MIG（或 sfGFP）表达菌株的饱和过夜培养物。
在 37°C 和 250 RPM 下孵育约 16 小时。
在无菌条件下，将 1 ml 过夜培养物稀释到 50 ml LB 培养基和 50 μl 25 mg/ml (1 , 000 × )氯霉素储备液中。
在 37°C 和 250 RPM 下孵育 90 分钟。
在无菌条件下，添加 50 μl 1 M IPTG（终浓度为 1 mM IPTG）。
在 37°C 和 250 RPM 下孵育 60 分钟。

图 3. 蛋白质表达的步骤。使用 Biorender 生成的图像。

细胞裂解（图 4）
转移到 50 ml 锥形管中。
在室温 (~22°C) 下以 4,000 × g离心 10 分钟以形成颗粒。
在不干扰沉淀的情况下丢弃上清液。
重悬沉淀在1ml MIG b uffer 。
在冰上超声 (35% 强度) 10 秒，然后 10 秒关闭 2 分钟。
将裂解的细胞转移到 1.5 ml 管中。
在 4°C 和 16,000 × g下旋转10 分钟。
在不干扰沉淀的情况下，将上清液转移到 1.5 ml 管中并置于冰上。

图 4. 细胞裂解步骤。使用 Biorender 生成的图像。

蛋白质小号plicing
将 45 μl 上清液移入 1.5 ml 管中，加入 15 μl 4 × Laemmli 染料并混合，置于 -20°C 。
注意：这是时间点 0 。
将 495 μl上清液和 5 μl ddH 2 O 移入 1.5 ml 管中，并在室温（~21°C）下在箔下孵育。
在另一个 1.5 ml 管中，移取 99 μl 上清液和 1 μl 10 mM 醋酸锌二水合物，并在室温（~21°C）下在箔下孵育。
在 1、2、4、8 和 24 小时时间点，从不含二水醋酸锌的管中取 45 μl 移液管放入新的 1.5 ml 管中，加入 15 μl 4 × Laemmli 染料并混合，置于 -20 ℃ 。
注：牛逼，他率蛋白质剪接的变化很大取决于内含肽和孵化条件。相应地调整时间点。这些条件适用于耻垢分枝杆菌 DnaBi1 intein。
在 24 小时的时间点，从管中取 45 μl上清液和二水醋酸锌，移入新的 1.5 ml 管中，加入 15 μl 4 × Laemmli 染料并混合，置于 -20°C 。

Tris-甘氨酸SDS-PAGE
在室温下解冻样品。
不要在电泳前加热样品。
注意：加热会使 sfGFP 变性并导致荧光信号丢失（图 2）。
向电泳槽中加入1 ×运行缓冲液。
插入Tris-甘氨酸凝胶成的电泳凝胶保持器和附加凝胶保持器罐。
在电泳凝胶架内加入 1 ×运行缓冲液以覆盖凝胶孔。
加载 4 μl 梯子和 6 μl 每个样品。
将水箱连接到电源并在 200 V 下运行凝胶 40 分钟。
从塑料壳中取出凝胶并放入 ddH 2 O 中。

图像凝胶
使用Amersham公司600成像仪测量凝胶内荧光，或Ë能够检测的sfGFP荧光quivalent成像器（图5）。
将凝胶平放在成像托盘上。
将托盘放入成像仪。
将成像仪设置为 Epi-RGB: Blue light ( 460 nm, Filter Cy2) 。
小号等曝光自动具有高动态范围 .
将凝胶保存为 tiff 或 jpeg。可以使用 ImageJ 通过光密度测定法计算相对荧光。

图 5.使用凝胶内荧光和 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE监测耻垢分枝杆菌DnaBi1 内含肽的蛋白质剪接。存在 100μ M 醋酸锌抑制剪接。左图，考马斯染色。对，sfGFP 信号。sfGFP 标记的产品表示前体 (P)；连接的外显子 (LE); 内含肽-C-外显肽（IC）。

食谱

MIG 缓冲器
2.5 ml Tris，1.0 M 缓冲溶液，pH 7.5，0.2 μm过滤
2.5 ml Tris，1.0 M 缓冲溶液，pH 8.5，0.2 μm 过滤
10 毫升甘油
85 ml 超纯 H 2 O
1 ×的Tris /甘氨酸/ SDS ř unning b uffe R（25毫摩尔Tris，pH值8.3，0.1％SDS，192 mM的甘氨酸）
100 ml 10 × Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液
900 ml 超纯 H 2 O
的10mM ž INC一个cetate
109 毫克醋酸锌二水合物
50 毫升超纯 H 2 O
LB培养基
25 克 LB 肉汤底料
1 , 000 ml ddH 2 O
高压灭菌
1 M 异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)
2.38 克 IPTG
10 ml 超纯 H 2 O
发生在10 -毫升注射器和穿过0.22 - μ米过滤器进行灭菌
等分试样在1.5 -毫升管中并储存在-20 ℃下
25毫克/毫升ç ħ loramphenicol原液
250毫克Ç hloramphenicol
10 毫升 100% 乙醇
发生在10 -毫升注射器和PA SS通过0.22 - μ米过滤器进行灭菌
等分试样在1.5 -毫升管中并储存在-20 ℃下

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院授予 CWL 的 P20GM103436 和 Marlene Belfort 的 GM44844 的支持。该协议是基于我们前面在姆比奥出版物（伍兹等人，2020年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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