材料和试剂

1.锥形离心管（50 ml）（GeneBrick，目录号：GP0-7500）
2.微量离心管（1.5 ml）（BBI，目录号：F600620-0001）
3.无针注射器小号（1ml）中
4.塑料P ETRI培养皿（直径90mm）
5.移液器吸头（AIBIO，目录号：T1040000）
6.纸巾
7.软木钻孔机（Integra Miltex，型号：33-34-P/25 ）
8. （可选）Sprial计数网格（90毫米直径）（INTERSCIENCE，ê asysprial ® ，目录号：413014 ）
9.金属珠
10.分光光度计塑料比色皿（BRAND，目录号：759015）
11.注射器过滤小号（0.45微米）（的Millex，的Millex ® -HV，目录号：SLHV033RB）
12.蒸馏无菌水
13. 75％的乙醇（国药化学试剂，SCR ® ，目录号：801769610 ）
14.氯化三苯基四唑鎓（TTC）（Sigma-Aldrich，目录号：T8877-5G）
15.葡萄糖（国药化学试剂，SCR ® ，目录号：63005518 ）
16. Bacto蛋白胨（BD ，目录号：211677）
17.酵母提取物（OXOID，目录号：LP0021）
18.酪蛋白ħ ydrolysate（酪蛋白氨基酸）（Sigma-Aldrich公司，目录号：22090-500G）
19.琼脂（国药化学试剂，SCR ® ，目录号：10000561 ）
20.胰蛋白胨（OXOID，目录号：LP0042）
21.氯化钠（NaCl）（国药化学试剂，SCR ® ，目录号：10019318 ）
22. 3',5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮（AS）（Sigma-Aldrich，目录号：2478-38-8）
23.六水氯化镁（MgCl 2 · 6H 2 O）（国药化学试剂，SCR ® ，目录号：10012818 ）
24.氢氧化钾（KOH）（国药化学试剂，SCR ® ，目录号：10017018 ）
25. MES游离酸一水合物（MES）（Amresco，目录号：Amresco E169）
26.二甲基亚砜（DMSO）（钻石，目录号：A100231-0500）
27.标准盆栽土（Pindstrup，目录号：1034593214）
28.四环素盐酸盐（Sangon Biotech，目录号：T0422）
29.蛭石
30.披MEDI微米（参见ř ecipes）
31. 1％（W / V）TTC溶液（见ř ecipes）
32. 20％（W / V）的葡萄糖溶液（见ř ecipes）
33.农杆菌浸润缓冲器（见ř ecipes）
34. LB培养基（参见ř ecipes）
35.四环素盐酸盐（任选的，取决于荷兰国际集团所使用的菌株的抗生素抗性）（见ř ecipes）

设备

镊子
剪刀
介质-和高-通量组织研磨器（QIAGEN ，型号：组织Lyser II ）
纳米d ROP分光光度计（Thermo Scientific的，型号：纳米滴2000C）
水蒸馏器/消毒器（Millipore，型号：Mili-Q intergral 10L）
螺旋电镀（可选）（Interscience，E asysprial ® ，目录号：412000 ）
Vortex（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：S1-0246）
（可选）酒精灯
28 °C培养皿培养箱（松下，型号：MIR-262-PC）
高压釜（SANYO，型号：MLS-3780）
流罩（洁净台）（上海尚晶，型号：CA-1390-1）
植物生长室（Percival，型号：I-36VL）
电子天平（Sartorius，型号：BSA224S）
离心机（Eppendorf，型号：离心机 5424）
pH计（Sartorius，型号：PB-10）
28 °C管式培养箱（振荡器）（Eppendorf，New Brunswick TM ，目录号：m1324-0006）

软件

Graph P ad Prism 7（Graph P ad，http://www.graphpad.com），或用于统计分析的等效程序
Microsoft Excel (Microsoft) 或等效的电子表格计算程序

程序

种植本氏烟草植物
在盆栽土和蛭石的 1:1 混合物中播种本氏烟草种子，并放置在 25 °C和 65% 相对湿度的生长室中，在 16 小时光照/8 小时黑暗光周期下，光照强度为 130 mE米-2 ·秒-1 。
转让9日龄幼苗到单独的盆中，并允许他们以成长下相同的生长条件，直到他们4-5周小号老（图1）。

图1的生长本塞姆氏烟草幼苗我Ñ土壤。红色箭头表示适合渗透的叶子。

使用根癌农杆菌（以下简称农杆菌）的瞬时表达
注：这是Li ( 2011) 中详述的标准程序。
协议的这一部分是可选的，用于在青枯菌接种之前进行瞬时基因表达或基因沉默。如果不需要此步骤中，进行到小号挠度C.
准备和高压灭菌 LB 培养基有和没有琼脂。允许用琼脂的LB培养基中，以冷却，直至瓶可以与用手直接接触（但仍是液体形式），添加适当的抗生素，然后倒在介质进入P ETRI菜肴下无菌流罩。
将携带所需质粒（见注 1 ）的农杆菌菌株划线到固体 LB 培养基上，并在 28 °C下孵育24 小时。如果需要分离细菌菌落，则孵育更长时间。
收集农杆菌直接从生物质P ETRI培养皿用无菌移液管尖端和重新悬浮在1ml缓冲液浸润。使用分光光度计稀释 10 倍并测量 OD 600 。
制备农杆菌悬浮液与OD的最终浓度600 = 0.2 -在渗透缓冲0.5。
选择4-5的完全展开的叶片-周大的烟草本塞姆氏的渗透植物（图2 ）。使用永久性记号笔，在叶子的每一半上画一个圆圈，以控制渗透区域。在叶的远轴侧，在用针的圆的中心轻轻扎（例如，从1 -毫升注射器）。
ñ OTE ：渗透时间：最好是接种青枯菌在上午获得可重复性和强大的感染导致。因此，建议渗透土壤杆菌在早晨第二离开24小时内青枯雷尔氏菌接种前用合适的时间用于异源基因表达。对于 RNAi介导的沉默，我们在农杆菌和青枯菌接种之间留出 3-9 天的时间，这取决于每个构建体的沉默效率（参见注释 1）。

图 2. 渗透步骤图示

将农杆菌悬浮液小心地渗入标记区域。
为此，将手指放在叶子的正面，将无针注射器放在背面的同一位置（避免静脉过多突出的位置）。
使用 90 °角以避免农杆菌悬浮液过度溢出，但轻轻按压叶子以避免组织损伤。
慢慢按下柱塞，直到农杆菌悬浮液开始填充植物组织，浸泡后植物组织明显变暗。含有用于基因表达/沉默的质粒的农杆菌和对照质粒可以并排渗入同一片叶子中，以避免叶间变异（见注释）。
用纸巾轻轻擦拭叶子的湿表面，并用实际渗透区域校正圆圈（如有必要）。
ñ OTE小号：
的样品/对照浸润：用于瞬时基因表达/沉默和对照菌株的不同农杆菌菌株中可以渗入每个HAL ˚F同一叶的，以避免叶到叶的变化。在这种情况下小号，细菌数目也可以被分析为一个在叶的两半的细菌生长的比率。然而，重要的是要注意，如果瞬时表达的基因/蛋白质诱导全身反应，这些也可能影响叶子的另一半。因此，应根据瞬时表达基因的具体性质进行选择。
本氏烟草叶子的渗透在干燥叶子中效果更好，没有因冷凝或与其他叶子接触而产生的水滴。一些实践建议（选择渗透面积，手的位置，在叶组织和柱塞压力等。实际实验之前），以优化叶的渗透。
将植物放回25°C 和 65% 相对湿度的生长室中，在 16 小时光照/8 小时黑暗光周期下，光照强度为 130 mE m -2 ·s -1 。

接种青枯病菌 Y45 （图 3）
选择在本氏烟草中具有致病性的青枯菌菌株（例如，Y45；[ Li, et al ., 2011 ; Sang et al. , 2020 ] ）。如果农杆菌先前已渗入植物组织，则所使用的青枯菌菌株应能耐受抗生素，以便在采样时将 Y45 从现有农杆菌中分化出来（见注 2 ）。
准备和高压灭菌 phi 培养基有和没有琼脂。让带有琼脂的phi 培养基冷却，直到可以赤手触摸瓶子（但仍为液体形式），然后加入 5 ml/L 1% TTC 储备液和 25 ml/L 20% 葡萄糖储备液。
将 Y45 划线到固体 phi 培养基上，并在 28 °C下孵育2 天。
选择粉红色菌落并使用无菌移液管尖端来接种10毫升挑披液体培养基，在50 -毫升锥形离心管中。在 28 °c的振动筛上孵育培养物过夜。
将悬浮液以 4,000 × g离心 5 分钟。去除上清液并将细菌沉淀重悬在 10 ml 无菌蒸馏水中。使用分光光度计测量 OD 600 。在蒸馏水中的悬浮液用OD 600 = 1含有约10 9 CFU /毫升（莫瑞尔等人。，2018）。
注：我ñ我们的经验，再悬浮的细菌在无菌蒸馏水（或其他解决方案，比如氯化镁2 ）不影响该青枯菌的活力或毒力。

图 3.青枯病菌接种和收集。A. 在含有 TTC 的固体 phi 培养基上生长的细菌。B.使用移液器吸头从粉红色菌落中收集细菌生物量。一个14之后C.细菌培养- ħ孵育过夜（OD 600 = 1.08）。D. 无菌蒸馏水中的细菌悬浮液（左）。

在最终所需浓度制备悬浮液Y45的，根据您的要求，通过进行使用无菌蒸馏水连续稀释。考虑在特定实验条件下测试不同剂量特定菌株毒力的可能性。在我们的条件下，我们选择了 10 5 cfu/ml 作为合适的浓度，它允许可重复的细菌复制，而不会在实验期间引起坏死症状的发展（图 4）。

图4的症状本生烟草在所指示的天用不同剂量的Y45的接种组织接种后（DPI）以青枯雷尔氏菌。上图显示正面，下图显示背面。

选择4-5的完全展开的叶片-周大的烟草本塞姆氏的渗透植物（图1）。如果农杆菌以前浸润（小号挠度乙;见注在小号关于浸润时间TEP B6 ），浸润Y45到标出的圆形，使用1 -毫升需要乐少如先前注射器执行用于农杆菌（图2）。用纸巾擦干叶子表面，去除叶子表面残留的细菌接种物，然后将接种的植物放在生长室中，直到收集样品。
注意：甲压脚提升Y45浸润，我们通常将在不同的生长室的植物在27 ℃下和75％相对湿度，因为青枯感染是在更有效的和可再现的一个较高的温度和湿度; 然而，根据这些条件下生长室的可用性，可以进行特定的测试实验以确定感染的效率和再现性。

样品采集
制备1.5 -毫升微量离心管中，并测量它们的重量用电子天平。
切接种叶用剪刀并将它们放置在一个干净的P ETRI菜含有无菌蒸馏水中。将叶子的两侧浸入水中 5 s 以清洗叶子表面, 并将叶子放在干净的纸巾上去除表面水。
收集来自各渗透区使用无菌木塞打孔器和盘转移到1.5（避免与从所述渗透步骤的潜在损害的区域）4个的叶盘（直径4毫米）-毫升微量离心管中（图5）。再次测量管子的重量。

图 5. 样本收集。A.四叶收集在1.5光盘-用4毫升管-毫米直径木塞穿孔。B. 在 1 ml 无菌水中均质的植物组织。

使用镊子将 3 个小金属珠添加到每个管中，然后加入100 μl 无菌蒸馏水。使用组织研磨机以25 次振荡/s的频率研磨植物组织2 分钟。
将900 μl 无菌蒸馏水添加到均质组织中，并使用涡流充分混合（图 5）。将 100 μl 放入 900 μl 无菌蒸馏水中，对匀浆组织进行连续稀释。请记住在每次稀释之间更换移液器吸头，以避免更高稀释度中的细菌残留。
扩散上50μl的适当稀释到固体披培养基平板含有合适的抗生素，以从现有的土壤杆菌在匀浆组织分化Y45菌落（见Ñ OTES）。看到的图6的图例镀稀释的估计在每个时间点。传播ING上到可使用手动无菌涂布器，无菌塑料珠来执行板，或无菌1.5底部- ml离心管，或使用旋转接种仪（可选的，见注）（图6）。
注意事项：
将菌落传播到平板上：电镀前用 75% 的酒精对手进行消毒，并在无菌流动罩下工作。如果在工作台上工作，可以使用酒精灯来避免污染。如果在铺开样品稀释液后板太湿，它们可以随后在流动罩下干燥以获得清晰的单菌落。
螺旋式开发平台ER ：如果有的话，螺旋电镀机可以被用来传播细菌稀释。这对于需要大量样本的大规模实验特别有用。没有显著差异我N乘手动电镀获得的结果和那些获得使用机器，如图6A和6B所示。

图 6.青枯病菌 Y45 生长。A.菌落获得ö使用相同的细菌稀释Ñ固体披培养基平板，通过手动扩频或使用螺旋电镀机。B. 使用手动涂布或螺旋电镀机比较 cfu 数。C.时间-课程的实验，以确定Y45增长。本塞姆氏叶先INOC农杆菌ulated表达GFP（作为一个在我们的实验控制蛋白）; 一天后，将 10 5 cfu/ml 的 Y45 接种物渗入相同的叶子中。如图所示，然后在用 Y45 接种后 (dpi) 1、2、3 和 4 天收集样品。计数这些数字，10 0 （未稀释）和10个-1稀释度铺板1个DPI，10 -1 ，和10个-3铺板稀释2 dpi的10 -3和10 -4稀utions铺板3 dpi的，并10 -4和10 -5稀释液接种4 dpi。

孵育所述板直立（见Ñ OTES）在28°C 2 天。计数的殖民地和处理的数据。
注：采样后青枯菌的培养：青枯菌菌落非常黏膜ID ; 因此，板应当孵育直立以避免细菌分泌物博士我p平。

数据分析

由植物鲜重计算细菌的数量，导入了在管的重量，全部重量，稀释因子，和CFU数（菌落形成单位）到Excel电子表格。计数使用螺旋镀板的菌落时，输入板的扇区。表1示出实施例的利用螺旋接种仪和手动电镀时的计算来执行。
版权所有 © 20 21作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。1
说明： logonew

表 1. 植物组织中细菌数量的计算

一种
乙
C
D
乙
F
G
H
一世
J
钾
升
1

管重/克
全重/克
鲜重/毫克
稀释

流量

部门

体积（微升）

cfu/毫升
稀释因子
cfu/g FW
日志 (cfu/g FW)
2
机器
1.0113
1.0178
6.5
2
108
1
1
108000
100
1661538462
9.220510399
3

机器
1.0185
1.0262
7.7
2
131
1
1
131000
100
1701298701
9.23078057
4
机器
0.9693
0.9771
7.8
2
133
1
1
133000
100
1705128205
9.231757038
5
机器
0.9877
0.997
9.3
2
125
1
1
125000
100
1344086022
9.128427064
6
机器
0.9773
0.9883
11
2
122
1
1
122000
100
1109090909
9.044967146
7
机器
0.9879
0.9967
8.8
2
111
1
1
111000
100
1261363636
9.100840307
8
手动的
1.0113
1.0178
6.5
3
428
满的
50
8560
1000
1316923077
9.119560408
9
手动的
1.0185
1.0262
7.7
3
623
满的
50
12460
1000
1618181818
9.209027317
10
手动的
0.9693
0.9771
7.8
3
408
满的
50
8160
1000
1046153846
9.019595556
11
手动的
0.9877
0.997
9.3
3
564
满的
50
11280
1000
1212903226
9.083826151
12
手动的
0.9773
0.9883
11
3
465
满的
50
9300
1000
845454545.5
8.927090263
13
手动的
0.9879
0.9967
8.8
3
444
满的
50
8880
1000
1009090909
9.003930294

版权所有 © 20 21作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。1
说明： logonew
计算步骤：
这些计算对应于通过手动电镀获得的 cfu 数。如果使用螺旋板进行电镀，请按照制造商的说明计算细菌数量。
1.使用公式 =(C8-B8)* 获得植物组织的鲜重 1,000并将单位从 g 更改为 mg 以进行后续计算。
2.使用公式(F8/H8)*1,000 计算细菌数(cfu/ml)，并将体积单位从μl 更改为ml。
3. Ç olumn E表示稀释系列。例如，E8 表示细菌在两次连续稀释后计数；因此，稀释系数 (J8 = 10^E8) 为 1,000。
4.将细菌数与植物鲜重相关联，重量单位可以再次从mg变为g，最终产品可以使用以下公式计算：K8 = PRODUCT(I8, 1,000, J8, 1/D8),结果为 1316923077 cfu/gFW。该值可以转换为以 10（L 行）为底的对数刻度表示。
5.输入得到的最终数据在到的Gr aphPad Prism7或用于统计分析一个类似的方案。要单独比较的结果，大跳学生牛逼-检验和展示的平均值，标准误差和p值来表示的差异有统计学意义。

笔记

农杆菌菌株的选择：我们通常使用携带 pGWB 系列（Nakagawa等，2007a ）质粒的农杆菌 GV3101 菌株在本氏烟草中表达标记蛋白。当使用GFP融合蛋白，我们使用GFP自由作为一个对照蛋白（中川等人，2007年b ）[如在图2B的桑等人。（2020 年）] 。为了进行瞬时基因沉默，我们使用带有pK7GWIWG2-II 载体的n RNAi 方法（Karimi等，2002）。基因片段靶向荷兰国际集团利用RNAi可使用不同的在线工具可以很容易地设计特定基因（https://vigs.solgenomics.net/ ; http://plantgrn.noble.org/pssRNAit/）。我们使用携带空载体的农杆菌作为阴性对照。通过执行 RNA 提取和 RT- q PCR始终验证基因过表达和沉默效率非常重要。
的选择青枯菌菌株：允许用于Y45的从现有的农杆菌在取样时间的分化，我们转化有一个PRCT衍生质粒中的Y45野生型菌株（蒙泰罗等人，2012 ）使用天然转化（Coupat等人，2008 年）。该质粒赋予对四环素的抗性；因此，我们在取样后将四环素添加到用于平板细菌的phi 培养基中。
板的制备：浇注培养基后到培养皿，保持该未覆盖板下的流罩约40分钟时使用螺旋接种仪或大约20分钟电镀时高原荷兰国际集团手动。螺旋接种仪需要将板是干燥器，以便防止不同圆从接触荷兰国际集团彼此; 另一方面，如果板更潮湿，则手工电镀更均匀。如果板太干，可以在手动电镀之前将无菌水添加到板中。
数据表示：在细菌数目（或CFU）的表示可以执行相对于所述鲜重（如在我们的协议指示的）或使用软木钻孔作为基准的大小相对于叶面积，。在后一种情况下，无需在采样前后测量试管的重量。
垃圾处理：蒸压都在这个实验中使用dispos前的材料人到避免释放青枯菌在环境。完成实验后，用 75% 的酒精清洁工作台和流罩。

食谱

Phi 介质
10 克 Bacto 蛋白胨
1 克酵母提取物
1 克酪蛋白氨基酸
加水至1升。
到prepar ë固体培养基，15g琼脂添加到1升介质和高压釜。
1% (W/V) TTC 解决方案
溶解TTC在蒸馏水中，并过滤以0.45的溶液-微米注射器式过滤器，以避免污染。
注意：将 1% TTC 溶液储存在室温或 4°C 的黑暗环境中。
20% (W/V) 葡萄糖溶液
葡萄糖应溶解在蒸馏水中并高压灭菌。将此储备溶液储存在 4°C。
农杆菌浸润缓冲液
1 M MES 100 μl
1 M 氯化镁2 100 微升
150 mM AS 10 μl
添加 9.890 毫升水至 10 毫升。
用 KOH将MES 调整到 pH 5.7 。
溶解MES和的MgCl 2在无菌水中，并用0.45微米的滤器的解决方案-微米注射器式过滤器，以避免污染。
将溶液储存在 4°C 。
将AS溶解在 DMSO 中，并将原液储存在 -20°C 。
LB培养基
10 克胰蛋白胨
5 克氯化钠
5 克酵母提取物
调节pH至7.5，用KOH，并加水至1升。
到prepar ë固体培养基，15g琼脂添加到1升介质和高压釜。
四环素（可选，取决于所用菌株的抗性）
制备的储备溶液吨etracycline盐酸盐在无菌蒸馏水（在流罩的工作），并存储（10毫克/毫升）在-20℃下。的F培养基中伊纳勒浓度应为10微克/毫升。

致谢

我们感谢魏丁对 Y45 菌株的原始捐赠，感谢刚玉对这份手稿的批判性阅读，感谢简新玉在这项工作中提供的技术和行政协助，感谢 Macho 实验室的所有成员对本协议的不断改进和帮助讨论。Macho实验室的工作得到了中国科学院战略重点研究计划（XDB27040204）、中国千人计划和上海植物胁迫生物学中心（中国科学院）的支持。

利益争夺

作者没有要声明的竞争利益。

伦理

本协议中不使用人类或动物受试者。

参考

1. Coupat, B.、Chaumeille-Dole, F., Fall, S.、Prior, P.、Simonet, P.、Nesme, X. 和 Bertolla, F. (2008)。 Ralstonia solanacearum物种复合体中的自然转化：可以转移的 DNA 的数量和大小。FEMS 微生物生态系统。66:14-24。
2. Karimi, M.、Inzé, D. 和 Depicker, A. (2002)。用于农杆菌介导的植物转化的GATEWAY TM载体。趋势植物科学7(5): 193-195。
3. Li, X. (2011)。 Nicotiana bethamiana 协议的渗透以通过农杆菌进行瞬时表达。生物协议e95。
4. Li, Z., Wu, S., Bai, X., Liu, Y., Lu, J., Liu, Y., Xiao, B., Lu, X., and Fan, L. (2011) . 烟草青枯病病原体青枯病菌基因组序列。J Bacteriol 193：6088-6089。
5. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, SV, Machado, MA, Toth, I.、Salmond, G. 和 Foster, GD (2012)。分子植物病理学中的10大植物病原菌。Mol Plant Pathol 13( 6) : 614-629。
6. Monteiro, F.、Solé, M.、van Dijk, I. 和 Valls, M.（2012 年）。用于青枯病菌启动子探测、突变互补和致病性研究的染色体插入工具箱。Mol 植物-微生物相互作用25(4): 557-568。
7. Morcillo, RJ, Zhao, A., Tamayo-Navarrete, MI, Garcia-Garrido, JM 和 Macho, AP (2020)。牛逼随后接种omato根变换青枯小号olanacearum对青枯病直白的遗传分析。J Vis Exp (157)。
8. Morel, A.、Peeters, N.、Vaileau, F.、Barberis, P.、Jiang, G.、Berthomé, R. 和 Guidot, A.（2018 年）。P兰特的致病性表型青枯雷尔氏菌菌株。分子生物学方法 1734：223-239。
9. Nakagawa, T., Kurose, T., Hino, T., Tanaka, K., Kawamukai, M., Niwa, Y., Toyooka, K., Matsuoka, K., Jinbo, T., and Kimura, T. (2007a)。开发一系列网关二元载体pGWB，实现植物转化融合基因的高效构建。J Biosci Bioeng 。104（1）：34-41。
10. Nakagawa, T., Suzuki, T., Murata, S., Nakamura, S., Hino, T., Maeo, K., Tabata, R., Kawai, T., Tanaka, K., Niwa, Y ., Watanabe, Y., Nakamura, K., Kimura, T. 和 Ishiguro, S. (2007b)。改进的网关二元载体：用于在植物转基因分析中创建融合构建体的高性能载体。Biosci Biotechnol Biochem 71(8): 2095-2100。
11. Poueymiro, M.、Cunnac, S.、Barberis, P.、Deslandes, L.、Peeters, N.、Cazale-Noel, AC、Boucher, C. 和 Genin, S. (2009)。两个III型分泌系统效应由青枯雷尔氏菌GMI1000确定烟草宿主范围的特异性。Mol 植物-微生物相互作用。22（5）：538-550。
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