材料和试剂

1.耻垢分枝杆菌mc 2 155
2. Middlebrook 7H10 琼脂（BD Biosciences，目录号：262710）
3. Middlebrook 7H9 肉汤（BD Biosciences，目录号：271310）
4.甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
5.吐温80（Sigma-Aldrich，目录号：P1754）
6.乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：51976）
7.苯甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
8. Bradford 蛋白质测定试剂盒（Beyotime，目录号：P0006）
9.硝酸钠（NaNO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S5506）
10.亚硝酸钠（NaNO 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S2252）
11.磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：255793）
12.磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
13.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）（Sigma-Aldrich，目录号：N7505）
14.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）（Sigma-Aldrich，目录号：43420）
15.甲基紫精（Sigma-Aldrich，目录号：856177）
16.黄素单核苷酸（FMN）（Sigma-Aldrich，目录号：F2253）
17.黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）（Sigma-Aldrich，目录号：F6625）
18.连二亚硫酸钠（Na 2 S 2 O 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：71699）
19.碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
20.磺胺（Sigma-Aldrich，目录号：S9251）
21. N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（NED）（Sigma-Aldrich，目录号：222488）
22. 7H10 琼脂（见食谱）
23. 7H9 培养基（见配方）
24. MPLN 培养基（见食谱）
25. 0.5M的小号裂果磷酸盐缓冲液，pH 7.5（参见食谱）
26. 0.1M的小号裂果磷酸盐缓冲液，pH 7.5（参见食谱）
27. 0.1 M PMSF（见配方）
28. 60 mM Na 2 S 2 O 4 /NaHCO 3 （见配方）
29. 1% (w/v) s ulfanilamide 溶液（见配方）
30. 0.01% (w/v) NED 溶液（见配方）

设备

移液器套件（Gilson，目录号：F167300）
高速离心机（Beckman，目录号：AVANTI JXN-26）
超声波细胞破碎仪（Beyotime，目录号：E0385）
配备脱气模式的超声波浴（Beyotime，目录号：E0439）
250 毫升和 2 升锥形烧瓶
培养皿（直径 90 毫米）
37℃培养箱
孵化器摇床
水浴
分光光度计
充满混合气体（氮气，9 5 %；氢气，5%）的厌氧室（手套箱）
注：将吸管工具包，超声波细胞破碎，和厌氧室内水浴。

软件

微软Excel

程序

M 的制备。耻垢文化
条纹中号。耻垢上冷冻培养一个7H10琼脂平板上，并培育需氧在37 ℃下进行3个d AYS直至菌落是可见的。
将单个菌落接种到 250 毫升锥形瓶中的 50 毫升 7H9 培养基中，并在 37 °C下有氧孵育16 小时，以 180 rpm振荡（过夜培养）。
通过以 3,000 × g离心10 分钟从过夜培养物中收集细胞。用无氮 MPLN 培养基和离心机如上所述洗涤沉淀物两次。将细胞重悬在50 ml MPLN培养基中作为接种培养物。
再接种10毫升接种培养到1L MPLN介质supplem在2用10mM硝酸盐ented -升锥形烧瓶中，并温育需氧条件下于37 ℃下振荡培养至晚对数期（OD 30小时600 0.8 - 1.0）。

M 的制备。smeg matis粗提物
在 4 °C 下以 5,000 × g离心10 分钟收集细胞。
用30ml洗涤细胞沉淀两次脱气的0.1M小号ö dium磷酸盐缓冲液（pH 7.5）。
转移的细胞沉淀进入厌氧室，重悬在20毫升脱气的0.1M小号补充有10％v / v甘油和1mM PMSF裂果磷酸盐缓冲液（pH 7.5）。
通过超声处理（脉冲：0.3 秒，停止：0.7 秒）在冰上破坏细胞 10 分钟，并将裂解物转移到厌氧室内的离心管中。
在厌氧室外在 4 °C 下以 16,000 × g离心1 小时。
将离心管带回厌氧室，收集上清液（细胞质部分）作为粗酶提取物。
注意：在测定过程中保持在冰上，并在 24 小时内使用。
确定的总蛋白浓度的细胞质˚F raction使用Bradford方法。

的制备将亚硝酸盐标准曲线
在去离子水中使用亚硝酸钠 (0、3、30、60、120、240 和 300 μM)制备亚硝酸盐稀释系列。
吸管0.5毫升亚硝酸盐稀释系列（试验样品）到1.5毫升试管小号。使用 0.5 ml 10 mM硝酸钠作为对照（空白样品）。
向所有管中加入 0.5 ml s ulfanilamide 溶液和 0.5 ml L NED 溶液。
通过旋转混合并在 25 °C下孵育10 分钟。
将 1 ml测定混合物转移到比色皿中。
使用分光光度计测量540 nm 处的可见吸收。
使用以下公式计算吸光度变化：Δ A 540 nm （样品）= A 540 nm （测试）- A 540 nm （空白）
绘制与亚硝酸盐浓度的标准曲线上的水平轴和吸光度变化上的垂直轴（图1）。

C:\Users\Madandan\Desktop\2003763--1861 Wei Tan 884996--合作期刊The Journal of Biological Chemistry\Figs tif\图1.tif
图 1. 亚硝酸盐标准曲线。误差棒表示三个生物学重复的平均值 ± SD (n = 3)。根据标准曲线，回归方程为 x (µM) = (y-0.0204)/0.0092，其中 x 代表亚硝酸盐浓度，y 代表Δ A 540 nm （样品）。

体外NaR 活性测定
用于制备反应混合物之前将酶测定，脱气在测定中和对所用的溶液花边在使用前厌氧室中。
移液管以下的试剂的还原硝酸盐反应（表小号1和2）进入该厌氧室内部的1.5毫升试管中：

表 1.测定NAD(P)H 依赖的 NaR 活性的测定混合物

化验样品

测试
空白的
去离子水
0.090 毫升
0.100 毫升
磷酸钠缓冲液 (0.5 M)
0.100 毫升
0.100 毫升
NaNO 3 (50 mM)
0.100 毫升
0.100 毫升
NADPH (2 mM)或 NADH (2 mM)
0.100 毫升
0.100 毫升
FMN (0.25 毫米)
0.050 毫升
0.050 毫升
时尚 (0.25 毫米)
0.050 毫升
0.050 毫升
粗酶提取物
0.010 毫升
——
步骤1：轻轻混匀，在厌氧室内30 ° C孵育10分钟
1% (w/v) s磺胺溶液
0.500 毫升
0.500 毫升
0.01% (w/v) NED 溶液
0.500 毫升
0.500 毫升
步骤2：轻轻混匀，在25孵育℃下在黑暗中厌氧室内部10分钟

表 2.用于确定甲基紫精依赖性 NaR 活性的测定混合物

化验样品

测试
空白的
去离子水
0.090 毫升
0.100 毫升
磷酸钠缓冲液 (0.5 M)
0.100 毫升
0.100 毫升
NaNO 3 (50 mM)
0.100 毫升
0.100 毫升
甲基紫精 (0.75 mM)
0.100 毫升
0.100 毫升
Na 2 S 2 O 4 /NaHCO 3 (60 mM)
0.100 毫升
0.100 毫升
粗酶提取物
0.010 毫升
——
第 1 步：轻轻混匀并在厌氧室内30 °C孵育10 分钟
步骤 2：在厌氧室外的露天环境中剧烈搅拌，直至蓝色消失，停止反应
1% (w/v) s磺胺溶液
0.500 毫升
0.500 毫升
0.01% (w/v) NED 溶液
0.500 毫升
0.500 毫升
步骤3：轻轻混匀，在25孵育℃下在黑暗中厌氧室外部10分钟
注意：加入 Na 2 S 2 O 4 /NaHCO 3 后，测定混合物变为深蓝色，表明甲基紫精被减少。

将1 ml测定混合物转移到比色皿中。
测量测试样品和空白样品在 540 nm 处的可见吸收。
使用以下等式计算NaR 比活度：

NaR比活（nmol/min/mg）=C亚硝酸盐DF/T/C酶/V酶

w ^这里，
C亚硝酸盐(µM) = [ A 540 nm (Test) - A 540 nm (Blank)-0.0204]/0.0092，测定中形成的亚硝酸盐浓度
DF：牛逼，他稀释倍数
T（分）：Ť他的反应时间用于测定硝酸盐还原
注意：10分钟的n孵育时间足以测量体外硝酸还原酶活性。
Ç酶（毫克/毫升）：Ť他的蛋白质浓度的粗酶提取
V酶（毫升）：Ť他的体积的在测定中使用粗酶提取

食谱

7H10琼脂
将19 g 7H10粉末溶解在 1 L 去离子水中
添加 4 ml 50% (v/v) 甘油和 5 ml 10% (v/v) Tween 80
在 121 °C 下高压灭菌15 分钟
7H9 中号
将 4.7 g 7H9 粉末溶解在 1 L 去离子水中
添加 4 ml 50% (v/v) 甘油和 5 ml 10% (v/v) Tween 80
在 121 °C 下高压灭菌15 分钟
无氮 MPLN 培养基( pH 6.6 )
36.7 mM KH 2 PO 4
7.7 mM 柠檬酸钠
5 mM 硫酸镁4
60 µM FeCl 3
20 µM NaMoO 4
3.4 µM 氯化钙2
3.5 µM 硫酸锌4
4 µM 硫酸铜4
2% (v/v) 甘油
0.05% (v/v) 吐温 80
在 121 °C 下高压灭菌15 分钟。
0.5M的小号裂果磷酸盐缓冲液（pH值7.5 0 ）
准备 0.5 M 的 NaH 2 PO 4和 Na 2 HPO 4溶液
混合 20% (v/v) NaH 2 PO 4和 80% (v/v) Na 2 HPO 4
将pH 值调整为 7.5
0.1M的小号裂果磷酸盐缓冲液（pH值7.5 0 ）
用去离子水以 1:5 的比例稀释 0.5 M 磷酸钠缓冲液
在室温下储存
0.1 M PMSF
将 0.174 g PMSF 溶解在10 ml 乙醇中
储存在-20 °C
60 mM Na 2 S 2 O 4 /NaHCO 3
准备 120 mM Na 2 S 2 O 4和 NaHCO 3溶液
混合 50% (v/v) Na 2 S 2 O 4和 50% (v/v) NaHCO 3
注意：准备新鲜
1% (w/v) s磺胺溶液
溶于 3 M HCl
注意：准备新鲜并储存在 4 °C的黑暗中
0.01% (w/v) NED 溶液
溶于去离子水中
注意：准备新鲜并储存在 4 °C的黑暗中

致谢

该协议改编自 Tan等人先前发表的论文。(2020)。本研究得到国家自然科学基金（31430004、31830002、81671988、91751000、91951000 to G.-PZ）、李嘉诚健康科学研究所研究单位基金（7103506 to G.-PZ）的支持和香港健康与医学研究基金 (12110622 to G.-PZ)。

利益争夺

作者宣称，他们有没有冲突小号的兴趣。

参考

Kuypers, MMM, Marchant, HK 和 Kartal, B. (2018)。微生物氮循环网络。Nat Rev Microbiol 16 (5) : 263-276。
Morozkina, EV 和 Zvyagilskaya, RA (2007)。硝酸还原酶：压力因素的结构、功能和影响。生物化学 (Mosc) 72(10) ：1151-1160。
Tan, W., Liao, TH, Wang, J., Ye, Y., Wei, YC, Zhou, HK, Xiao, Y., Zhi, XY, Shao, ZH, Lyu, LD和Zhao, GP (2020) . 最近进化的含双黄素的单体硝酸还原酶负责高效的细菌硝酸盐同化。J Biol Chem 295(15) ：5051-5066。