设备

1个Linux工作站（戴尔）运行一个大号inux下分发的Ubuntu 18.04.5 LTS（GNU / Linux的4.15.0-118泛型x86_64的） 2使用标量超级计算机（petaflop 性能）进行分子动力学模拟软件

1个PTOOLS （萨拉丁等人，2009）是一个Python / C ++库专用于操纵，组件，和大分子复合物的分析。它可以在 GitHub 存储库中免费获得，地址为https://github.com/ptools/ptools/tree/develop；它在 GNU 通用公共许可证 v3.0 下获得许可。所述Heligeom模块涉及原体，原体结合几何形状以大低聚组件的几何形状（博耶等人，2015）。Heligeom基本功能包括的分析原体在螺旋参数（图1的方面接口甲关联的螺钉的对象） –螺距 (P)、每圈单体数 (N)、旋向性，参见图 1A，右–并构建具有所需数量的原体的螺旋。螺旋线可以选择在原点与 Z 轴对齐。图1乙示出的示例的工作流PTOOLS / Heligeom常用于这项工作中使用的功能。这些包括选择功能（链，残基数目或类型，原子数目或类型的），其输出的变换矩阵的叠加功能，和mat_trans_to_screw产生螺杆对象对应功能荷兰国际集团的变换矩阵。

2 NAMD 软件（Scalable Molecular Dynamics，Mackerell等人，2004 年；Phillips等人，2005 年；http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/）用于执行能量最小化和分子动力学（ MD）模拟。 3 VMD（Humphrey等人，1996 年）是一个分子可视化程序：VMD 可以使用 3-D 图形和内置脚本来显示和分析大型生物分子系统及其 MD 轨迹https://www.ks.uiuc.edu/研究/vmd/script_library/。 NAMD 和 VMD 均由 NIH 大分子建模与生物信息学中心、伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的理论和计算生物物理学小组开发。两者都随源代码免费分发。

图 1. PTools/Heligeom。（A）大号EFT：两个蛋白质之间的螺纹变换方案小号甲和乙，用结构上相似的核心区域科雷亚和核2 ; 右图：根据螺杆参数 θ 和反式计算每转的单体数量 ( nb )、螺距和旋向性（R ：右，L ：左）。（B）Ť ypical PTOOLS OPERAT离子，使所述COMBIN的通货膨胀可用结合的几何形状。这包括创建刚体的对象。PDB文件（“进口。PDB文件...”），定义在结构上叠加的使用所述相同大小的区域select_resid_range属性（“选择的蛋白质区域”），定义垫，该转换矩阵，它叠加使用的限定的区域叠加功能（“叠加选定区域...") ，并定义与mat等效的螺旋变换hp ；在“应用变换矩阵...”下给出了如何使用螺旋对象hp根据所需的螺旋变换创建新的刚体对象的示例。

程序

一个灯丝建设 1准备积木 IA乙inding几何形状是通过对相互作用的定义RecA的从提取的单体的RecA晶体结构与PDB代码2REB（RecA的绑定到ADP分子）和3CMW（RecA的绑定到ATP和两条DNA链在站点I）。从这些结构文件中的每一个中，手动提取两个相邻的单体以定义相应的结合几何结构（具有不同结合几何结构的单体在图 2A 中进行了示意图）。在3CMW的情况下，在其中结合地理metries略微沿5不同-单体长丝，选择中央的单体（位置3和4），以避免可能的最终的效果。确保两个单体具有相同数量的残基并且结构接近（CA 原子上的 RMSD < 3 Å ）；否则，使用参考（Saladin等人，2009 年）和图 1B 中给出的命令选择结构相似的区域。从 2REB 结构中提取的单体对将表示为 R A和 R B ，而从 3CMW 、C A和 C B 中提取的单体将表示为（图 2A）。对应的新 . pdb文件应命名为RA.pdb 、RB.pdb 、CA.pdb 、CB.pdb （见注 1 ）。 IB构建块是由单体C形成甲（分别ç乙与结合的ATP / Mg）的2+被一个，两个一起，或三个结合的DNA片段。要定义作为构建块一部分的 DNA 片段，请按以下步骤操作：对于位点 I的两条链中的每一条，提取与 3CMW 结构（化学计量学）中的C A （分别为 C B ）结合的三个核苷酸的的RecA / DNA关联是3个核苷酸/单体）; 请注意，确定目标核苷酸的残基数可能需要使用VMD对 3CMW 结构进行目视检查。钢绞线在现场II是从我们发表在阳模型拍摄等。（2015）（。PDB文件是根据要求提供）：选择一个RecA的单体和所结合的DNA。然后，使用PTOOLS Ç ommands （图1B），superpo本身在RecA的单体至Ç甲（分别Ç乙），计算相关联的变换矩阵用的叠加，并且该变换矩阵应用于所述DNA区段。最后，对于每个股数，生成一个 . PDB文件，命名为CA_x.pdb其中x = 1，2 ，或3，其包含C甲单体和其相关的ATP分子，镁离子，和DNA片段（一个或多个）。 2组装积木 ia使用PTools / Heligeom （参见图 2B）通过命令行构建具有 3CMW 几何特征的 6 单体长丝段： $ ptools heligeom -n 6 -o BLOCK1.pdb -Z CA_x.pdb CB_x.pdb

IB在Python脚本到其中的PTOOLS包已经被导入，构建刚体对应于R的对象A，- [R乙，和BLOCK1（分别是RA，RB ，和BL1 ）。选择BL1 的链 A并将其存储在Rigidbody对象B1 中。选择BL1 的链 F并将其存储在Rigidbody对象B6 中。叠加RA上以RB和输出对应的变换矩阵MAT1 （图2A）。适用MAT1上至B6 ，从而产生单体B7邻接B6以下结合几何特性2REB（图2C）。叠加B1上至B7和计算变换矩阵MAT2 （图2D）; 适用MAT2上于BL1 ，从而产生一个新的6 -单体灯丝段BL2相邻BL1 ，与最后部之间的结合的几何形状BL1和的第一单元BL2是2REB类型（图2E和2F）。

图 2.复合长丝的构造。(A) 定义两种RecA-RecA绑定模式的构建块的示意图：（顶部）C A -C B类型和（底部）R A -R B类型；变换矩阵的计算MAT1 ，其涉及刚体对象RA和RB （箭头）。（B）施加的ħ eligeom命令行到积木Ç甲和C乙产生与C的接口6单元螺旋甲-C乙类型（步骤A2A）。（C）产生的Rigidb ö DY B7从B6通过施加MAT1 ; B6和B7通过RA-RB接口交互。(D)将s B1转换为B7的mat2计算。（E）施加MAT2到所述BL1块。(F)最终结果（见 A.2.b 中的文本）。PTOOLS对象名称都写在蓝色使用时和红色定义的时候。该过程在Figure2_video.mp4的随附视频中进行了说明。

3细化构建块之间的连接 a通过用来自RA的等效区域替换Rigidbody B7的 N 端结构域（一个螺旋和相关接头，残基 1 至 37）来调整界面柔性基团。为了此结束，创建一个空的刚体对象BL2_adjusted 。选择残基编号为 38 到 156、165 到 193和213 到 333 的RA （非柔性区域）的 C α原子并将它们存储在Rigidbody SRA 中。对B7执行相同的选择，存储在SB7 中；叠加SRA上至SB7和输出的变换矩阵MAT3 。选择RA的 N 端结构域，残基 1 到 37，并将选择存储在NT 中；将B7 的第38 至 333 位残基储存在CB7 中；连锁店B，C，d，E ，和F的BL2在BL2_BtoF 。将mat3应用到NT并将结果存储在NT7 中。先后串联NT7 ，CB7 ，和BL2_BtoF到BL2_adjusted ; 将BL2_adjusted连接到BL1 。以 PDB 格式输出结构，命名为FINAL_ x.pdb ，其中 x = 1, 2, 3 是 DNA 链的数量。现在已经生成了三个最终结构。 b以这样的方式处理最终结构，将 DNA 片段分组，用特定的链名标记它们，将 ATP 分子分组并更改其链名，并将蛋白质链从 A 命名为 L（图 2C，右）；用ADP替换与链 F 结合的 ATP/Mg 2+ 。这可以蟒蛇/内完成PTOOLS脚本输出之前。上一段中的pdb文件或通过处理. pdb文件使用文本编辑器。 4关闭每个文件FINAL_x.pdb 的限制最小化的 DNA 链，x = 1, 2, 3 IA使用配方1 ，大致重新定位的三核苷酸的DNA片段T3 ˚F从关联链3与单体F.此段呈现与单体ģ众多立体冲突以下在灯丝轴线取向的变化，连续到该FG界面几何形状的修改。方向的变化还导致T3 F和与单体 G 相关的链 3的 DNA 片段 T3 G之间的位点 II 连续性的重要断裂。 ib生成拓扑。使用« Automatic PSF builder » VMD 扩展的.psf文件。 ic从FINAL_x.pdb文件为 NAMD 最小化创建约束文件，方法是将« 1.00 »添加到约束原子的第 62 列（P 表示 DNA 链，CA 表示蛋白质）；给定为脚本配方2下面可以用于此端。需要修改生成的文件FINAL_x_cstr.pdb以释放位于链s F 和 G之间的连接处的磷酸原子，以实现能量最小化，其中螺旋对称性已被破坏，为此将« 1.00 »替换为« 0.00 »特定的磷酸原子（每个 DNA 链释放三个磷酸原子）。 id使用NAMD2.10执行 5000 步共轭梯度能量最小化。这使得能够CLOS的URE所述DNA骨架通过根据拓扑文件恢复共价连接的原子之间的距离和释放如果任何小空间碰撞。 B长丝模型的稳定性和演化：分子动力学模拟 1模拟准备每个文件FINAL_x.pdb , x = 1, 2, 3 ia使用 VMD 扩展 «Add Solvation Box» 将结构浸入水箱中；使用 TIP3P 水模型和10的框填充值。 ib使用 VMD 扩展名“添加离子”将 Na +和 Cl -离子添加到水箱中；选择选项«中和并设置NaCl浓度为 0.15 mol /L»。 2使用NAMD2.10对三个系统中的每一个进行仿真鉴于大尺寸的系统（约45万个原子）的，该步骤需要执行分布式计算机节点上，例如，在计算机中心。仿真遵循标准协议NAMD小号。

ia模拟条件：使用 CHARMM 27 力场，包括 CMAP 修正；使用周期性边界条件，使用粒子混乱 Ewald 方法来解释长程相互作用和范德华相互作用在 10 和 12 Å之间的平滑切换；使用 SHAKE 算法将时间步长设置为 2 fs；使用Langevin动力学方案和 Nose-Hoover Langevin活塞控制温度和压力。 IB模拟运行：执行5000个步骤的共轭梯度最小化，接着由渐进加热阶段高达300K，30纳秒长平衡相的，和一个100纳秒生产阶段。在加热和平衡过程中，对锉的 P 和 CA 原子设置约束，力常数从 0.5 减小到 0.05 kcal · mol -1 · Å -2 。在生产阶段不要使用约束。使用相同的条件对三链系统执行三个独立的模拟。数据分析

以下的分析步骤的结果可以在找到小号upplemental我载文信息（SI）的博耶等人。（2015）。

1传统的 MD 分析。使用 VMD 工具检查分子动力学模拟轨迹期间能量和温度的稳定性。通过消除水分子来减小轨迹文件的大小。绘制根均的时间演变-平方波动（RM小号F）或偏差（RMSD）的系统中，在Cα原子结合的系统的值或选择的国家和地区：整个灯丝，灯丝中心，DNA中心（博耶等人., 2015, 图 SI-7) 。Ť o每个单体的波动从第分离OSE整个灯丝的，计算的RMSD和RMSF值沿着轨迹为每个单独的RecA单体，叠加局限于此单体后; 绘制所得 RMSD 平均值的演变，采用所有单体（Boyer等人，2015 年，图 SI-7）；单独绘制对应于每个单体的 RMSF （Boyer等人，2015，图 SI-5）。使用VMD目视检查轨迹的最终结构，以选择感兴趣的原子或原子组，这些原子或原子组因界面修改而改变与其他组的接触；绘制这些距离的时间演变；计算在常规细丝相应的距离和在并入该值到积为水平线为基准（博耶等人，2015，图SI-3）。 2丝状组件的特定 MD 分析。CA在各单体的水平lculate槽入口的宽度，如在博耶描述等。（2 015 ）（材料小号和方法）; 积为每个单体的宽度值的时间演变，并然后绘制在常规长丝测定值在博耶等。（2015 年），图 SI-2 。使用PTools实用程序，计算每个非终端接口的f NAT值沿轨迹的演变，其中f NAT是在给定快照中保存的起始结构中对接触的分数（接触被定义为来自每个相互作用单体的一对残基，它们的距离小于 5 Å，并且对接触仅限于界面的非柔性区域，如上面步骤 A3a 中所定义）（Boyer等人，2015，图 SI- 6）。 3 DNA分析。DNA 链之间相互作用的演变通过两种方式进行监测：通过测量每个快照的每对链之间最短的磷酸盐 - 磷酸盐链间距离（参见 Boyer等人，2015，图 SI-9 了解详细信息）或通过计算三个碱基对之间配对距离的时间演变，使用VMD通过目视检查选择（Boye r等人，20 15，图 4）。笔记

1在 3CMW 中。PDB文件时，残基被编号为1至333的第一单体，1001至1333年，第二，2001至2333年的第三，等，这是可取的编辑文件CA.pdb和CB.pdb为了具有该范围内的残基编号的1-333。必须注意所有对. pdb文件尊重. pdb文件格式。 2在这项工作中生成的模型存放在ModelArchive https://www.modelarchive.org/ 中，代码为ma-900pk 、ma-l1kfl和ma-eaaa9 ，可在以下 URL 公开获取： https://www. modelarchive.org/doi/10.5452/ [code ] （其中[code]是ma-900pk 、ma-l1kfl或ma-eaaa9 ）。食谱

1个的T3 ˚F在步骤A4A定义三核苷酸段可以被重新定位通过按照下面的命令，其中用于链3被“P链索引，”的T3 ˚F核苷酸编号16至在5 18 “ -3 ”方向，核苷酸编号15相关联用单体E ，和核苷酸19是T3的第一个核苷酸ģ中的5 '方向。核苷酸18和19之间产生的不连续骨干下面三个点限定了脚本，O，A，和乙，其中O位于核苷酸15原子P甲上原子O3'的核苷酸19，和B关于的原子P核苷酸18. T3 ˚F将由40旋转°围绕所述轴线（O型，U ），其中u是矢量OA和OB之间的归一化互产物： $蟒蛇

>>>从ptools导入 *

>>>菲拉=刚体（ “ FINAL_3.pdb”）

>>> strP = fila.select_chain_id ("P")。create_rigid ()

>>> t3f = strP.select_res_范围（15,18）。create_rigid ()

>>>原子=( strP.select_res_range (15,15) & \

strP.select_atom_类型（“P”））。create_rigid ()

>>> O = atom.get_coords(0)

>>>原子=( strP.select_res_range (19,19) & \

strP.select_atom_类型（“O3'”））。create_rigid ()

>>> A = atom.get_coords(0) >>>原子=( strP.select_res_range (18,18) & \

strP.select_atom_类型（“P”））。create_rigid ()

>>> B = atom.get_coords(0)

>>> OA = A - O

>>> OB = B - O

>>> u = Coord3D()

>>> ux = OA.y * OB.z - OA.z * OB.y

>>> uy = OA.z * OB.x - OA.x * OB.z

>>> uz = OA.x * OB.z - OA.z * OB.x

>>> u.normalize ()

>>> newt3f =刚体（T3F）

>>> newt3f.ab_rotate ( O,O+u,40*3.14/180.)

>>> write_ pdb ( newt3f,"new_T3F.pdb")

然后可以编辑文件FINAL_3.pdb以合并new_T3F.pdb代替T3 F。

2以下大号inux下命令可用于产生用于NAMD一个约束文件为了抑制P和Ca原子的能量最小化，在加热过程中的位移，和平衡（见步骤的开始A4C）： $ awk '$3 == "P" || $3 == "CA" { \

> printf "%s 1.00%s\n" , substr ($0,1,61), substr ($ 0,67 )}; \

> 3美元！= "P" && $3 != "CA" ' FINAL_x.pdb > FINAL_x_cstr.pdb

此命令标记文件FINAL_x.pdb 的所有“ P ”和“ CA ”原子。为了最小化过程，以便能够关闭DNA骨架，从结区域磷酸盐原子必须通过替换“被释放1.00在列63”到66与“ 0.00 ”。例如，对于链 3，如果保留配方 1 中的符号，则将释放链“ P ”的15 至 20磷酸。

致谢

作者要感谢“倡议d ”卓越'的法国政府的计划提供资金[电机，ANR-11的LabX-0011-01]。原研纸从这个协议是衍生物通过博耶出版等。(2019)。我们感谢 Raquel de Miranda 协助准备描述RecA灯丝制备的视频。

利益争夺

作者声明他们已经没有竞争兴趣小号。

伦理

该协议提出这里没有使用任何人或动物受试者小号。

参考

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