材料和试剂

0.1 - 10 μl移液器吸头（BMBio ，目录号：BMT-10GXLR）
20 - 200 μl移液器吸头（BMBio ，目录号：BMT-200R）
PCR管小号（爱思进，目录号：SKPCRF）
p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t（Addgene ，目录号：43803）
p414-TEF1p-Cas9-CYC1t（Addgene ，目录号：43802）
大肠杆菌DH5α感受态细胞（NIPPON GENE，目录号：316-06233）
DNA，来自鱼精子的 MB 级（Roche Diagnostics，目录号：11467140001）
KOD plus neo（TOYOBO，目录号：KOD-401）
2mM的dNTP溶液（我与KOD加新ncluded）
的25mM硫酸镁（硫酸镁4 ）（我ncluded与KOD加新）
用于构建片段 A 的寡核苷酸引物Fw A（5'-GTTCGAAACTTCTCCGCAGT GAAAGATAAATGATCN 20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'）（由日本北海道系统科学公司合成）（N 20代表目标 PAM 序列的 20-nt 上游序列）
用于构建片段 A 的寡核苷酸引物Rv A (5'- ACTCACAAATTAGAGCTTCA -3')（由日本北海道系统科学公司合成）
用于构建片段B的寡核苷酸引物Fw B （5'-CGAACGACCGAGCGCAGCGA-3'）（由日本北海道系统科学公司合成）
寡核苷酸引物器Rv乙施工的片段B（5'- TTTATCTTTCACTGCGGAGAAGTTTCGAAC-3' ）（合成由北海道System Science，Japan）的
实施例的Taq ® DNA p olymerase（TaKaRa公司，目录号：RR001A）
10 ×实施例的Taq b uffer（镁2+加）（我ncluded具有Ex Taq酶® DNA聚合酶）
各2.5mM dNTP混合物（我ncluded具有Ex Taq酶® DNA聚合酶）
氨苄西林（Nacalai tesque ，目录号：02739-74）
二水醋酸锂（Sigma-Aldrich，目录号： L6883-250G）
聚乙二醇3,350（Sigma-Aldrich，目录号：P4338-500G）
氢氧化钠（NaOH）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：192-15985）
用于扩增CNE1区域的对照引物 1 (5'-TCACAGGGTCGATTGCAAGG-3')（在日本北海道系统科学公司合成）
用于扩增CNE1区的对照引物2 （5'-CTGGTGGTTCAGTGCCATCT-3'）（日本北海道系统科学合成）
用于检查替换的寡核苷酸引物 1（使用目标区域的 200 - 176 nt上游序列）
用于检查替换的寡核苷酸引物 2（使用目标区域的 66 - 90 nt下游反向序列）
Prime Star Max Premix 2×（TaKaRa ，目录号：R045A）
琼脂（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：010-08725）
Gene Ladder Wide 2（Nippon Gene，目录号：310-06971）
葡萄糖（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：043-31163）
不含氨基酸的酵母氮碱基（BD，Difco ，目录号：DF0919-15-3 ）
蛋白胨（BD，Bacto TM ，目录号：211677）
酵母提取物（BD，Bacto TM ，目录号：288620）
腺嘌呤盐酸盐（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，产品代码：016-00802）
合成完全 (SC) 培养基（见配方）
YPDA培养基（见食谱）

程序

设计 20 - nt gRNA 目标序列
要设计 gRNA 目标序列，必须要有合适的 PAM 序列。为了设计一个带有 PAM 序列的目标序列，用于 Cas9 切割（5'-NGG-3' 或 5'-CCN-3' 用于对向链）靠近目标区域，我们使用免费软件CRISPRdirect （https://crispr .dbcls.jp/）。对于酿酒酵母中，我们选择了酿酒酵母代表株S288C和PASて50 - 100新台币的对位于目标位点附近序列到软件中。然后，CRISPRdirect使用 PAM 序列快速输出合适的 20-nt gRNA 目标序列。

PCR片段的制备小号甲乙
我们使用 p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t 作为通用模板质粒来构建表达含有设计的 20-nt 目标序列的 gRNA 的 PCR 片段（片段 C）。它包含的酵母启动子SNR52 ，它负责在酵母细胞中表达gRNA小号。如果您想在另一个生物体中表达 gRNA，您将需要使用包含从相应生物体获得的合适启动子序列的模板质粒来制备片段 C。这里，我们解释从S 中的片段 C 表达 gRNA 的情况. 酿酒酵母宿主。在制备片段 C 之前，片段 A 和 B 必须通过第一轮 PCR 以两个独立的步骤合成。

片段A：为了制备片段A的，设计的正向引物（FW A）为包括35个核苷酸的所述从部分序列SNR52 （3启动子区，855 - 3 ，889个核苷酸）的模板质粒P426-SNR52p的-gRNA .CAN1.Y-SUP4t（全序列可在Addgene公司库，https://www.addgene.org/43803/sequences/），其次是20-nt的gRNA靶序列和进一步的23个核苷酸的所述序列编码从gRNA支架的5'部分的模板质粒（3 ，910 - 3 ，932个核苷酸（图）URE 1A）。设计反向引物序列（器Rv根据5 A），001 - 5 ，020个核苷酸的反向序列（5'-ACTCACAAATTAGAGCTTCA-3' ）的模板质粒。

片段 B：由于片段 A 不包含SNR52启动子的完整序列，并且必须拥有该完整区域才能正确表达 gRNA，因此我们需要通过片段 B将整个SNR52启动子区域与片段 A合并。因此，我们使用由 20-nt 序列 (5'-CGAACGACCGAGCGCAGCGA-3') 组成的正向引物 ( Fw B) 和由 30-nt 序列 (5'-TTTATCTTTCACTGCGGAGAAGTTTCGAAC-3') 组成的反向引物 ( Rv B)模板质粒（3 ，301 - 3 ，320个核苷酸和3 ，855 - 3 ，884个核苷酸中相反的顺序，分别地）来合成整个SNR52启动子序列如片段B（图1A）。片段 B 中最后 30 nt的互补序列与片段 A 的前 30 nt相同，以允许片段 A 和 B 在第二轮（重叠）PCR 中退火。

图 1. gRNA-TES 概述。A.在gRNA-TES，我们准备三个片段，即片段A，B ，和C，通过PCR。使用质粒 p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t (DiCarlo et al ., 2013) 作为通用模板，通过第一次 PCR 制备片段 A 和 B。接下来，使用片段 A 和 B 作为模板，通过第二次 PCR（重叠 PCR）合成用于表达 gRNA 序列的片段 C。在 gRNA-TES 中，总是需要一个新的片段 A，因为它包含 20-nt 独特的 gRNA 目标序列。20 - nt 独特的 gRNA 目标序列根据目标区域而变化。相比之下，片段 B 只是SNR52启动子区域；因此，没有必要以合成新的片段乙瓦特每次第i个不同的序列。使用该协议，不可能设计出可以放大目标序列以及整个SNR52启动子区域的引物序列，因为很难化学合成超过 100 个核苷酸的优质寡核苷酸。因此，我们不能通过单轮 PCR 扩增片段 C。B. gRNA-TES 可用于各种基因组操作，如染色体分裂、替换、删除和复制。分裂只需要一个片段 C，它传递一个 gRNA。双-链断裂（DSB）显著增加了从质粒合成的染色体上的靶序列（红色和绿色方框）以及其对应的DNA的模块之间的同源重组的频率小号p3121（杉山等和pSJ69（，2005）Easmin等人，2019 年）。因此，认为发生了高频率的分裂。两种片段C的，其中提供两个独立的gRNAs，是必要的替换，缺失，和重复。为了替换，我们使用质粒 pSJ69 ( Easmin et al ., 2019)制备了一个含有适当标记基因（此处为光滑念珠菌 LEU2、CgLEU2 ）的DNA 模块，两侧是目标同源序列。对于片段删除和复制，我们需要两个包含目标同源序列的 DNA 模块：一个应该有一个着丝粒，另一个应该包含标记基因。在我们的实验中，我们使用p3121（杉山等人。，2005）窝藏CEN4和pSJ69窝藏CgLEU2为模板合成DNA的模块。双链断裂成功后，预计会出现高频率的替换、删除和重复。图B中，染色体上的黑色圆圈表示天然着丝粒；DNA 模块上的黄色圆圈表示人工提供的CEN4 。蓝色箭头表示人工提供的端粒；灰色框代表CgLEU2 。含有黄色质粒-和灰色-着色弯曲盒分别为p3121和pSJ69。

第一轮 PCR 反应

10 × Ex Taq 缓冲液

5微升

2.5 mM dNTP 溶液

4微升

模板质粒（约 50 ng）

1微升

寡核苷酸引物 1 (15 pmol )

1.5微升

寡核苷酸引物 2 (15 pmol )

1.5微升

Ex Taq ® DNA聚合酶

0.25微升

水

36.75微升

全部的

50微升

预变性：94°C，2 分钟

变性：98°C，10 秒

退火：55°C，30 秒

延伸：68°C，2 分钟

30个周期

通过重叠 PCR制备片段 C
为了制备片段 C，将片段 A 的 100 倍稀释度 ( × 1/100) 与片段 B 的相同稀释度混合，并用作第二轮 PCR（重叠 PCR）的模板，以生成带有正向引物的片段 C ( Fw B) 5'-CGAACGACCGAGCGCAGCGA-3' 和反向引物 ( Rv A) 5'-ACTCACAAATTAGAGCTTCA-3'。

第二轮 PCR 反应

10 × Ex Taq 缓冲液

5微升

2.5 mM dNTP 溶液

4微升

模板（× 1/100 片段 A）

0.5微升

模板（× 1/100 片段 B）

0.5微升

寡核苷酸引物 1 (15 pmol )

5'-CGAACGACCGAGCGCAGCGA-3'

1.5微升

寡核苷酸引物 2 (15 pmol )

5'-ACTCACAAATTTAGAGCTTCA-3'

1.5微升

Ex Taq ® DNA聚合酶

0.25微升

水

36.75微升

全部的

50微升

预变性：94°C，2 分钟

变性：98°C，10 秒

退火：58°C，30 秒

延伸：68°C，3 分钟

30个周期

注意：我们建议使用 Ex Taq ® DNA 聚合酶进行 gRNA-TES，尤其是第二轮 PCR（重叠 PCR）。尽管我们测试了各种 DNA 聚合酶，但我们观察到这些 DNA 聚合酶经常产生多个意想不到的条带，尤其是在用于制备片段 C 的重叠 PCR 期间。

gRNA-TES 在各种基因组操作中的应用

gRNA-TES 具有多种应用，从染色体的分裂到片段替换、删除和复制（图 1B）。根据基因组工程技术，需要提供两种类型的 gRNA 的最多两种片段 C。DSB之后，分裂、替换、删除和复制的频率有望增加。

DNA模块的制备
要拆分、删除、替换或复制目标染色体区域，必须将 DNA 模块整合到 gRNA-TES 中。构建的 DNA 模块的类型取决于基因组编辑的目的（分裂、删除、替换或复制）。对于替换，只需一个 DNA 模块就足够了，而对于分裂、删除或复制，则需要两个 DNA 模块（图 1B）。对于替换，设计和购买寡核苷酸引物以扩增侧翼与对应于目标区域的第一个和最后一个 30 bp的同源序列的任何遗传标记。对于分裂和删除，设计正向引物以扩增两侧有 50 bp同源序列的着丝粒或标记基因，该同源序列对应于目标分裂和删除点的上游或下游序列。对于复制，设计正向引物以扩增标记基因或着丝粒，两侧的同源序列对应于目标区域的第一个或最后一个 50 bp。以包括用于分离，缺失所有DNA模块端粒种子序列，和重复，我们使用了常用的反向引物包括5'-CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAA-3'序列。您可以根据基因组编辑的目的使用任何模板质粒。我们使用 pSJ69（Easmin等，2019）和 p3121（Sugiyama等，2005）合成 DNA 模块。这些质粒具有相同的背景，因为它们是由相同的质粒 pUG6 构建的（Güldener等，1996），可应要求提供。用于分离，缺失或重复，有必要选择一种适当的质粒作为PCR的模板，使得新产生的染色体仅包含一个着丝粒。

PCR反应

10 × KOD 加新缓冲器

5微升

2 mM dNTP 溶液

5微升

25 mM 硫酸镁4

3微升

模板质粒

1微升

替代引物

寡核苷酸引物 1 (15 pmol )

5'-N30FGGCCGCCAGCTGAAGCTTCG-3'

1.5 μl （N30F 代表目标区域的第一个 30-bp 序列）

寡核苷酸引物 2 (15 pmol )

5'-N30LAGGCCACTAGTGGATCTGAT-3'

1.5 μl （N30L代表目标区域的最后30-bp反向序列）

分裂和删除引物

正向引物 (15 pmol )

5'-N50U/50DGGCCGCCAGCTGAAGCTTCG-3'

1.5 μl （N50U/50D代表目标区域的50-bp上游或下游（反向）序列）

反向引物 (15 pmol )

5'- CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCC CAACCCCAA AGGCCACTAGTGGATCTGAT-3'

1.5微升

复制引物

正向引物 (15 pmol )

5'-N50F/50LGGCCGCCAGCTGAAGCTTCG-3'

1.5 μl （N50F/50L 代表目标区域的第一个（反向）或最后一个 50-bp 序列）

反向引物 (15 pmol )

5'- CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCC CAACCCCAA AGGCCACTAGTGGATCTGAT-3'

1.5微升

KOD 加新

1微升

水

32微升

全部的

50微升

预变性：94°C，2分钟

变性：98°C，10 秒

退火：55°C，30 秒

30个周期

延伸：68°C，2 分钟

酵母转化
预先准备酵母菌株，例如，SJY30 ( MATα ura3-52 his3-Δ200 leu2Δ1 lys2Δ202 trp1Δ63窝藏质粒 p414-TEF1p-Cas9-CYC1t [ DiCarlo et al. , 2013] ), 优化表达 Castrodu9 by the codon p414-TEF1p-Cas9-CYC1t 的作用。
在 YPDA 液体培养基中培养过夜。
用酵母细胞预培养物接种新鲜的 5 毫升 YPDA 液体培养基，初始 OD 600约为 0.2 - 0.3。然后在 30°C 下以 140 rpm 的振荡速度孵育，直到 OD 600达到 0.8 - 1.0（约 4 - 6小时）。
混合适当的 DNA 模块和表达 gRNA 的片段 C（例如，我们需要两种片段 C [图 1B]来针对目标区域的两个边缘和一个 DNA 模块来替换染色体区域）并使用传统的LiAc / PEG 方法（Gietz和Schiestl ，2007 年）。
该协议的目的是为用户提供一个在每一步都尽可能简单的程序，包括下一节中描述的菌落 PCR。因此，该协议的制定没有测量 PCR 产物的 DNA 浓度。对于常规进行的酵母转化，我们始终使用 12 μl DNA 模块和 11 μl每个片段 C PCR 反应混合物来替换染色体区域，因为我们已经使用这样的量获得了足够的转化体（即12 μl + 11 μl + 11 μl = 34 μl ) PCR 反应混合物。此外，整个 PCR 反应混合物无需纯化即可直接用于酵母转化。
酵母转化之后，悬浮在100细胞微升灭菌水，散布在整个悬浮液到一个或两个选择板，并在30℃下孵育2 - 3天。
通过菌落 PCR 和随后的琼脂糖凝胶电泳确认预期的染色体变化
要制备 PCR 级基因组 DNA，请从每个菌落中取出少量细胞并悬浮在 10 μl 0.02 M NaOH 溶液中。在加热块中在 98°C 下加热 10 分钟，然后转移到冰上。
作为一个例子，我们在这里描述了如何确认从替换实验中获得的转化体。设计和购买用于菌落 PCR 的寡核苷酸引物。您可以使用目标区域上游和下游序列中的任何序列，但我们建议以最终 PCR 产物 <2 kb 的方式设计引物，因为在菌落 PCR 期间产生更大的 PCR 产物可能会出现问题。对于寡核苷酸引物1，使用200 - 176 NT目标区域的上游序列和寡核苷酸引物2，使用66 - 90 NT目标区域的下游的反向序列。由于我们使用CgLEU2标记基因进行替换，CgLEU2的大小为1685 bp，因此目标区域替换成功后，PCR产物的大小将为200 bp + 1685 bp + 90 bp = 1975 bp（图2）。例如，要检查染色体 4 中 500-kb 区域的替换（坐标编号 494271 - 994270），设计基于 494071 - 494095 nt序列（5'-CATATCAGTGTCTTCATCTTCATGA-3'）和2oligonucleotide引物的寡核苷酸引物1在994 ，336 - 994 ，360个核苷酸的反向序列染色体4的（5'-TAGTGGATACGCAGGACGTGTTATC-3' ）此外，我们建议设计对照引物以检查PCR反应是否顺利进行。任何基因组区域都可以作为对照进行扩增；我们放大了染色体 1的CNE1区域作为内部对照。控制引物1是基于211 - 230 NT '序列（5'-TCACAGGGTCGATTGCAAGG-3）在861和控制引物2 - 880 NT所述的（反向序列5'-CTGGTGGTTCAGTGCCATCT-3）' CNE1区域。如果CNE1基因被正确扩增，您将获得 670-bp 的 PCR 产物。
PCR反应
Prime Star Max 预混料 2 ×

12.5微升

模板基因组DNA

0.5微升

对照底漆 1 (7.5 pmol )

5'-TCACAGGGGTCGATTGCAAGG-3'

0.75微升

对照底漆 2 (7.5 pmol )

5'- CTGGTGGTTCAGTGCCATCT -3'

0.75微升

寡核苷酸引物 1 (7.5 pmol )

（使用目标区域的 200 - 176 nt上游序列）

0.75微升

寡核苷酸引物 2 (7.5 pmol )

（使用目标区域的 66 - 90 nt下游（反向）序列）

0.75微升

水

9微升

全部的

25微升

变性：98°C，10 秒

退火：55°C，5 秒

30个周期

延伸：72°C，10 秒

注意：您可以使用任何 DNA 聚合酶进行菌落 PCR。然而，由于我们的目的是让这个协议尽可能快，我们使用 Prime Star Max Premix 2 × ，它只需要 5 s/kb 的扩展时间。

C:\Users\Madandan\Desktop\2003790--1803 SatoshiHarashima 952696\Figs tif\图2.tif

图2.典型的琼脂糖凝胶电泳结果小号用于通过gRNA-TES染色体置换分析。泳道1至9代表独立的转化体。M 代表尺寸标记（Gene Ladder Wide 2, Nippon Gene, Toyama, Japan）。泳道1至3代表从300-kb区域置换获得的转化体；泳道4至6代表从400-kb区域置换获得的转化体；泳道 7 至 9 代表从 4 号染色体的 500-kb 区域置换获得的转化体。几乎所有转化体（除了第 3 道中的那些）都显示出预期的相应染色体区域的置换并产生了 1975-bp 条带。在所有转化体中也观察到内部对照带（670 bp）。

数据分析

每个实验中转化体的数量不同。例如，当我们针对较小的染色体区域（例如 150 kb 和 200 kb）进行替换时，我们在一次转化中分别获得了 263 和 287 个转化体（Easmin等，2019）。当我们针对 300-kb、400-kb 和 500-kb 区域时，我们在一次转化中分别获得了 51、43 和 103 个转化体。我们测试了 6 个转化体来替换 150-kb 和 200-kb 区域中的每一个，并测试了 300-kb、400-kb 和 500-kb 区域中的每一个替换体。预期替换150-kb的，200-kb的，300-kb的，400-kb的，并且500-kb的区域的频率分别为100％，66.6％，80％，100％和100％，分别（Easmin等人., 2019)。相比之下，当不应用 gRNA-TES 时，观察到 150-kb 区域替换的最大预期频率为 16.6%；为了替换其他染色体区域，当不使用 gRNA-TES 时，没有获得正确的转化体。

食谱

合成完全 (SC) 培养基
2%葡萄糖

0.67% 不含氨基酸的酵母氮碱（例如BD Difco ）

注意：含有所有氨基酸和缺乏特定氨基酸的核酸碱基的 0.2% dropout 混合物可用于营养缺陷型选择。

对于该板测定中，2％琼脂中加入

YPDA培养基
2%葡萄糖

2% 蛋白胨（例如BD Bacto TM ）

1% 酵母提取物（例如BD Bacto TM ）

0.004％腺嘌呤HC升（FUJIFILM和光纯药公司）

致谢

这项工作得到了日本科学促进会 (JSPS)-KAKENHI, 科学研究资助 (B) 的支持，资助号 [JP 15H04475] 到 SH该协议改编自我们以前发表的工作 ( Easmin等，2019）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Bao, Z., Xiao, H., Liang, J., Zhang, L., Xiong , X., Sun, N., Si, T. 和 Zhao, H. (2015)。同源 - 集成 CRISPR-Cas (HI-CRISPR) 系统，用于在酿酒酵母中进行一步多基因破坏。ACS 合成生物学4：585-594。
DiCarlo, JE, Norville , JE, Mali, P., Rios, X., Aach , J. 和 Church, GM (2013)。使用 CRISPR-Cas 系统在酿酒酵母中进行基因组工程。核酸研究41(7): 4336-4343。
Easmin , F., Hassan, N., Sasano , Y., Ekino , K., Taguchi, H. 和Harashima , S. (2019)。用于在 CRISPR/Cas9 基因组编辑中简化 gRNA 传递的 gRNA 瞬时表达系统。J Biosci Bioeng 128(3): 373-378。
Easmin , F., Sasano , Y., Kimura, S., Hassan, N., Ekino , K., Taguchi, H. 和Harashima , S. (2020)。CRISPR-PCD 和 CRISPR-PCRep：在酿酒酵母中同时进行多节段染色体缺失/替换的两种新技术。J Biosci Bioeng 129(2): 129 - 139。
Gietz , RD 和Schiestl , RH (2007)。使用 LiAc/SS 载体 DNA/PEG 方法进行高效酵母转化。国家协议2(1)：31-34。
Güldener , U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer , J. 和Hegemann , J. (1996)。一种新的高效基因破坏盒，可在出芽酵母中重复使用。核酸研究24：2519-2524。
Jako č iunas , T., Bonde , I., Herrg å rd , M., Harrison, SJ, Kristensen, M., Pedersen, LE, Jensen, MK 和Keasling , JD (2015a)。在酿酒酵母中使用 CRISPR/Cas9 进行多重代谢途径工程。Metab Eng 28：213-222。
Jako č iunas , T., Rajkumar, AS, Zhang, J., Arsovska , D., Rodriguez, A., Jendresen , CB, Skj ø dt , ML, Nielsen, AT, Borodina , I., Jensen, MK 和Keasling , JD (2015b)。CasEMBLR：酿酒酵母中体内组装的 DNA 部分的Cas9 促进多位点基因组整合。ACS 合成生物学4(11)：1226-1234。
Jiang, W.、Bikard , D.、Cox, D.、Zhang, F. 和Marraffini , LA (2013)。使用 CRISPR-Cas 系统在 RNA 指导下编辑细菌基因组。Nat Biotechnol 31(3): 233-239。
Li, Y., Lin, Z., Huang, C., Zhang, Y., Wang, Z., Tang, YJ, Chen, T. 和 Zhao, X. (2015)。使用 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑对大肠杆菌进行代谢工程。Metab Eng 31：13-21。
Stovicek , V.、Holkenbrink , C. 和Borodina , I. (2017)。用于酵母基因组工程的 CRISPR/Cas 系统：进展和应用。FEMS 酵母研究17(5)。
Sugiyama, M.、Ikushima , S.、Nakazawa, T.、Kaneko, Y. 和Harashima , S. (2005)。酿酒酵母中PCR 介导的重复染色体分裂。生物技术38(6)：909-914。