设备

标准个人电脑
所描述的分析是使用带有 Windows 10的Bionic G32 144Hz 一体机 [i7-8700] 进行的。推荐的最低配置是 AMD Ryzen 5 2600X 六核处理器 3.60 GHz、16 GB RAM、64 位操作系统。

软件

GNU 图像处理程序，免费访问（GIMP 2.8；gimp.org/downloads/ ）。
定制MATLAB算法，免费获取（github.com/Hippocampome-Org/QuantifyNeurites）
绘图数字化仪，免费访问( plotdigitizer.sourceforge.net )
斐济：形状分析插件，免费获取（Wagner and Lipinski, 20 13; imagej.net/Shape_Filter）
斐济：简单的 Neurite Tracer 插件，免费访问（Longair等人2011；imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions）
斐济：3D Convex Hull ，免费访问( imagej.nih.gov/ij/plugins/3d-convex-hull )
MATLAB：商业许可；提供 30 天免费试用 ( mathworks.com/products/get-matlab.html )

图像数据集和附加要求

需要的是包含神经元形态图的图形，例如树突和轴突乔木（配方1 ）。如果轴突和树突都来自同一个神经元，则需要以不同的颜色绘制它们。如果乔木侵入多个解剖宗地，则在需要宗地特定数据时，图形必须划定宗地边界。重要提示：所有数字都需要包含校准条。本协议中使用的示例可在hippocampome.org/php/data/Bio-protocol_sample_files.zip访问。
需要估计包含感兴趣神经元的解剖包的体积（方法2 ）。本协议中使用的示例列在表 1 中，可在bbp.epfl.ch/nexus/cell-atlas 上访问。
所需的是估计沿轴突的突触前元件 (boutons)之间的平均距离和沿树突的突触后元件 (轴密度的棘)之间的平均距离, 以了解感兴趣的物种和神经系统 (Recipe 3 )。本协议中使用的示例可在hippocampome.org/php/data/Bio-protocol_sample_files.zip访问。

程序

孔定量吨的通货膨胀特定包裹-轴突和树突长度
使用 GIMP 生成必要的 PNG 文件。从原始未修改的神经元重建（方法1 ）中，手动分离每个解剖包裹内的轴突和树突。如果包裹-特定信息不是必需的，SIMPL ÿ分离的轴突从所述估计对应轴突和树突长度树突（视频1）。

视频 1. 2D 图像处理。GIMP 用于从各个包裹中选择性地擦除轴突或树突，以将它们隔离以供以后分析。

一种。将 PDF 加载到 GIMP（例如，文件：打开“Harris-Stewart-2001-41-BrainRes-Fig2A.pdf”）（图 2A）。

湾使用 GIMP 擦除图形的无关部分（图 2B）。

从工具箱窗口中选择橡皮擦工具。
从画笔窗口中选择硬度 100 。
画笔大小设置为所需的尺寸（例如，在25）工具选项窗口（图2B，红色框）。
按住鼠标左键可擦除部分图形。
保存擦除图形的 XCF 版本，其中包括所有层中的两种神经突（例如，文件：另存为... “ SCA_all_allColors_both ”）。重要提示：名称的结构应保留用于像素计数。
将 PNG 版本从图形的 XCF版本导出到同一文件夹（例如，文件：导出为... “SCA_all_allColors_both.png”）。选择 PNG 作为首选文件格式，因为其默认背景是透明的。这减少了因意外计算背景中包含的像素而导致的任何潜在错误。
C。通过重复步骤 b i -iv （图 2C，视频 1），使用 GIMP根据颜色代码（轴突在图 2B 中以红色显示）从图中擦除轴突。

将图形的 XCF 版本与感兴趣层中的树突保存到同一文件夹（例如，文件：另存为... “ SCA_SO_allColors_Ds.xcf ”）。
将 PNG 版本从图形的 XCF版本导出到同一文件夹（例如，文件：导出为... “SCA_SO_allColors_Ds.png”）。
d. 通过重复步骤 b i -iv （图 2D，视频 1），使用 GIMP根据颜色代码（树突在图 2B 中以黑色显示）擦除图中的树突。

将图形的 XCF 版本与感兴趣层中的轴突保存到同一文件夹（例如，文件：另存为... “ SCA_SO_allColors_Ax.xcf ”）。
将 PNG 版本从图形的xcf版本导出到同一文件夹（例如，文件：导出为... “SCA_SO_allColors_As.png”）。
保存在每一个层和分不同的文件的轴突和树突域到相同的文件夹（图2E和2 F）。

图2为图像的预处理的孔定量吨轴突和树突长度的通货膨胀。A. GIMP File 菜单用于打开要处理的图像文件。B.代表性图像正在准备处理（Harris et al ., 2001），其中红色框界定工具箱位置，圆圈代表橡皮擦工具。丙、丁。显示的是处理后的图像，在感兴趣区域的所有层（在本例中为下突）中仅包含树突 ( C ) 或轴突 ( D )，这些图像是从 ( B ) 中显示的原始图像中获得的。E，F 。示出的是- [R具有代表性的仅显示树突（图像ë ）或轴突（˚F在感兴趣的包裹）（在这种情况下，该层moleculare下托），它是从（所示的原始图像而获得的乙）。

使用定制的 MATLAB 算法进行像素计数（图 3；视频 2）。

视频 2. 来自 2D 图像的像素数。定制的 MATLAB 程序用于计算图像的 16 个颜色通道中包含的所有像素。

一种。将分离的图像放在数据文件夹中。

湾打开 MATLAB，确保当前工作文件夹已打开（例如，“dir_QuantifyNeurites_v2”）（图 3A1，红色框）。

C。运行命令转换（图 3A1，绿色框）。

d. 从显示的菜单中，通过键入数字并按Enter来选择要处理的图像（图 3A2）。

e. 图像打开后，选择轮播模式以识别包含像素的颜色通道（图 3A3）。

F。按m选择包含像素的颜色通道（像素数显示在括号中）（图 3B1）。

G。如果通道不包含任何像素，只需按空格键移动到下一个通道（图 3B2）。

H。可选步骤：使用选定的颜色通道绘制图像，通过键入p并按Enter来验证选定的通道是否包含所有像素（图 3B3）。

一世。显示包含总像素数的直方图（图 3C1）。命令窗口显示选定的通道和像素数。

j. 可选步骤：通过键入s并按Enter保存包含选定（图 3C2）和未选定（图 3C3）通道的图像。图像会自动保存到输出文件夹。

克。小号的选民，从数据文件夹中的新图像通过典型ING升，按ING进入。

湖 Ë次过程的典型ING /并按ING进入。

图3. 像素计数。A1 。显示的是一个MATLAB 窗口，红色框中是打开的工作文件夹“dir_QuantifyNeurites_v2”，绿色框中是运行命令“ convert ”的命令窗口。A2 。该d isplayed菜单显示运行命令“后转换”选择图像处理。A3 。该d isplayed菜单选项中出现的顺序来分析所选择的人物。乙。显示的是代表性的轮播模式，其中颜色编号和存在 ( B1 ) 或不存在 ( B2 )的像素数在蓝色框中分隔，最终绘图仅包含在轮播模式完整运行期间选择的通道. Ç 。呈现的是所选通道的ah柱状图和每个通道的像素数 ( C1 ) 以及为所选 ( C2 ) 和未选择 ( C3 ) 通道生成的 PNG 文件。

使用Plot Digitizer估计像素长度（视频 3）。

视频 3.以像素为单位测量校准条。Plot Digitizer 用于测量神经元重建校准条的像素长度。记录校准条两端的 X 坐标，它们的差值以像素为单位的最终测量值。

一种。使用 Plot Digitizer 打开原始重建。

湾将光标放在校准条的开头并记下数字。

C。在校准条的另一端做同样的事情。

d. 数字之间的差异代表校准条的长度（以像素为单位）。

从像素数到长度的转换。
一种。确定由所述平均神经突宽度随机选择荷兰国际集团为每个神经元的图像，包裹，和神经突域的三个位置; MEASUR荷兰国际集团在每个位置处的像素的分支宽度; 和averag荷兰国际集团三个值（视频4）。

视频 4.神经突宽度估计。Plot Digitizer 用于估计包含神经元重建部分的每一层中轴突和树突的宽度。每层测量三个例子以获得每层神经突宽度的平均估计。

湾以物理单位计算像素长度，这只是标称校准比例尺值（以微米为单位）除以以像素为单位的测量条长度。

C。通过将给定包裹中该神经突的像素数乘以物理像素长度并将结果除以像素的平均分支宽度，获得包裹特定的神经突长度。

d. 正确的人为通过组合包裹特异性长度压扁三维乔木成二维图像，升p ，与文献报道的截面厚度，吨小号，利用毕达哥拉斯式：

(1)

其中代表最终校正的长度。

的判定的一个xonal和树突状路径的距离（图4中，视频5）

视频 5. 测量体细胞距离。斐济与简单轴突示踪插件是用来从细胞体到的端部测量的像素长度的选定轴突或树突。三个例子为每种类型的神经突，以确定测量的平均值。

用斐济打开原始文件：文件 - 打开 - 文件源（图 4A）。
将图像转换为二进制：处理 - 二进制 - 生成二进制（图 4B）。
打开插件“Simple Neurite Tracer：”插件-神经解剖-SNT （图4C）。
在 SNT 命令窗口中打开图像：文件 - 选择跟踪图像 - 从（图 4D）。
通过单击体细胞和段的末尾跟踪树突/轴突的距离。如果跟踪与结构不对应，请通过沿线段多次单击来提高精度：按y ，然后继续沿路径跟踪（图 4E）。
跟踪完成后，通过接受跟踪移动到下一个。按F完成跟踪。
这些值以像素为单位估计（路径管理器窗口，如果值不可见：标记 – 形态测量 – 长度），因此使用像素/长度因子将它们转换为长度（第3部分，图 4E）。
完成所有跟踪后，保存它们以备将来参考。文件 – 导出为– swc或 traces 。

图4.确定的š omatic距离和凸包卷。一个。显示了斐济菜单步骤，用于打开路径跟踪图像（例如，CA1 锥体神经元；Bannister和Larkman ，1995）。乙。显示的是将图像转换为二进制图像的菜单步骤。Ç 。显示的是运行 Simpl e Neurite Tracer 插件的菜单步骤。d 。显示的是加载打开的图像以进行跟踪的简单神经突跟踪器步骤。乙。呈现的是具有代表性的Simple Neurite Tracer 控制台，以蓝色显示一条路径（中间），控制台上有完成路径和继续追踪的选项（左），以及路径管理器，以及对应于不同地块的所有追踪原始图像（右）。˚F 。显示的是菜单的步骤来运行赫尔和圈为位于感兴趣包裹树突插件（例如，CA1地层东方明珠Oriens ;对于凸绿盒）^ h ULL测量。格。所述船体和圈工具箱（左）被用来扫描当前图像，其中所述图像与所述分隔区域在绿色和底面板显示新兴结果窗口被示出。

确定的C onvex ħ ULL体积从2D重建（图4F和4 G，视频6）
使用斐济打开生成的仅包含轴突或树突（PNG 文件）的分割图像：文件 - 打开 - 文件源。
将图像转换为二进制：处理 - 二进制 - 生成二进制。
打开插件：Plugins – Shape Analysis – Hull And Circle （图 4F）。
从新窗口中，选择选项扫描当前图像或 Roi （图 4G）。
将生成一个包含结果的新窗口（Hull 和 Circle 结果，图 4G）。
保存结果：文件 – 另存为.
与计算出的图像ħ显示ULL体积。该图像不能保存的，但它提供了有关所得凸如何信息ħ ULL面积计算（图4G）。
将从像素单元的区域测量以微米2和乘法结果荷兰国际集团所报告切片厚度值，假设该重建位于切片的中部。

从3D 重建确定凸包体积
使用 3D Convex Hull 插件直接估计真实体积。

计算一个每神经元突触verage数人对。
Ç alculate每对突触前和突触后神经元的突触的平均数目Ñ小号，从它们的具体包裹-轴突和树突长度，通过单独地估计数，Ñ SX ，轴突树突重叠在每个包裹X （Tecuatl等人., 202 1 ) . 对于任何x ，值N sx可以导出为三个因子的乘积：
一个给定的相互作用距离内发生突触前和突触后的元素的概率，[R ，是相互作用球的体积之间的比率，在其内两个元件中发现，并且整个包裹的体积，V X （配方2 ）。
在突触前的元素（轴突终扣）的数量一个给定解剖包裹指定通过在包裹的突触前轴突长度X ，大号斧，通过连续的突触前突触小结，间的平均距离除以b d （配方3 ;实施例的文件是在hippocampome访问.org/php/data/Bio-protocol_sample_files.zip ）。
在相同的包裹突触后元素（树突棘或轴）的数量是通过在突触后树突长度给定X ，大号DX ，由距离betwee划分Ñ突触后的元素，š d 。
要计算特定包裹中每对突触前和突触后神经元的平均突触数，请使用以下公式：

(2)

每涉及神经元突触对的总数，Ñ小号，是每包裹的数量，只是总和Ñ SX ，在所有的包裹。

计算每个连接对的触点数。
假设该给定的对神经元形成至少单突触接触，并计算的该对附加的触头的预期数量为：

(3)

其中由相互作用半径r和V o定义的球体之间的体积比表示任何给定的轴突束和树突棘或轴的相遇机会，并且L ax / b d和L dx / s d对应，分别对应于包裹x 中的轴突束和树突棘或轴的数量。

确定吨的他体积的交集，V Ó ，通过：

( 4 )

其中V DX和V斧是树突和轴突凸包卷在包裹X 。

计算Ť他每连接一对触头的总数一个š由一个增强在每个包裹的接触，反映了初始假设神经元的总和人对连接：
( 5 )

其中符号Σ x代表所有地块的总和。

计算连接概率
计算吨他一对神经元的连接概率人在包裹类型X除以每神经元的突触的平均数人通过在相同的包裹每连接一对触点的数目对：

( 6 )

测定T他总在任何包裹一对前和突触后神经元通过包容性的事件和连接的可能性：

( 7 )

其中符号𝛱 x代表所有包裹的产品。

表 1. 所有代表性文件的列表

请在正文中引用表 1。

数据一nalysis

计算平均数每神经元的突触的标准偏差人使用从突触前轴突和突触后树突长度所有测量的平均值和标准偏差对。
使用N sx 的等式 (2)计算给定包裹x的突触数量。
将r 、V x 、b d和s d视为常数。
使用乘积和常数的公式通过传播L ax和L dx的标准差来计算N sx的标准差，

( 8 )

( 9 )

通过对所有包裹求和来确定突触的总数，并使用求和公式计算相关的标准偏差，

(1 0 )

计算的标准偏差用于使用从对突触前轴突和突触后树突长度所有测量的平均值和标准偏差每连接一对触头的数目和用于凸ħ ULL体积为突触前轴突和突触后树突。
使用N cx 的等式 (3)计算给定地块x的联系人数量。确定的标准偏差为使用公式总和和常数交叉点的平均体积，

(1 1 )

(1 2 )

使用乘积、商和常数的公式计算给定包裹x的联系数量的标准偏差，

(1 3 )

(1 4 )

使用公式 ( 5 )确定联系总数，并使用总和公式计算相关的标准偏差，

(1 5 )

计算用于连接概率的标准偏差为一对神经元的人在包裹类型X从公式（6 ）。
计算的标准偏差为使用式为常量的连接概率，

(1 6 )

根据公式 ( 7 )确定总连接概率，并使用差值和乘积公式计算相关标准偏差，

(1 7 )

(1 8 )

( 19 )

笔记

精度此的过程是升IMIT编通过轴突重建的不完备性和可变性神经突直径。

该协议只能用于树突靶向连接：不能用这种方法估计perisomatic连接（但这些情况见 Brown等人，2012）。

在数据分析上述标准偏差的计算是对于每对神经元的手动执行人类型。相对于从显微图像追踪神经元所需的时间，通过应用提供的公式执行此操作所需的时间可以忽略不计。

食谱

神经元重建
包括用于每个神经元代表二维神经元描记人从同行评审出版物型基于下列入选标准：

重建应代表神经元的人型。必须包括每个突触前神经元类型至少一次轴突重建和每个突触后类型一次树突重建。
图片应包含校准比例尺和相关层的明确分界小号和次区域界限。后者是可选的，仅针对特定包裹的估算才需要。
对于包括轴突和树突的追踪，这两种神经突类型必须是明确可辨别的。同样，在包括多个神经元的追踪中，每个神经突类型必须明确归因于单个神经元。
物种（例如，鼠与鼠标）和发育阶段（例如，年轻的成年对比），应该是所有的神经元一致的人的类型。
数千神经重建的也可通过开放式访问数据库如MouseLight （ml-neuronbrowser.janelia.org）对于小鼠，Mapzebrain （fishatlas.neuro.mpg.de/neurons）斑马鱼，FlyCircuit对于果蝇（flycircuit.tw），昆虫脑数据库昆虫（insectbraindb.org），和NeuroMorpho.Org超过60不同的物种（阿克拉姆等人。，2018）。

体积估计
我们使用 Blue Brain Cell Atlas ( bbp.epfl.ch/nexus/cell-atlas )报告的小鼠大脑的解剖体积。其他来源适用于不同的物种，例如大鼠 (scalablebrainatlas.incf.org/rat/PLCJB14)、果蝇 ( v2.virtualflybrain.org ) 和斑马鱼 ( fishatlas.neuro.mpg.de )。也可以考虑报告地块特定体积估计的独立研究（例如，Ropireddy等，2012）。注：在脑容量的差异已报告的男性和女性之间以及中（王株等。，2020）。

超微结构参数
树突棘或轴突触后密度距离和轴突间- b Ø uton距离可以有巨大的中变异的物种，脑区，神经元人的类型。为了获得更高的准确性，请从感兴趣的突触的文献中收集特定值（例如，请参见hippocampome.org/php/data/Bio-protocol_sample_files.zip 中的文件，了解本协议描述中使用的示例）。

致谢

这项工作得到了 NIH 赠款 R01NS39600 和 U01MH114829 的部分支持。Carolina Tecuatl感谢Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología ，墨西哥提供奖学金 253060，允许在她的博士培训期间启动该项目。Tecuatl等人使用了这种方法。(202 1 ) “通过轴突-树突重叠对啮齿动物海马形成局部回路中潜在突触连接的综合估计。”

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

伦理

使用该协议分析的所有原始数据均已根据作者各自的伦理委员会发布。

参考

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4. Brown, KM, Sugihara, I., Shinoda, Y. 和 Ascoli, GA (2012)。大鼠小脑攀缘纤维的数字形态测量显示不同的分支和布顿类型。J Neurosci 32（42）：14670-14684。

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7. Longair , MH, Baker, DA 和 Armstrong, JD (2011)。Simple Neurite Tracer：用于神经元过程重建、可视化和分析的开源软件。生物信息学27（17）：2453-2454。

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12. Wagner, T. 和 Lipinski, H. (2013)。IJBlob：用于连接组件分析和形状分析的 ImageJ 库。J Open Res Softw 1(1): e6。

13. Wang, N., Anderson, RJ, Ashbrook, DG, Gopalakrishnan, V., Park, Y., Priebe, CE, Qi, Y., Laoprasert , R., Vogelstein , JT, Williams, RW 和 Johnson, GA (2020)。小鼠大脑结构的变异性和遗传性：不同品系的显微 MRI 图谱和连接组。神经影像222：117274。