材料和试剂

用于金属产品管理的UHF RFID 标签（村田制作所，目录号：LXTBKZMCMG-010）
Command TM小海报条（3M ，目录号：17024ES）
钉板，5/32” 厚，孔间距 1”
LOCTITE ® SUPER GLUE PRECISION PEN（汉高，目录号：2066118）
网材料（工业网，目录号：NG3060-164）
耳标，鼠标，浅蓝色，1-100（Stoelting ，目录号：56782）
耳标，仅靠背，Pk/100（Stoelting ，目录号：56792）
蚀刻雕刻笔（Porsin ，目录号：LX1323）
Teklad 1/8”玉米芯床上用品（Envigo，目录号：7092A）
棉花雀巢 (Ancare nestlets)
动物：Jackson 小鼠 WT C57B L / 6J（Jackson Laboratories ，目录号：000664）
小鼠C57B的后代L /大坝从杰克逊实验室获得6J ，并孕育，诞生，并在我们的生态饲养场饲养。小鼠对食物和水自由进入，并在灯都维持在12小时光照/黑暗周期。在断奶日龄（P）21，将小鼠一对收纳在标准笼子里，自由获取的在笼不锈钢-配备有塑料网钢运行车轮嵌合在轮缘为幼年小鼠的安全性。所有小鼠通常6-9在g的断奶时间。跟踪从 P21到 P 41每天 24 小时连续进行三周。所有实验均按照 U 进行。小号。美国国立卫生研究院动物护理和使用指南，并获得加州大学欧文分校动物护理和使用机构委员会的批准。

Teklad 全球无大豆蛋白挤压啮齿动物饮食（Envigo ，目录号：2020X）
设备

RFID 无源天线 (Abracon LLC: ARRAN5-915.000MHz)
L 尺寸鼠标笼体，36.5 × 20.7 × 14.0 厘米，聚碳酸酯（Tecniplast Group：1284L001；来自 Starr Life Sciences）
高压灭菌过滤器顶部（Tecniplast Group：1284L-400SU；来自 Starr Life Sciences）
4.5" 带簧片开关的跑轮（Bio-Lynx 科学设备公司：610-0003-00；来自 Starr Life Sciences）
MMCX (J)-LL100HF-RPTNC (M) 60'' 电缆（Federal Custom Cable, LLC：SCA1086-60）
耳标，涂抹器（Stoelting Co：56791）
Keonn AdvanReader-160 UHF RFID 阅读器（4 端口）（Keonn Technologies：ADRD-M4-ESMA-160.01）
AdvanMux-8 UHF RFID 多路复用器（8 端口）（Keonn Technologies：ADMX-8-e-110.04）
CAT5 以太网电缆
USB 3.0 转千兆以太网适配器（Best Buy Co., Inc.，标志：NS-PU98635-C）
以太网供电注入器（Phihong：PSA16U-480(POE)；来自 Keonn Technologies）
SMA 公头到 SMA 公头 24” 电缆（Bracke Manufacturing, LLC：BM92046.24）
数据端口 24 通道盒（Starr Life Sciences）
数据端口 USB 电缆（Starr Life Sciences）
电钻
台锯
5/32”、3/16” 钻头
两台笔记本电脑（每个软件程序一台）具有以下要求：
VitalView ® 的最低要求：Windows PC（Windows XP 或更新版本）、2 GHz 处理器、2 GB 内存、800 MG可用硬盘空间、USB 端口
最低要求 AdvanNet TM软件：Firefox 或 Chrome 浏览器、互联网连接、USB 端口
计算机（用于个人RFIDELEMus程序）
最低要求：Windows 10、12 GB RAM

软件

AdvanNet TM软件（Keonn Technologies, SL, https://keonn.com/software-product/advannet/）
VitalView ®活动数据采集软件（Starr Life Sciences Corp，https: //www.starrlifesciences.com/product/activity-software/ ）
个人RFIDELEMus计划（https://github.com/anthonyraus/IndividualRFIDELEMus/releases）
程序

RFID天线设置（图 2）
为每个笼子切割2” × 2”钉板方块，每个方块上有两个孔：取钉板并画线进行正交切割，使得：
一组线穿过每隔一个洞。
另一组线在每个其他孔之间延伸 ½”。
使用台锯，小心地切割线条（图 2A）。

将钉板方形白色面朝上放置。使用钻头和 3/16" 钻头，斜钻穿过其中一个孔，使成角度的孔远离正方形的中心（底部的远端）。对每个正方形重复此过程。
注意：该步骤的目的是使现有的栓板孔宽为天线头部到平躺在配挂板，一旦天线导线是线程编通过。

螺纹的天线的导线通过一个栓板正方形的成角度的孔，使得导线出来的底部（棕色侧）。让天线底座尽可能覆盖两个孔。
将双面 Command TM条放在钉板表面，覆盖与天线线穿过的孔相对的孔。将天线底座固定在钉板正方形的顶部（白色侧）到双面Command TM条（图 2B）。
图2.天线小号etup。一个。与天线和 Command TM条相关的钉板方块的正确尺寸。乙-丙。正确装配的天线的和在自顶向下（B）和侧栓板正方形-轮廓（C）的意见。

笼子设置（图 3）
预先确定并将两只相同性别的老鼠分配到每个运行的笼子里。计划到c onstruct RFID兼容运行笼基础上的鼠标对数中使用你的学习。
将轮罩放置在靠近 Techniplast 笼子食物漏斗的金属丝盖下侧，以便：
轮子位于食物和饮水区的前面和左侧。
轮罩的左边缘距离笼子的左边缘三个槽。
外壳的螺钉与最靠近料斗的横杆齐平。
为簧片开关槽面朝所述保持器的最近的壁。
将垫圈和蝶形螺母拧到螺钉上，将外壳固定到电线盖上（图 3A）。

使用剪刀，切割网材料的一个条带的运行车轮的宽度，以使得围绕所述轮的外轮缘的网格拟合。这是用来使四肢小幼年小鼠不通过掉落的的梯级的车轮。
注意：确保这种配合是精确的。不适当地适合泰德网（当切太窄）可以上滑动的轮子和潜在地伤害小鼠尾部。

拧下轮罩的轴，将轮放在外壳内，轮磁铁朝外，然后将轴穿过外壳和轮，然后重新拧上轴盖。
放置组装RFID天线和栓板平方直接在其笼中的轮下方（一个IM朝向天线的导线端部背面笼壁）和天线固定和栓板平方与到位双面命令TM条。用金刚石笔尖在带有电线的孔旁边标记一个圆圈（图 3B）。横向拉出 Command TM条带，取下天线钉板方块。
翻转笼子，使底座位于顶部。使用钻头和 5/32" 钻头，在标记的位置钻孔。打完一个完整的孔后，使用 3/16" 钻头加宽孔。通过孔斜钻，使得在朝着笼子点底部的孔出口回はLL。
注意：小号TEPS乙1-乙6只需要一次为每个笼子进行。

将笼子翻转到n 直立位置。将天线和钉板方块放回笼子里。通过该孔螺纹天线导线，使得导线分列的底部的背面壁。重新调整天线和钉板方块，直到它正好位于车轮下方。使用双面Command TM条（图 3C）将钉板的底部固定到笼子底部。
注意：在使用预先钻孔的笼子s 的后续组件中，天线的方向可以修改为相对于笼子底座的非正交位置。这是至关重要的，以确保该天线的中心是直接在轮的中心下。

在笼子底部添加一层薄薄的垫料，直到垫料浸入钉板而不是天线。将两个嵌套方块放入笼子底部，远离轮子。放置电线盖与所述轮在所述笼，使得轮在于用适当的间隙（图3D）天线的上方。用过滤后的笼顶盖住笼子。
图3.笼小号etup。一个。与金属丝盖和笼子布局相关的轮罩的正确组装。乙。Techniplast 笼子的自底向上视图，显示了车轮下方的区域。将天线和钉板方块正确放置在车轮下方。Ť他钻部位是相邻于栓板的金属丝出口孔，并通过在笼子底部取出的黑色圆圈表示。Ç 。Threadin克透笼孔的天线导线。d 。天线和车轮之间的间隙。

RFID + VV 系统设置（图 4）
按照制造商的说明设置 VitalView ®系统和 RFID 阅读器系统。一次初始化尽可能多的 VitalView ®通道和 RFID 天线e 。保持数据记录配置为每个系统作为默认，使得对于VitalView记录间隔®是小于或等于1分钟，和信道名称保持数字和顺序（1-24）。使用一个VitalView ®系统（24端口），一个RFID ř EADER（4端口），和三个RFID米ultiplexers（8端口），最大的24个笼可配备单个跟踪。
使用 60 英寸 LMR 100 电缆将一根天线线连接到 RFID 阅读器或多路复用器上的一个端口（图 4）。
将一个簧片开关拧入每个运行笼中的簧片开关槽。将簧片开关电缆的另一端插入 VitalView ®盒上的端口（图 4）。通过旋转运行轮来测试您的车轮设置，并调整簧片开关的插入深度，直到 VitalView ®系统记录车轮转数。
请注意：与一个RFID读取器和一个多路转换器的配置可以在一个时间跟踪11个笼，在每个笼两只小鼠。附加的多路复用器可以被加入以增加同时记录的容量编笼中。

图4. RFID和VitalView ®小号ystem小号etup。来自并行 RFID 和 VitalView ®系统的数据馈送示意图。RFID 阅读器连接可以使用 RFID 多路复用器扩展到多个笼子。每个 RFID 天线都通过 60 英寸 LMR 100 电缆连接到阅读器或多路复用器。我们通常为 VitalView ®和 RFID 阅读器软件（AdvanNet TM软件）程序使用单独的计算机。

鼠标标记（图 5）
蚀刻每个RFID标签根据所述（笼数例如，1，2，...）的保持架（内和动物ID例如，A，B）用金刚石尖笔。
在笔记本电脑ü唱RFID软件（指令AdvanNet在TM用户指南），改变RFID标签的EPC代码e0000000000000000000001A，e0000000000000000000001B，E ...... 2A，E ...... 2B，等基于所蚀刻到它的标签号（图5A)。分配这些编号以及鼠标，使它们与 VitalView ®通道中的通道名称 1-24 相匹配；例如，标记为 1A 和 1B 的小鼠必须在与 VitalView ®通道 1相连的笼子中，等等。
揉搓 P21 鼠标。使用 Stoelting 耳标和耳标涂抹器，在一只耳朵上标记每只老鼠（图 5B）。备用耳（左VS 。右），如果可能的话，用于对收纳小鼠的容易视觉识别。
在RFID 标签的绿色底座上放一小滴强力胶（图 5C）。使用镊子，小心翼翼地贴上RFID标签的粘胶面到鼠标上的Stoelting标签的耳朵。将RFID标签和耳标固定在镊子尖端之间，让胶水干燥约 30 秒（图 5D）。
把老鼠放在笼子里。确保小鼠 1A 和 1B（由贴在其上的 RFID 标签的 EPC 代码指示）在连接到 VitalView ®端口 1的笼子中。对其他笼子重复上述操作。
注意：建议每天进行现场监控，以识别和防止卡住车轮或不安全或掉落的标签的可能性。这些在我们的经验中很少发生；然而，他们可以在引入误差，以收集如果不能迅速解决的数据。这些问题可以很容易地纠正有个妥善监督ê设备。

图5.小鼠吨agging。一个。蚀刻有新 EPC 标识的 RFID 标签示例。乙。鼠标被套住，耳标贴在鼠标的左耳上。Ç 。RFID 标签底部添加了强力胶，可以用镊子夹起 RFID 标签。只需极少量的强力胶即可将 RFID 标签粘贴到耳标上。d 。RFID 标签贴在耳标上并固定约 30 秒，让胶水变干。

RFID 笼子和天线重复使用
一旦在实验完成后，拔掉从LMR100电缆的天线。横向拉动Command TM条带，卸下天线和钉板方块。处理钉板。保存天线和水并仔细冲洗一个海绵。
预钻孔的笼子和洗过的触角可重复用于未来的实验。每个笼子必须使用一个新的钉板方块。
数据一nalysis

对准VitalView ®和RFID原始数据，以产生单个行驶距离S（图小号6，7）
注意：车轮转数由 VitalView ®活动软件按每个笼子每分钟确定并导出为 .csv 文件。对于每只带有 RFID 标签的鼠标，RFID 阅读器都会记录单个标签读取，并通过AdvanNet TM软件导出为 .csv 文件。

每对制造商的说明，导出了从VitalView数据®系统和AdvanNet TM软件。该AdvanNet TM软件自动命名文件“data.csv”。VitalView软件根据用户指定命名。
在处理过程中创建六个新目录（文件夹）来保存您的文件。这些目录将接受和存储（建议名称）的文件：1) VV 输入 2) RFID 输入，3) VV 输出，4) RFID 输出，5) 距离，和 6) 统计。
将 Vital View 导出 .csv 文件放入“VV 输入”目录。
“预处理”继续之前的RFID数据文件：将RFID导出的.csv数据文件需要以重新格式化（预处理）计划与对齐的VV数据。在 Microsoft Excel 中打开RFID导出 .csv文件（图7 A）。找到时间戳列（在本例中为 L 列）。将列的数字格式转换为“MM/DD/YY HH:MM” （使用 24 小时制）。选择并剪切整个时间戳列，然后将其粘贴到EPC 列左侧的B列（在我们的示例中为 C 列）。删除除timestamp 和EPC 列以外的所有列，使timestamp 列为A 列，EPC 列为B 列。选择整个timestamp 列，按最旧到最新排序，然后展开选择。插入新行1.在电池1A，写入“TIME_STAMP”，并在电池1B，写入“HEX_EPC”（图7的B）。如果出现其他地方在文档中这些话，删除这些行，只保留写在第1行的话保存在é艾克赛尔板作为一个新的“预处理”出口.csv文件，并将其放置在“RFID输入”目录。
图6 。数据p rocessing p 3 ipeline小号依照步骤。管道的插图用于处理RFID出口和使用VV导出文件process_file_ui.exe程序。一个。第1步：从生命查看文件处理的输入目录。乙。第二步：RFID出口数据的处理。Ç 。第 3 步：将 RFID 和 Vital View 文件交叉引用为个人每日距离和每日错误率。

在 GitHub 上打开项目“Individual RFIDELEMus”（下载链接可以在上面的“软件”部分找到）。使用 RFID 编码程序process_file_ui.exe分三步处理数据：
process_file_ui.exe程序的“Vital View 处理”部分在 VV 输入目录中收集一个或多个 Vital View 导出文件，并将它们组合成一个处理文件。程序然后重新采样过1的数据-分钟尤特的时间间隔，从而使数据可被直接比较与RFID数据。保证是维维输入目录仅包含生命观导出文件。选择“VV input”目录作为输入，选择“VV output”目录作为输出。输入输出 VV 文件的名称并运行程序的这一部分（图6A ）。输出文件将写入“VV 输出”目录（图 7C）。
process_file_ui.exe程序的“RFID 处理”部分接受预处理的 RFID 文件 .csv，并根据每个鼠标的唯一 EPC 代码将其标签读取分为每行分钟（每只鼠标都有自己的列）。选择在“RFID输入”的目录中输入的预处理后的RFID数据文件，并选择“RFID输出”目录作为输出（图6的B）。输入输出 RFID 文件的名称并运行程序的这一部分。输出文件将出现在“RFID 输出”目录中（图 7D）。
process_file_ui.exe 程序的“Cross Reference Vital View Data with RFID Data”部分将每 1 分钟间隔内的滚轮转数总和分配给该分钟内标签读取次数最多的笼子中的鼠标。然后将车轮转数转换为距离 r u n（使用我们的跑步轮直径 4.5 英寸），并将个人跑步距离作为每天一个 .csv 文件输出（例如，如果您记录了 7 天，则在其中将有七个单独的文件）输出目录）（图 7E）。选择“VV 输出”目录（包含步骤 1 中的文件）作为程序的 VV 输入，并选择“RFID 输出”目录（包含步骤 2 中的文件）作为程序的 RFID 输入。选择“Distances”目录作为距离输出，选择“Stats”目录作为统计输出。在“：MM：YYYY-MM-DD HH SS”提供的日期和时间所期望的数据处理的开始和结束（24小时）格式并运行该程序的该部分（图小号6C，8A，8B ）。
图 7. RFID 和 VV 数据文件重新格式化示例。一个。重新格式化（预处理）之前的原始 RFID 导出文件格式的摘录。乙。节选的最终重新格式化（预处理）RFID导出文件，准备在RFID处理使用。Ç 。节选中的VV输出文件的“重要视图处理”的步骤。d 。节选中的RFID输出文件的“RFID处理”的步骤。乙。节选的为一天距离输出文件的“交叉引用命门查看数据与RFID数据”步骤。当交叉引用多天时，每天都会在“距离”目录中生成一个输出文件。˚F 。节选的为一天统计输出文件的“交叉引用命门查看数据与RFID数据”步骤。当交叉引用多天时，每天都会在“Stats”目录中生成一个输出文件。

数据验证（图 8）
注意：跑步距离是按分钟分配和编制的。该process_file_ui.exe程序提供单独的.csv文件小号日志记录）的分钟数与至少一个车轮转动，或“总VV计数”，以及b）分钟与车轮转动，但没有数的标签读取，或者“没有 RFID，vv 也算数。”这些文件位于“Stats”文件夹中。每天生成一个 Stats 文件（图 7F）。

b) 除以 a) 得出 RFID 系统未捕获的运行分钟数的比例（错误率）（图 8C）。
图8.代表性d ATA。一个。每天雄性小鼠的个别运行距离，记录连续13天（之间产后25天并在两个保持架，保持架1和保持架3.小鼠1A和1B 37）被成对圈养在一起和小鼠3A和3乙分别成对住在一起。小鼠被P21-24中（数据未显示）驯化的运行车轮。乙。每天平均距离跑，证明在一个显著帧内笼差的平均运行量（非配对吨-test，* P <0.05）。Ç 。每个笼子每天带轮转的总分钟数（由 VitalView ®记录）和在没有随附 RFID 标签读取的情况下运行的总分钟数（由 RFID 阅读器记录）。.

笔记

系统监控
必须定期监测配备 RFID 的笼子是否因车轮下的嵌套材料或过多的垫料而造成车轮障碍物。这可以通过日常目视检查或查看 Vital View 软件记录来确定。
定期检查RFID导出文件，以确保将仍然被检测到的代码如预期。定期检查的重要视图数据出口，以保证该预期鼠标运行正在记录。我们每隔一天监控这些出口。在实验过程中，数据文件可以导出到外部驱动器。
每天监测老鼠的 RFID 标签和/或贴在耳朵上的耳标是否有任何中断。在我们的实验中，从老鼠身上分离出的耳标和 RFID 标签只发生过两次。如果鼠标缺少 RFID 标签或耳标，请给鼠标一套新的，确保新 RFID 标签的 EPC 与脱落的标签相同。
鼠标运行
通过明暗循环，每天 24 小时连续进行跟踪，并且可能会在幼崽与母亲断奶后（产后第 21 天）开始。
没有给小鼠固定轮适应期。他们是不是允许从他们的时间运行轮运行，我们再断奶。塑料网套设于轮确保了轮辋是车轮是安全的幼年小鼠上运行，所以在适应期不被认为有必要保证安全。我们的数据显示，幼鼠在断奶后随着时间的推移逐渐增加它们的跑动。驯化的最初几天可能数据分析过程中，如果需要除去编。
致谢

所有图像均使用 Biorender 生成。特别感谢 atlasRFIDstore、Keonn Technologies 和 Luke Raus 的技术援助和专业知识。

利益争夺

没有要披露的竞争利益。

伦理

本协议中描述的所有使用活体动物的实验均已被我们在加州大学欧文分校的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准使用。采取所有步骤以确保在这种范例中小鼠的疼痛和痛苦最小。该实验的IACUC 批准使用协议是 19-057。

参考

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