材料和试剂

1、Microcon 30-kDa离心过滤装置（默克，MRCF0R030）

2.注射器，3 毫升（BD 注射器）

3. VWR普遍低-保持移液管尖端，200 μ升（VWR，目录号：76322-150）

4.牛 α 2-HS-糖蛋白（胎球蛋白）（Sigma，Millipore，目录号：F3004-25MG）

5. ZIC-HILIC树脂（颗粒尺寸为10μm，孔径200埃;默克SeQuant ，默奥，瑞典）

6. H 2 18 O（Sigma-Aldrich，目录号：487090 ）

7. PNGase F（New England Biolabs，目录号：P0704S）

8.尿素（Sigma，Millipore，目录号：U1250 ）

9.十二烷基硫酸钠（Sigma，Millipore，目录号：71725）

10. DL- ð ithiothreitol（Sigma公司，Millipore公司，目录号：D0632 ）

11.碘乙酰胺（Thermo Scientific，目录号：A39271）

12.碳酸氢铵（Sigma，Millipore，目录号：09830）

13.甲酸（Sigma，Millipore，目录号：5330020050）

14.测序级改良吨rypsin（Promega公司，目录号：V5111）

设备

基准加热块（Benchmark Scientific ）
Eppendorf 5424 m微量离心机 (Eppendorf)
研钵和杵，150米升容量，瓷器（固安捷）
NanoDrop分光光度计和石英比色皿( Thermo Fisher Scientific )
3M TM Empore TM C8 萃取盘（Thermo Fisher Scientific ）
皮尔斯TM C18提示，100 μ升床（热Fisher Scientific公司，目录号：87784 ）
Nano-LC UltiMate 3000 高效液相色谱系统（赛默飞世尔科技）
LTQ-Orbitrap Elite 质谱仪（赛默飞世尔科技）
EASY-Spray PepMap C18 柱（长度，50 cm；粒径，2 μm；孔径，100 Å；Thermo Fisher Scientific ）
学者SpeedVac中SC210A加Ç entrifuge （赛默飞世尔科技）
精密通用水浴（Thermo Fisher Scientific ）

软件

Proteome Discoverer 1.4 或更高版本（Thermo Fisher Scientific，www.thermofisher.com）
Microsoft Excel ( https://www.microsoft.com )
Graph P ad Prism 7（GraphPad，https ://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）
MetaCore 生物信息学软件 ( https://portal.genego.com )

程序

蛋白质提取和过滤辅助样品制备
在液氮下用研钵和研杵研磨均匀冷冻组织。在室温下在 150 µl裂解缓冲液（4% SDS、100 mM DTT 和 100 mM Tris - HCl，pH 7.6）中裂解研磨组织（每个人类疾病或对照病例 25 mg ），然后在 95°C 下孵育5 分钟，如所述（Wisniewski等人，2009 年；Wisniewski，2017 年）。没有蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液中，因为 SDS 的存在有效地灭活了蛋白酶功能（Wisniewski等，2009）。
将匀浆冷却至室温后，以 16,000 × g离心5 分钟以获得含有提取蛋白质的上清液。
确定总蛋白质的蛋白质提取物中的浓度通过UV光谱测定法在280nm在比色杯中使用10 -毫米光程使用纳米滴分光光度计用1.1的消光系数为0.1％（克/ L）溶液（的Wisniewski等人，2009。 ) 。
穗每个蛋白提取物通过吸取牛小体积的α 2-HS-糖蛋白（胎球蛋白）储备溶液（0.4 μ克/ μ升牛胎球蛋白在裂解缓冲液），以达到0.1％的胎球蛋白的最终浓度（μ克/ μ克总蛋白质）。加标入牛胎球蛋白蛋白质用作内部控制过程中的技术变化的样品处理和分析我秒。
根据过滤辅助样品制备(FASP) 协议（Wisniewski等人，2009 年；Wisniewski，2017年），按照所述（Zhang等人，2018 年）处理蛋白质提取物。
将 30 µl 蛋白质提取物与 200 µl UA 溶液（100 mM Tris-HCl 中的 8 M 尿素，pH 8.5 ）混合。
将混合物转移到一个的Microcon 30 kDa的离心过滤装置（MRCF0R030，Merck）和离心机以14,000 ×克FO R 15分钟。D放弃流通。
将 200 µl UA 溶液添加到过滤器单元并重复离心。D放弃流通。
将 100 μl含有 50 mM 碘乙酰胺的 UA 溶液添加到过滤器单元中，并在室温下在黑暗中孵育30 分钟。
将过滤器单元以 14,000 × g离心10分钟。D放弃流通。
向过滤器中加入 100 μl UA 溶液，再次以 14,000 × g离心10 分钟。重复此步骤两次。
将 100 μl 50 mM NH 4 HCO 3 添加到过滤器中并再次离心。重复此步骤两次。D放弃流通。
在过滤器中加入 40 μl 50 mM NH 4 H CO 3溶液，其中含有测序级胰蛋白酶（酶蛋白比 1:100），37°C 孵育 12 小时。
洗脱通过添加100胰蛋白酶消化的肽微升50毫NH 4 HCO 3在14000，然后离心×克为10分钟。Ç ollect的流过。重复此步骤五次并合并洗脱液。
将三氟乙酸 (TFA) 添加到肽溶液中，最终浓度为0.5% TFA。
脱盐肽使用样品皮尔斯TM C18提示以下的制造ř的协议。
确定在280nm处每个样品中的纯化的肽通过UV光谱测定法的浓度在比色杯中使用10 -毫米光程使用纳米滴分光光度计用的1.1 0.1％（克/升）溶液的消光系数在280nm处（的Wisniewski等人，2009年）。
干燥该肽样品完全在SpeedVac中在室温下真空浓缩为3 - 6小时。

基于 ZIC-HILIC 的糖肽富集
制备ZIC-HILIC微柱如所描述的（马等人，2015年。）通过添加的浆料ZIC-HILIC树脂（10毫克）在100μl乙腈（ACN）至200 -微升提示封孔用3M TM EMPORE TM C8萃取磁盘在每个尖端的底部 (图 2A)。
使用3 -毫升注射器以产生尖端内背压（图2B）。小号低向下推动柱塞，以允许溶剂通过流ZIC-HILIC而不引起树脂压缩列。

图 2. ZIC-HILIC微柱。一个。ZIC-HILIC在微柱200 -微升尖端插入用3M TM EMPORE TM C8萃取磁盘。乙。使用 3 - ml 注射器帮助流过ZIC-HILIC柱。

平衡的ZIC-HILIC通过添加微柱100 μ升结合缓冲液[80％ACN和5％甲酸酸（FA）] ，缓慢推溶液向下使用一个3 -毫升注射器如步骤B2中所述。
重新构建干肽200（每个样品100种微克肽）μ升结合缓冲液。
将重组肽样品加载到预先平衡的ZIC-HILIC微柱上。慢慢推溶液向下使用一个3 -毫升注射器如步骤B2中所述。D放弃流通。
用 100 µl 结合缓冲液清洗每个ZIC-HILIC微柱五次，使用注射器将溶液缓慢向下推，如步骤 B2 中所述。D放弃流通。
添加80μl的洗脱缓冲液（99.5％H 2 O和0.5％FA）到所述ZIC-HILIC微柱，并且慢慢地压低使用注射器洗脱结合的糖肽为1.5 -毫升管。重复此步骤3 次并在同一管中收集洗脱液。
ð RY的糖肽样品完全在SpeedVac中在室温下浓缩为3 - 6小时。

18 O-标记体内N-糖基化位点
重新构建干燥在50糖肽μ升的50mM NH 4 HCO 3用H制备2 18 O.
添加0.5 μ升（250个单位）PNG酶F到每个样品管和孵化在一个水浴在37℃下过夜，以使18的天冬酰胺残基的O形标记在体内N-糖基化位点如所描述的在（库斯特和Mann， 1999) 。
脱盐18 O形标记的肽用样品的自填充C18 ZipTips或皮尔斯TM C18提示以下的制造ř的协议。
d RY的18 O形标记的肽样品完全在SpeedVac中在室温下浓缩为3 - 6小时。

LC-MS/MS 分析18 个O 标记的含 N-糖苷点的肽
重新构建干18 O形标记的肽（2 μ克每样品）在5 μ升0.1％fomic酸（FA）。
如Zhang等人所述，分离每个样品的肽。( 2018)通过在EASY-Spray PepMap C18 色谱柱上进行在线反相-HPLC 分馏，使用 240 分钟梯度，从 2% 到 50% 溶剂 B，流速为 300 n l /min（流动相 A，1.95% ACN，97.95% H 2 O，0.1% FA；流动相 B，79.95% ACN，19.95% H 2 O，0.1% FA）。
按照Zhang等人的描述进行质谱分析。( 2018 ) 在 Orbitrap 中使用全 MS 扫描（m/z 范围，375 - 1600；自动增益控制目标，1,000,000 个离子；400 m/z 处的分辨率，60,000；最大离子累积时间，50 ms）进行数据相关采集质量分析仪。十个最强离子在每个全扫描是通过碰撞诱导解离与分段一在LTQ质谱仪100毫秒最大值离子累积时间（自动增益控制的目标值，10,000）来获取MS / MS谱。

数据分析

数据库搜索和孔定量牛逼的N-糖肽丰通货膨胀
分析使用蛋白质组发现者LC-MS / MS原始数据文件，并搜索对数据的人的UniProt TrEMBL的数据库（2016_02推出，20198个审查条目）加上所述牛 α 2-HS-糖蛋白（胎球蛋白）。
执行该数据库搜索使用以下参数：20-ppm的前体离子质量公差; 0.5-Da 碎片离子质量耐受性；胰蛋白酶消化，最多有两个缺失的裂解；固定修饰：半胱氨酸氨基甲酰甲基化（+57.0215 Da）；可变修饰：H 2 18 O 中的天冬酰胺脱酰胺（Asn 的18 O 标签，+2.9890 Da）、天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺（+0.9840 Da）、甲硫氨酸氧化（+15.9949 Da）和 N 端乙酰化（+42.0106 Da） . 将错误发现率 (FDR) 设置为 1%。
选择和接受与所述肽的18的N-糖基化序列子内O形标记的天冬酰胺残NXS | T | C（X≠P）作为体内N- glycosite -含有肽（称为n-糖肽）。
执行的定量分析的N-糖肽使用蛋白质组发现者到孔定量丰度泰特的峰面积（即每个中，曲线下面积）18 O形标记的含有N- glycosite肽。
通过归一化确定归一化的N-糖肽丰度的峰面积每18 O-标记的含N glycosite肽到的相应的峰面积的18 O形标记的内标的N-糖肽KLCPDCPLLAPLN（18 O）DSR从掺料衍生- 每个样品中的牛胎球蛋白蛋白。

N-糖肽丰度的差异分析
由于q的限制的定量的N-二glycoproteomics是糖肽标识或丰度值可以缺少从一些样品（Karpievitch等人，2012），只有N-二糖肽与有效丰度值检测 ≥疾病或对照样品的50％被包括在所述差分分析。
执行的N-糖肽丰度的差异分析Microsoft Excel中使用的非配对吨-试验为比较归一化的N-糖肽丰度值每个18 O形标记的含N glycosite-与对照样品中的那些值疾病样品中的肽。
鉴定的N-糖肽与显著改变，归一化的N-糖肽丰度在疾病状态使用±相对于对照组（1.3倍的变化的阈值，即，疾病/控制比> 1.3或<0.77）和P <0.05。
产生一个使用Graph火山图P广告棱镜以可视化的结果的的N-糖肽丰度的差异分析（例如，图2A中张等人，2020 ）。

我ntegrative N- glycoproteomic小号和蛋白质组学小号N-糖基化位点占据的分析
执行I由N glycoproteome数据与所述比较ntegrative分析从MEAS的相同样品的蛋白质组数据使用ured的对同一仪器LC-MS / MS分析。
分析通过执行蛋白质组数据所描述的差异表达分析在（张等人，2018）来鉴定蛋白质与显著改变归一化的蛋白质丰度在疾病状态使用±比对照组和1.3倍的变化的阈值P <0.05 .
确定疾病与对照中每个 N-糖基化位点的 N-糖基化位点占有率的倍数变化，即含N-糖基点的肽的标准化N-糖肽丰度的倍数变化除以标准化蛋白质丰度的倍数变化相应的糖蛋白。
鉴定的N- glycosites与改变的N-糖基化位点占据在使用疾病状态±1.3倍的变化的阈值在疾病相对于对照在N-糖基化位点占据。
对n N-糖基化位点是否仅在疾病或对照样品中占据进行定性评估，以识别在疾病状态下 N-糖基化完全丧失或获得的 N-糖基化位点。

鉴定差异N-糖基化蛋白和失调的N-糖基化影响过程
将疾病中的差异 N-糖基化蛋白识别为包含体内N-糖基化位点的 N-糖蛋白，其N-糖基化位点占有率发生变化和/或在疾病状态下 N-糖基化完全丧失或获得。
将疾病中的高糖基化蛋白定义为包含N-糖基化位点的 N-糖蛋白，其N-糖基化位点占有率增加和/或在疾病状态下获得 N-糖基化。
将疾病中的低糖基化蛋白定义为包含N-糖基化位点的 N-糖蛋白，在疾病状态下 N-糖基化位点占有率降低和/或 N-糖基化完全丧失。
将异常 N-糖基化蛋白定义为包含高糖基化和低糖基化N-糖位点的N-糖蛋白。
进行基因Ó的所生成的数据集的ntology（GO）富集分析差异N-糖基化的蛋白质使用的MetaCore的生物信息学软件如所描述的在张等人。( 2020)揭示疾病状态下受d N-糖基化影响的生物过程失调。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院 (NIH)赠款 RF1 AG057965（到 LL）和R56 AG059714 （到 LSC）的支持。该协议改编自我们最近发表的研究论文( DOI: 10.1126/sciadv.abc5802) 。在埃默里中心神经退化性疾病脑库是由美国国立卫生研究院资助P50 AG025688和P30 NS055077的部分资助。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

伦理

与这项工作相关的研究是根据 NIH涉及人体组织的研究指南以及赫尔辛基宣言的道德标准和原则进行的。人死后脑组织从获得的埃默里中心神经退化性疾病脑库，及脑组织被收购与机构审查委员会（IRB）从主题或批准和知情同意IR系列。

参考

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