材料和试剂

1.无核酸酶2毫升管（WATSON，目录号：132-620C）

2. 无核酸酶 PCR 管（任何品牌）

3. 无核酸酶 1.7 毫升试管（任何品牌）

4. 无核酸酶 15 毫升试管（任何品牌）

5. 无核酸酶移液器吸头（任何品牌）

6.封口膜

7. 384 孔微孔板（Greiner Bio-One，目录号：781801）

8. [用于分析荧光蛋白] 96孔黑板（Corning，目录号：3915）

9. 无核酸酶水（Sigma-Aldrich，目录号：W4502 或同等产品）

10.线性双链DNA编码的感兴趣的蛋白质。5 ' UTR 序列应该是 G AT TTA GGT GAC ACT ATA GAA CTC ACC TAT CTC CCC AAC ACC TAA TAA CAT TCA ATC ACT CTT TCC ACT AAC CAC CTA TCT ACA TCA CCA A GA TAT CAC TAG T（SP6 启动子有下划线；一个名为 E01 的翻译增强子序列用斜体表示；Kamura等人，2005）。尽管任何 3 ' UTR 序列都是允许的，但其长度应大于 1 , 200 nt (Ogawa et al. , 2014)。储存在- 20 °C 直至使用。请参阅以下试剂盒的说明以制备 DNA。

11. SP6-Scribe Standard RNA IVT Kit（CellScript ，目录号：C-AS3106）

12. QIAquick Nucleotide Removal Kit（QIAGEN，目录号：28304）或RNeasy MinElute Cleanup Kit（QIAGEN，目录号：74204）

13. WEPRO1240（CellFree Sciences，目录号：CFS-WGE-1240）。分成较小的体积并储存在-80 °C

14.无核酸酶蔗糖（FUJIFILM Wako，目录号：198-13525）

15. Asolectin （FUJIFILM Wako，目录号：390-00271）。用封口膜密封容器并在 4 °C 下储存，远离湿气

16.用于分子生物学的矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）

17.肌酸激酶（Roche，目录号：10127566001）

18. SUB-AMIX（CellFree Sciences，目录号：CFS-SUB）：一种反应缓冲液，含有氨基酸和能源等翻译底物混合物

19.肌酸激酶溶液（见食谱）

20. SUB-AMIX 解决方案（见食谱）

21.翻译溶液（十二SGUVs与2.5体积μ升）（见ř ecipes）

设备

微量移液器（任何品牌）
培养箱（22 °C，任何品牌）
冰箱（4 °C，任何品牌）
冰柜（-80 °C 和-20 °C，任何品牌）
数字秤（任何品牌）
涡流（任何品牌）
UV / VIS酶标仪（赛默飞世尔科技，型号：Multiskan GO）或能够RNA孔定量的另一种仪器吨通货膨胀
[用于分析荧光蛋白] 荧光读板机（PerkinElmer，型号：ARVO X2）
[用于分析荧光蛋白] 带有合适滤光片的蓝光 LED 光源（OptoCode ，型号：LEDB-MBOXH 或 ATTO，型号：Visirays -B）

程序

注意：以下协议用于准备十二个 SGUV。该过程的示意图如图 1 所示。

グラフ自动的に生成された说明

图 1. SGUV 制备过程示意图。详细步骤请参考以下协议。经高桥和小川( 2020 )许可改编。版权所有 2020 美国化学学会。

制备的mRNA模板
转录编码双链DNA的感兴趣的蛋白质（在这里，我们使用DNA编码黄色荧光蛋白，YPet ，作为一个例子; Nguyen和多尔蒂，2005）。具体而言，在37录制℃下超过2小时（优选过夜）在PCR管含有20 μ升反应溶液，根据制造商的方案使用SP6-抄写标准RNA IVT工具包。
通过加入1消化DNA μ升包括在试剂盒DNA酶I并在37温育℃下15分钟。
根据每个制造商的协议，使用QIAquick Nucleotide Removal Kit 或 RNeasy MinElute Cleanup Kit纯化转录本（即mRNA）。
注意：洗脱的mRNA从QIA快速核苷酸去除试剂盒或RNeasy试剂的MinElute纯化试剂盒用30 μ升或14 μ升无核酸酶水，分别。

稀1 μ升纯化的mRNA与99 μ升无核酸酶水和孔定量泰特稀释的mRNA在384孔板通过测量在与UV / VIS酶标仪260nm处吸光度。
注意：可替换地，其它常用的光谱或荧光方法Ç一个用于孔定量泰特的mRNA的表达。

稀释纯化的mRNA（来自步骤阿3）与不含核酸酶的水至1.5 μ中号。
将其分成较小的体积并储存在-80 °C 直至使用。

制备的油相，0.5 ％w / v的asolectin在矿物油中
在室温下加热asolectin容器15 分钟。
1.0毫升矿物油添加到20mg asolectin在一个1.7 -毫升管。
用封口膜密封管子。
涡旋混合物以完全溶解所述asolectin到一个2 ％w / v的溶液。
注意：体积变化可以忽略不计。

混合800 μ升2 ％w / v的asolectin 2.4毫升矿物油在15 -毫升管以制备3.2毫升0.5 ％w / v的asolectin 。
注意：在程序D 中尽快使用 0.5 % w/v asolectin 。不要储存。

制备的水相，0.5 × SUB-AMIX
混合25 μ升5 × SUB-AMIX和225 μ升无核酸酶的水在每个12支2 -毫升管，以制备0.5 × SUB-AMIX 。

分层的油相到所述水相
层250 μ升0.5 ％w / v的asolectin （在制备过程B）轻轻到250 μ升0.5 × SUB-AMIX在每个2 - ml管（在制备过程C）。
用封口膜密封管子。
将管子在 22 °c 下在孵化器中孵化 3 天, 在油/水界面形成脂质单层膜。

的制备的更致密的水相，1.7 × SUB-AMIX含有3.5 ％w / v蔗糖
将5-克蔗糖到约7毫升的无核酸酶的水在15 -毫升管。
注意：通过将蔗糖溶解在水中，体积会发生显着变化。

使用以下公式称量总体积和 1 ml 蔗糖溶液，以计算% w/v 浓度：% w/v =（5/总体积的重量）×1 ml × 100 的重量。
用无核酸酶的水将蔗糖溶液稀释到 43.6 % w/v。
添加173 μ升43.6 ％w / v蔗糖和730 μ升5 × SUB-AMIX至1 ，232 μ升不含核酸酶的水，以制备2 ，135 μ升1.7 × SUB-AMIX含有3.5 ％w / v蔗糖。

在水相下分层较密的水相
吸移管175 μ升1.7 × SUB-AMIX含有3.5 ％w / v的蔗糖（在制备过程E）慢慢地向每个2的底部- ml管（在制备过程d）; 见图 1。
笔记：

尽可能不要干扰油/水界面处的脂质膜。
密度较大的水相是用于预防脂质体小号（SGUV小号从由底部接触破裂）的管的和平衡的脂质体的内侧和外侧之间的渗透压小号完全扩散到水相中后。
在同一孵化器中在 22 °C 下孵育管子90 分钟。

SGUV形成
准备一个不含细胞的翻译溶液，含有大约。冰上1.5 % w/v 蔗糖（见配方）。
添加翻译溶液的等分试样（2.0 - 45.0 μ升）附近的油相的各2的中心- 90分钟温育后立即毫升管程序˚F ; 见图 1。
注：虽然SGUVs的各种尺寸可以在此体积范围内，准备在类似的成功率，我们建议2.5 μ升，一审。

在同一孵化器中在 22 °C 下孵化管子,并观察相转移。一个不完整的2.5的代表性图像μ相转移期间升SGUV并将所得完整2.5 μ升SGUV分别示于图2A和2B。
注意：包含翻译溶液的液滴需要几分钟才能通过油/水界面转移并形成 SGUV。体积越大，传输速度越快。生成的 SGUV 通常稳定超过 60 分钟。

グラフィカルユーザーインターフェイス, アプリケーション自动的に生成された说明

图 2. SGUV 形成的代表性图像。A. 相转移期间不完整的 2.5-μl SGUV。B. 生成的完整 2.5-μl SGUV。箭头表示 SGUV。比例尺s ：2.5 毫米。经高桥和小川( 2020 )许可改编。版权所有 2020 美国化学学会。

表达的蛋白质的检测SGUV小号（在的情况下，荧光蛋白如YPet ）
使用带有适当过滤器的蓝色LED 光源观察 SGUV 中的荧光。图 3 显示了 mRNA 封装和不含 mRNA 的 SGUVs 的代表性图像。

グラフィカルユーザーインターフェイス中程度の精确で自动的に生成された说明

图 3.在内部带有和不带有编码YPet mRNA 的 SGUV 的代表性图像。向油相中添加液滴后 90 分钟，封装 mRNA 的 SGUV (A) 和不含 mRNA 的 SGUV (B) 的可见光（左）和荧光（右）图像。箭头表示 SGUV。比例尺s ：2.5 毫米。经高桥和小川( 2020 )许可改编。版权所有 2020 美国化学学会。

要精确测量荧光强度，请使用以下协议。
转移50 μ升（或多个较大SGUV小号）包含整个SGUV到1.7水相-毫升管。
注：使用枪头切干净的剪刀比更大的SGUV小号。

通过涡流爆破 SGUV 。
传输等分试样（例如，45 μ升）到96孔黑色板。
在荧光板阅读器中使用适当的激发/发射波长（例如485/535 nm）和曝光时间（例如1 秒）测量荧光强度。

食谱

肌酸激酶溶液
溶解在无核酸酶的水，使2毫克/毫升溶液，分成更小的体积，并储存在-80 ℃。

SUB-AMIX 解决方案
由于SUB-AMIX 由每种浓度为 40 倍的四种试剂组成（S-1、S-2、S-3、S-4），因此通过添加 1 ml 每种 S-1 来制备 8 ml 5 × SUB-AMIX通过 S-4 到 4 ml 无核酸酶水，分成较小的体积，并在-80 °C 下储存。

注意：不要先混合四种试剂。

平移解决方案（用于十二个体积为 2.5 μ l 的SGUV ）
6.0 μ升WEPRO1240 ; 0.6 μ l 2 mg/ml 肌酸激酶；6.0 μ l 5 × S UB-AMIX；11.4 μ l 3.8 % w/v 蔗糖；6.0 μ l 1.5 μ M mRNA（在程序 A 中制备）或无核酸酶水（用于阴性对照）

笔记：

通过稀释在程序 E3 中制备的43.6 % w/v 蔗糖制备3.8 % w/v 蔗糖。
对于更大的 SGUV，以相等的比例增加每个体积。

致谢

这项工作得到了 JSPS KAKENHI 授权号 JP19K05697 的部分支持。

利益争夺

作者声称没有财务或非财务竞争利益。

参考

Elani , Y.、Law、RV 和Ces , O. (2015)。人工细胞中的蛋白质合成：在囊泡生物反应器中使用分区进行空间组织。物理化学化学物理17(24): 15534 - 15537。
Hamada, T.、Miura, Y.、Komatsu, Y.、Kishimoto , Y.、Vestergaard, M. 和 Takagi, M. (2008)。从脂质包覆的油包水微滴构建不对称细胞大小的脂质囊泡。J Phys Chem B 112(47): 14678 - 14681。
Hodgman, CE 和 Jewett, MC (2012)。无细胞合成生物学：在细胞外思考。代谢工程14 （3）：261 - 269。
Kai, L. 和Schwille , P.（2019 年）。无细胞蛋白质合成及其自下而上组装细胞的前景。Adv Biosys 3 (6)：1800322。
Kamura , N.、Sawasaki , T.、Kasahara, Y.、Takai , K. 和 Endo, Y. (2005)。在小麦胚的无细胞蛋白质合成系统中选择 5 ' -非翻译序列，以增强翻译起始。Bioorg Med Chem Lett 15 (24): 5402-5406。
Kubatta , EA 和Rehage , H. (2009)。通过相转移过程形成的巨型囊泡的表征。胶体高分子科学287(9): 1117 - 1122。
Lentini , R.、Yeh Martín, N. 和Mansy , SS (2016)。交流人工细胞。CURR OPIN化学生物学杂志34 ：53 - 61。
Madono , M.、Sawasaki , T.、Morishita , R. 和 Endo, Y. (2011)。用于后基因组研究的小麦胚芽无细胞蛋白质生产系统。新生物技术28(3): 211 - 217。
Nguyen, AW 和 Daugherty, PS (2005)。细胞内 FRET 荧光蛋白的进化优化。Nat Biotechnol 23(3), 355-360。
Noireaux , V. 和Libchaber , A. (2004)。囊泡生物反应器作为迈向人工细胞组装的一步。Proc Natl Acad Sci USA 101 (51): 17669 - 17674。
Ogawa, A.、Tabuchi , J. 和 Doi, Y.（2014 年）。鉴定足以增强高质量小麦胚芽提取物中翻译的短非翻译区域。Bioorg Med Chem Lett 24 (16): 3724 - 3727。
Pautot , S.、Frisken , BJ 和 Weitz, DA (2003)。使用倒置乳液生产单层囊泡。朗缪尔19(7): 2870 - 2879。
Takahashi, H. 和 Ogawa, A.（2020 年）。毫米大小的超巨脂质体的制备，允许通过自发乳液转移在内部进行有效的真核无细胞翻译。ACS 合成生物学9(7)：1608-1614。
Walde , P.、Cosentino , K.、Engel, H. 和Stano , P. (2010)。巨囊泡：制剂和应用。ChemBioChem 11 (7): 848 - 865。