材料和试剂

移液管尖端，20微升，200微升，和1 ，000微升（吉尔森，目录号：F161671，F1739311，和F161451，分别地）
0.2微米注射器式过滤器
带盖锥形管，50毫升（SPL Life Sciences，目录号：50050）
200 µl微量管和1.5 ml微量管（Sigma-Aldrich，目录号：Z374873； Eppendorf，目录号：EP0030125150）
注射器用消毒针，17号（韩国疫苗）
无菌注射器过滤器（Sartorius，货号：17764-ACK）
普通消毒注射器，1毫升和50毫升（韩国疫苗）
小鼠（6周龄研究所癌症研究，体重25 - 35克; Koatec有限公司平泽，韩国）
杨梅素（Sigma-Aldrich，目录号：M6760）
三硬脂酸甘油酯（Sigma-Aldrich，目录号：T5016）
甘油三辛酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：T9126）
Brij S100（Sigma-Aldrich，目录号：466387）
Pluronic P-123（Sigma-Aldrich，目录号：435465）
盐酸毛果芸香碱（毛果芸香碱）（东京化学工业，目录号：P0434）
溴乙酸格隆溴铵（东京工业化学，目录号：G0392）
Neuronox 100U（A型肉毒神经毒素，BoNT / A）（Medytox ）
Alfaxalone溶液，10 mg · ml -1 （Alfaxan ）（Alfaxan Multidose，Jurox动物保健）
盐酸赛拉嗪溶液，23.32 mg · ml -1 （Rumpun ，Bayer）
淀粉（Millipore，目录号：101252）
蓖麻油（Sigma-Aldrich，目录号：259853）
碘（Sigma-Aldrich，目录号：207772）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：02891）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
HyClone磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4（PBS）（GE Healthcare，目录号：SH30256.01）
Rumpun解决方案（请参阅食谱）
麻醉溶液（请参阅食谱）
毛果芸香碱溶液（请参阅食谱）
格隆溴铵溶液（请参阅配方）
杨梅素溶液（请参阅食谱）
装有杨梅素的脂质纳米颗粒（M-LNP）（请参阅食谱）
淀粉解决方案（请参阅食谱）
碘溶液（请参阅食谱）

设备

吸管小号（20，200，和1000微升）（吉尔森，目录号：FA10003M，FA10005M，和FA10006M，分别地）
电动咽
先锋分析天平，容量320克（Ohaus，型号：PX323E）
在麻醉剂注射和完全麻醉之间保持稳定的笼子
在老鼠的后脚掌上涂抹碘和淀粉溶液的画笔
数码相机（佳能，型号：EOS 800D）
通过制备小鼠限制器形成孔我Ñ锥形管和盖使用电动咽的塑料壁（图1）

软件

ImageJ（NIH，http： //rsb.info.nih.gov/ij/ ），用于图像处理和确定出汗面积％
SigmaPlot 10.0 Windows版本（IBM Co.），用于绘制图形
用于统计分析的SPSS Statistics 23.0版软件（IBM Co.）

程序

雄性小鼠（5只小鼠每笼）圈养在温度21±1 ℃，和一个55±10％的控制的实验室条件下的湿度和食物和水保持自由采食。在12小时光照周期的光照阶段对小鼠进行了测试（上午6:00点亮，下午6:00熄灭）。

麻醉
癌症研究（ICR）小鼠，体重25六周龄研究所- 35克，自购Koatec有限公司（平泽，韩国）。到任后，小鼠被安置在一个动物设施7天以适应环境。
小鼠瓦特ERE麻醉由麻醉溶液的腹膜内注射（8.5 ml的·千克-1 ;配方2）。用于汗水测定所有程序均在1个小时内终止是前小鼠瓦特Ó柯达。
将小鼠放置于37℃，加热垫在一个空的保持架5分钟而没有任何刺激物（例如，噪声和光）为stabiliz的通货膨胀麻醉。
麻醉小鼠瓦特ERE小心运送到小鼠限制器（设备7 ），并使用螺旋盖覆盖。

药物管理
该药物溶液（毛果芸香碱，格隆溴铵，的BoNT / A，杨梅黄酮，和M-LNP，见配方小号部）瓦特ERE制备，并温热至37℃ ，立即给药之前。如果需要，药物溶液通过一个0.2通过灭菌-微米注射器过滤器在使用前。
管理的药液麻醉稳定后
在后脚掌皮肤上的应用（图1A）
将药物溶液吸移到后足垫皮肤上。采取了预防措施以免过度使用该溶液。
将包含小鼠的限制器放在加热垫上30分钟，以留出足够的时间吸收和作用药物。
皮下注射（图1B）
甲针装有注射器装有药物溶液。小心不要过度注入20内的药液微升，以避免过多的鼓胀的皮肤。
为了除去注射器色谱柱中的空气，在保持注射器针头朝上的同时，对活塞施压。
针缓慢插入右后肢足垫皮肤为接近表面成为可能，同时保持针和皮肤表面之间的大致平行的角度，以避免皮下structur人损伤和出血。使用细针（17号针头）以最大程度地减少对皮肤的伤害，并且每次都使用新鲜的针来防止感染。
钍é药物溶液注入并在取出针。如果使用唾液分泌刺激剂（如盐酸匹洛卡品），可使用抹布消除唾液溢出以防止窒息。
任何溢出都被清除了。
将包含小鼠的限制器放到加热垫上10分钟，以留出足够的时间来使药剂起作用。

图1.麻醉后在汗液测定中施用这些药物。A.程序的药液对皮肤应用的小鼠的右后足垫。B.程序的皮下注射药物溶液进入了小鼠的右后足垫。

我odine -淀粉试验（图2）
后的药物（在施用毛果芸香碱，格隆溴铵，的BoNT / A，杨梅黄酮，和M-LNP ），其余的的溶液擦去足垫皮肤，皮肤用温暖PBS，并在液体再擦去。
使用画笔，碘溶液施加到两个所述左，右后足垫并使其干燥1分钟。所使用的画笔比后脚垫的水平宽度宽，从而可以立即绘制足够的碘溶液。另外，在使用前将画笔浸入碘溶液中，以避免乙醇干燥导致形成碘晶体。为了避免与碘晶体斑点，这可以影响的值的形成的结果ING汗水荷兰国际集团面积％，应用程序是只进行一次。
为了阻止汗液从皮肤表面蒸发，通过在37°C的刷子刷洗一次，将淀粉-油溶液的涂层涂在脚垫皮肤上。此步骤使用了另一种画笔。为了避免在施用过程中淀粉聚集，搅拌淀粉溶液。
用淀粉溶液涂布后，立即在固定的距离，放大倍率和曝光条件下获取后脚垫的照片。淀粉覆盖的后脚掌在大气中暴露超过5分钟可能会由于水分而影响不必要的颜色变化；吨HUS，我们建议5分钟作为用于确定出汗面积（％）的时间限制。
描述的测试：Ť他碘在乙醇溶液首先施加在足垫皮肤，然后蒸发乙醇1分钟。接下来，将油包淀粉溶液涂在覆盖有碘的脚垫皮肤上。汗水被捕获之间的皮肤和油层，因为湿气不能透过扩散出来的疏水油层。反过来，溶解到所捕获的汗水化妆š的褐色碘与淀粉反应并变成一个蓝黑色颜色作为结果电离到多碘离子。此外，淀粉在淀粉溶液和碘溶液浓度和碘，分别是足够高到引起如果蓝黑颜色变化的小鼠汗水。
注意：每个解决方案应用程序的数量比数量更重要。因此，色彩可以由每个序列申请改为蓝黑色的ication碘和淀粉溶液只有一次，没有任何风险缺乏颜色变化。

图2.汗液分析中的碘-tarch试验。一。测试程序。B.测试的预期机制的图示。

数据分析

图像处理和出汗面积％测定
区域选择（图3A）：在ImageJ中分别处理了小鼠后脚掌皮肤的图像，仅裁剪了脚掌区域。
修改所述图像（图3A）：“图像>类型> RGB栈”，将裁剪的实际彩色图像的足垫皮肤区域被转换成克一个yscale。
自动局部阈值（图3B）：在GR一个蓝色叠层的yscale图像通过调整选择“图像>调整>汽车局部阈值”使用Phansalkar方法。半径：15；参数1和2：0；选中“黑色背景上的白色物体”；取消选中“堆栈” 。调整后的图像中的黑色像素表示后脚掌皮肤上的出汗点。如图3C所示，该Phansalkar方法是选择出汗斑点的最佳方式中的所有可用的自动局部阈值的模块。
注意：不要触摸任何初始设置小号的自动局部阈值除Phansalkar方法选择。

出汗面积百分比的确定（图3D）：通过选择“分析>设置测量值”并在测量前检查“面积分数”来设置测量值。黑色像素的调整后的图像面积率的值分别为米通过按按“Ctrl + M”键的键盘上或点击“分析>测量easured并记录。通过从100％中减去面积分数来计算出汗面积％。

图3.基于ImageJ的图像处理和出汗面积％的测量。A.区域选择所获得的图像在小鼠足垫皮肤和转换所选图像的成克的一个使用RGB堆yscale（红色，绿色，和蓝色的堆叠蓝色栈）。B.蓝色基于堆栈的GR的调整一个yscale使用自动局部阈值，图像根据所述Phansalkar方法，用于提取出汗区域。C.使用“自动局部阈值”的所有模块（包括Bernsen，Contrast，Mean，Median，MidGrey ，Niblack ，Otsu，Phansalkar和Sauvola方法）调整后的图像。D.建立用于确定出汗面积％值的面积分数的测量方法。

评估图像处理的可靠性
各组的所有出汗面积％值确定从所述后在不同的预定时间获得的足垫皮肤图像（0，1，2，3，4，和5分钟）碘-淀粉使用ImageJ（图4A和4B）测试。所述图像处理用于确定每个组的出汗面积％值的可靠性进行评估使用的决定系数（- [R 2的线性拟合曲线的），如图4C所示。可靠的数据：- [R 2 ≥ 0.9; 数据不可靠：R 2 <0.9。在确定特定组的出汗面积％值时，将不可靠的数据集排除在外。

图4.确定出汗面积％的图像处理程序的可靠性评估。A.在开始进行碘-淀粉测试后5分钟内未使用任何药物（未治疗）的右后足垫皮肤的代表性图像处理程序。B.在代表性图像处理的程序之后的0、1、2、3、4和5分钟确定面积分数值（％Area）。C.非治疗组，阴性对照组（毛果芸香碱）和阳性对照组（甘草次酸盐）的出汗面积％值的线性拟合曲线。数据表示为平均值±SD（标准偏差；n = 5）。

统计分析并绘制出汗面积的图表％
来自汗液测定法的所有数据均报告为至少五个独立小鼠实验的平均值和标准偏差（SD）。使用带有SPSS Statistics的Student t检验进行统计分析。使用SigmaPlot 10.0生成包括每个小鼠组出汗面积％值的平均值和SD的条形图（图5）。

图5.碘-淀粉测试后5分钟，小鼠后足垫皮肤的代表性出汗面积％值。上出汗面积％的值（黑象素部分的面积％）（A）右后肢足垫，直接进行处理（由任一皮下注入离子或施加在皮肤上），和（B）左后肢足垫，没有吨用药物处理。组：不治疗，PBS（0.8 ml ·kg -1 ），盐酸匹洛卡品（2.5 mg ·kg -1 ，阴性对照），格隆溴铵溴化物（0.25 mg ·kg -1 ，阳性对照），BoNT / A（0.8 U ·kg -1 ，阳性对照），杨梅素（M； 0.8 mg ·kg -1 ）和M-LNP（杨梅素负载的脂质纳米颗粒； 0.8 ml ·kg -1 ）。数据表示为平均值±SD（n = 5； Student's t检验； ns，无显着性； *，P <0.05； **，P <0.01）。

药物对局部止汗作用的评估
出汗面积％值左后肢足垫，向其中不施用药物，被表示为单独的图形，以评估循环系统的系统或局部效力的药物。此处，右脚垫和左脚垫上的出汗面积％减少表明该药物的循环系统抗汗功效，而仅右脚垫上的汗液面积％表明局部功效。

菜谱

Rumpun解决方案
用PBS稀释的Rumpun （盐酸赛拉嗪23.32 mg · ml -1 ）稀释至20 mg · ml -1赛拉嗪盐酸盐

麻醉液
体积比为16：1的Alfaxan和Rumpun溶液的混合物

毛果芸香碱溶液
PBS将盐酸匹罗卡品稀释至3.125 mg· ml -1

格隆溴铵溶液
用PBS稀释的溴化格隆溴铵至312.5μg· ml -1

杨梅素溶液
给药前立即用PBS将5％（w / v）的杨梅素溶液（在DMSO中）稀释至1 mg· ml -1 ，以防止形成晶体

杨梅素脂质脂质纳米粒（M-LNPs）
用我们小组先前报道的方法制备的M-LNPs （Ban et al。，2020）; M-LNP系统中杨梅素的浓度：1 mg ·ml -1

淀粉溶液
10％（w / v）淀粉分散在蓖麻油中并在使用前立即涡旋以防止沉淀

碘溶液
溶于乙醇的3.5％（w / v）碘

致谢

这项工作是由韩国国家研究基金会（NRF）的支持授予由韩国政府（MSIT）（第2020R1A2C2101964，2017R1A6A1A03015642资助，并2018R1D1A1B07050508）。该协议源自（Ban et al。，2020）。

利益争夺

没有要宣布的利益冲突。

伦理

这项研究是经Ë thics Ç韩国成均馆大学（批准文号SKKUIACUC2018-04-11-2）的ommittee。这项研究中包括的所有小鼠均被安置在成均馆大学的设施中，所有实验方案均已得到成均馆大学动物保护和使用委员会的批准。

参考

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